Os autores agradecem o apoio da Sra Sharon Spana no monitoramento roedor, manipulação e experimentação. PhD apoio financeiro foi fornecido pela Universidade de Sydney e do Centro Australiano de Investigação de Excelência em Vision.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney. 1. Os eléctrodos Factura <ol><li> Construir o eléctrodo positivo (o qual entrará em contacto com a córnea) a partir de uma (5 cm) de comprimento curto de fio de platina de 1-2 mm de diâmetro. Moldá-lo em um loop de alguns mm de diâmetro. Conecte-se este ciclo com uma vantagem convencional, o tempo suficiente para chegar à fase de entrada do seu amplificador (ver Figura 4). </li><li> Construir o eléctrodo negativo (o que vai na boca do animal), utilizando um de Ag / AgCl sedimentar 1-2 mm de diâmetro, também ligada a uma guia convenção (ver Figura 4). </li><li> Como um eletrodo de referência (que entrará em garupa do animal), use uma agulha hipodérmica limpo (23 G), também ligado a uma vantagem de comprimento adequado (consulte a Figura 4). </li><li> O ideal é usar cabos de três chumbo fornecidos por fabricantes de instrumentos, para conectar os três eletrodos (U positivo94; córnea, negativo → boca, referência → traseiro) para o amplificador. </li></ol> 2. Conexão e Calibração do estímulo luminoso e ERG Set-up <ol><li> Criar (ou localizar) um pequeno laboratório de gravação, o que pode ser feito escuro. Equipar com uma ou ambas de uma luz sobre-o-banco de vermelho ou uma cabeça-lâmpada vermelha. </li><li> Use um luxímetro para confirmar que a luz vermelha iluminância atingir os olhos do rato durante a instalação não exceda 1 lux. Nota: Um filtro de densidade neutro pode ser usado para reduzir o brilho da lâmpada e a fonte de luz da lâmpada deve especificamente emitem luz vermelha. Adaptação das Trevas vai ser comprometida se fontes de luz emitem comprimentos de onda (visíveis) mais baixos. </li><li> Lacrar todos a luz difusa que entra no laboratório de gravação (isso muitas vezes exige persistência com fita opaco) e preparar um filtro de densidade neutra (este pode ser comprado em folhas) grande o suficiente para caber mais, e assim fraca, qualquer tela de computador que você terá na laboratório. Nota: luz e Strayà luz de uma tela são suficientes para prejudicar a adaptação ao escuro do olho de rato. </li><li> Ligue o amplificador para hardware de aquisição de dados. Conecte-se, leads negativos e positivos de referência para o amplificador. Verifique se o computador ea unidade de alimentação Ganzfeld LED estão bem conectados a uma fonte de terra. Nota: Alguns laboratórios têm-se especializado pontos de aterramento, conectado a um terreno de construção; uma tubulação de água é uma alternativa eficaz. </li><li> Calibrar a fonte de luz LED com um radiómetro de investigação de qualidade. Corrigir o sensor do medidor na posição em que o olho do animal será localizado durante uma experiência. </li><li> Programe os LEDs Ganzfeld para executar um protocolo de campo total ERG com aumentos passo a passo em energia flash, duração do flash, flash e repetição tempo entre flashes, denominado intervalo interstimuls (ISI), configurações. Por exemplo um protocolo de campo total ver Tabela 1. Nota: O ERG de campo total flashes aumentará de flashes ofuscantes repetitivas para bdireito pisca em uma forma sábia passo. O programa de flash duplo surge na sequência do protocolo de campo total e permite o isolamento dos bastonetes e cones respostas. </li></ol> 3. Dia Antes do ERG Experimentação <ol><li> Escuro adaptar ratos Sprague-Dawley, durante 12 h antes da gravação. É conveniente fazer isso no laboratório de gravação, uma vez que a luz difusa foi eliminada. </li></ol> 4. Dia do ERG Experimentação <ol><li> Organizar para que o animal delicadamente ser aquecido durante a gravação. Nós usamos uma plataforma de metal leve construído de modo que a cabeça do animal pode descansar no ponto correto no momento da entrada para o Ganzfeld. A plataforma tem embutido tubagem através da qual se bombeia a água pré-aquecida a 40 ° C num banho de água. Nota: A experiência mostra que este mantém a temperatura do núcleo do animal a 37 ° C. </li><li> Pesar o rato sob condições de pouca luz. Peso recorde e make up cetamina correta (60 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) dose. Contenha o rato gently e injetar anestésico por via intraperitoneal. </li><li> Nota momento da injecção. Uma vez que o animal está inconsciente (geralmente dentro de 5 min) verificar profundidade da anestesia levemente beliscar uma almofada do pé, para ver se uma resposta reflexa está presente. É melhor esperar até que esse reflexo é ausente ou fraco, antes de prosseguir. </li><li> Aplicar uma única gota de atropina e outro de proxmethacaine a córnea. </li><li> Corte um comprimento de 10 centímetros da linha preta. Faça um laço com um nó simples e deslizar o laço sobre o equador do olho. Aperte-o ligeiramente; o efeito é chamar o globo ocular ligeiramente para a frente, com o mínimo de pressão. Isso mantém a córnea resulta das pálpebras. </li><li> Aplicar olho carbómero gotas à superfície da córnea. Certifique-se de carbómero permanece sobre a superfície da córnea e não derramar sobre as pálpebras ou o rosto. </li><li> Coloque roupas de cama absorvente em cima da plataforma aquecida. </li><li> Posição rato na cama, com a cabeça no lugar recomendado na abertura do Ganzfeld. </li><li> Inserir intErnal sonda de temperatura no recto. Sonda de temperatura segura na posição gravando cabo de sonda para a cauda. </li><li> Insira o eletrodo de referência (a agulha 23 G) por via subcutânea na perna de trás, e se conectar ao amplificador. </li><li> Inserir o eléctrodo negativo (o sedimento de Ag / AgCl) de forma segura na boca. Para evitar que isso escorregar para fora da boca, apor o cabo de ligação a uma superfície estável. </li><li> Posicionar o eléctrodo positivo ao longo do centro da córnea. Usando um micromanipulador, garantir que o eletrodo toca a córnea suavemente. </li><li> Verifique a temperatura do corpo é a 37,0-37,5 ° C. </li><li> Uma vez que o animal está devidamente posicionado e eletrodos estão no lugar, armar toda a configuração (Ganzfeld e animal) com um material opaco (para preservar a adaptação ao escuro). Nós usamos um pano preto macio. </li><li> No software de aquisição fixado em uma taxa de amostragem de 2 KHz com um tempo de coleta de 100-1000 ms com 5 ms de amostragem pré-coleção. Defina os filtros passa banda para 1-1,000Hz e garantir que a amostragem é acionado para provar o período de ~ 250 ms após um flash. </li><li> Verifique a linha de base a gravação. Deve ser livre de ruídos estranhos, mas mostrar algum ruído amplificador e uma oscilação respiratória. </li><li> Se a linha de base mostra ruídos estranhos, começar solução de problemas. A maioria dos problemas são relacionados a derrapagem na posição do eletrodo, ou aterramento. Use uma gaiola de Faraday para garantir gravações são livres de ruídos estranhos. </li><li> Executar um flash de teste, 0,4 log scot cd.sm -2. Uma forma de onda ERG semelhante à Figura 2A deve aparecer. Em nossas respostas típicas de laboratório para um flash cd.sm scot 0,4 log -2 são (a onda: -474 ± 39 mV e b-ondas: 1512 ± 160 mV, n = 11). </li><li> Permitir animal escuro re-adaptar para 10 min. É conveniente utilizar estes 10 min para verificar novamente a linha de base. </li><li> Após a confirmação do sinal estável começar a gravar. </li><li> No fim da sessão de gravação, que vá corpo temperature foi mantida. Remover eletrodos. Reaplicar carbï¿½ero polímero de córneas. Permitir que o animal se recuperar em uma almofada de calor até que esteja totalmente móvel e ativo, antes de retornar à habitação animal. </li></ol> 5. A isquemia remoto <ol><li> Execute isquemia remoto em ambos os roedores acordado ou anestesiados. </li><li> Se o animal é anestesiado, colocá-lo em uma plataforma aquecida (acima) e coloque o manguito do esfigmomanômetro sobre a parte superior da traseira-membro, claro do joelho. </li><li> Se os animais estão acostumados a serem tratadas, é possível executar esse procedimento sem anestesia; isto requer duas pessoas. Uma pessoa restringe o animal delicadamente eo segundo aplica-se o manguito do esfigmomanômetro e opera o esfigmomanômetro. </li><li> Para animais acordados, use um pedaço de toalha de ~ 15 centímetros x 30-50 cm para embrulhar cuidadosamente o animal, com um hindlimb livre. Coloque o animal em sua parte traseira em (digamos) o antebraço esquerdo, com a cabeça enfiada entre o braço do suporte e torso, e lugara braçadeira como acabado de descrever. </li><li> Esvaziar a manga e assegurar a válvula de pressão de ar é fechada. Bombear o manguito até 160 mmHg em animais anestesiados, e 180 mmHg em animais acordados. Isso excede a pressão sistólica (geralmente 140 mmHg e 160 mmHg, respectivamente). </li><li> Manter essas pressões, conforme necessário, usando a bomba de mão. </li><li> Após o tempo previsto para a isquemia (nós usamos dois períodos de 5 min separados por 5 min de reperfusão), esvazie a pressão do balonete, desapertando a válvula de pressão de ar. </li><li> Confirmar o efeito de isquemia remoto com uma sonda de temperatura ligada a pele da pata. A temperatura da pele cai tipicamente 32-30 ° C, durante 5 minutos e recupera por reperfusão. </li></ol> 6. Danos Luz <ol><li> Certifique-se de que os ratos estão em uma noite de adaptação ao escuro, antes do procedimento danos leves. </li><li> No momento adequado seguinte isquemia (em nossos experimentos sem atraso), cada animal é colocado isoladamente em um caixas de acrílico, with água e alimentos em recipientes à base de chão. Nota: O dano induzido por luz só pode ser realizado em animais albinos. </li><li> Ligue uma luz branca pré-calibrado 1.000 lux em um horário padrão (geralmente 09:00) e manter esta condição durante 24 horas. </li></ol> 7. ERG Extração de Dados e Análise <ol><li> Adquirir formas de onda médios do ERG. Se necessário, corrigir para uma linha de base diferente de zero, por subtracção. </li><li> Medir a amplitude da onda-um (apresentada em meados de altas intensidades de estímulo), como a diferença de tensão entre a linha de base e a primeira (&lt;30 ms latência) da calha (Figura 1). </li><li> Medir a amplitude da onda b como a diferença de tensão entre o pico da onda e um-a positiva da onda seguinte, que ocorre tipicamente a uma latência de 80-100 mseg (Figura 1). </li><li> Isolar potenciais oscilatórios usando uma transformada de Fourier para filtrar dados 60-235 Hz, com uma banda de transição 90 Hz <sup&gt; 7. Se necessário, o sinal de potencial oscilatório isolado pode então ser subtraída da forma de onda não filtrada para confirmar a identidade da calha de uma onda. </li><li> O tempo implícita (latência) dos a- e b-picos de onda também pode ser uma medida útil (Figura 1). Use os flashes individuais para isolar a resposta rod. Subtrair a resposta de cones (flash 2) a partir da resposta mista (flash 1) para isolar a resposta da haste (Figura 2). </li><li> Normalizar a intensidade da luz indivíduo uma onda e amplitudes da onda-b (pós-tratamento / pós-tratamento-base) ou a média para os grupos de tratamento. Curvas intensidade-resposta traçar as amplitudes de grupo e erro contra energia flash. </li></ol>

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Jonathan Stone é o diretor do CSCM Pty Ltd

O flash método ERG de adaptação ao escuro descrito acima é um método confiável para avaliar a função da retina em ratos. Tanto a uma onda e onda-b foram reduzidas em danos leves. Remoto pré-condicionamento isquêmico mitigado reduções de luz induzida por danos no um-ondas e b-ondas. Esta preservação da função da retina sugere que o pré-condicionamento isquêmico remoto tem induzido neuroproteção, assemelhando-se outras formas de pré-condicionamento de proteção, tais como hipóxia, isquemia e exercí...

O ERG é um potencial eléctrico gerado pela retina em resposta a luz, e gravado a partir da superfície da córnea do olho. Quando as condições de gravação são geridos com cuidado, o ERG pode ser usada em uma variedade de maneiras de avaliar a função da retina. Aqui descrevemos como para gravar o &#39;flash ERG&#39;, o potencial gerado quando a retina é exposto a um breve flash, brilhante apresentada em um fundo Ganzfeld. O Ganzfeld dispersa a luz homogeneamente eo flash de luz atinge toda a retina aproximadamente uniformemente. Se a retina está adaptado escuro antes de gravar, e o de adaptação ao escuro é mantida como o animal é preparado para a gravação, o ERG obtido é gerado por ambos os bastonetes e cones fotorreceptores. O flash ERG adaptação ao escuro tem uma forma de onda característica, que foi analisada em duas maneiras. Em primeiro lugar, precoce e tardio componentes da forma de onda do ERG foram distinguidos, e relacionados com a sequência de neurónioactivação ai na retina. O primeiro componente é um de curta latência negativo ido potencial, a uma onda (Figura 1). Isto é seguido por um potencial positivo Ir, chamado a onda b. A fase ascendente da onda b mostra oscilações, que são considerados um componente separado (potenciais oscilatórios ou PO). A onda um é considerado ser gerado por fotorreceptores, o b-ondas por células da camada nuclear interna, e as células PO por amacrine 1. Com base na força do estímulo, as respostas a pisca muito fraca denominado o limiar de resposta escotópica são possíveis. O limiar de resposta escotópica é entendida para ser gerada a partir das células ganglionares da retina 2-4. Em segundo lugar, o flash ERG podem ser separados por adaptação à luz, ou por um protocolo de dois flashes descrito abaixo, em componentes rod- e orientada para o cone. Sob condições fotópicas, a uma onda não é detectável em ratazanas, pois a população cone é baixo, mas PO e uma onda b são5 claro. Nos primatas, cujas retinas têm populações superiores cone, tanto rod- e vias cone- gerar um detectável uma onda 6. Duas medidas úteis muitas vezes extraídos do flash ERG são as amplitudes de a- e b-ondas, medidos como na Figura 1, com as respostas de flash típicos mostrados na Figura 2. Quando a população de fotorreceptores é reduzido, por exemplo por exposição a prejudicialmente brilhante luz, todos os componentes do ERG são reduzidos. Intervenções neuroprotetores, como remota pré-condicionamento isquêmico (RIP), pode ser validado pela preservação das amplitudes do a- e b-ondas (Figura 3). Em resumo, a análise do ERG permite comparações entre saudável, luz e da retina danificado neuroprotected.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL 35044</td>
			<td>Acquistion of ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Bio Amp</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>FE 136</td>
			<td>Amplifier for ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab chart</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Signal collection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganzfield</td>
			<td>Photometric solutions</td>
			<td>FS-250A</td>
			<td>Light stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganzfield operating system</td>
			<td>Photometric solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Radiometer</td>
			<td>International light technologies</td>
			<td>ILT-1700</td>
			<td>calibrate light series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lux meter</td>
			<td></td>
			<td>LX-1010B&#160;</td>
			<td>check red light illumanation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead wires</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Connect postive, negative ground electrodes to amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead wires -aligator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>ground ganzfield and acquistion hardware to computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 95%</td>
			<td>A&#38;E metals</td>
			<td></td>
			<td>postive electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth electrode Ag/AgCl Pellet</td>
			<td>SDR</td>
			<td>E205</td>
			<td>negative electode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>ground electode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td>
			<td>Harvard Appartus</td>
			<td>507222F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine 1% w/v</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>topical mydriasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxmethycaine 0.5% w/v</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>topical anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visco tears eye drops</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>carbomer polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>retract eye lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable adhesive</td>
			<td>Blu tac</td>
			<td></td>
			<td>Dim red headlamp. Affix electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent bedding</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml</td>
			<td>Troy Laboratories Pty Ltd</td>
			<td></td>
			<td>dissociative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml</td>
			<td>Troy Laboratories Pty Ltd</td>
			<td></td>
			<td>muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the electroretinogram to assess function in the rodent retina and the protective effects of remote limb ischemic preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

O protocolo pode ser utilizado para medir a função visual da retina de roedores in vivo. A uma onda, uma medida da função de fotorreceptores, e da onda b, uma medida da função retina interna, são anotados na Figura 1. Os dominados-rod ERG sinal aumenta com o aumento do estímulo de luz, como mostrado na Figura 2A. A onda de um torna-se aparente a ~ 0,4 log Scot cd.sm -2 e a amplitude de um dos aumentos de onda até à saturação a...

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Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

using-electroretinogram-to-assess-function-rodent-retina-protective

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K visualizações.  University of Sydney. The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.