No passado, a caracterização da imunoterapêutica no modelo cobaia limitava-se a medir a imunidade humorística. O ensaio elispot supera essa limitação e ajudará os pesquisadores a gerar dados mais significativos nesse modelo animal. A principal vantagem dessa técnica é que as células são obtidas a partir do sangue periférico.
Não é necessária necropsia. Isso permite a medição não apenas da magnitude, mas também da cinética das respostas das células T em cobaias individuais durante uma infecção natural ou em um regime vacinal. Demonstrando o procedimento será Holly Pugh.
Ela é uma pesquisadora associada do Departamento De Ressonância e D pré-clínicos da Inovio. Para começar adicione 15 microliters de 35% de etanol a cada poço de uma placa de ensaio ELISpot. Após 60 segundos adicione 150 microliters de PBS a cada poço.
E inverter a placa para parar o pré-tratamento do etanol. Deve-se também ter muito cuidado ao manusear as placas de ensaio ELISpot para evitar contaminação ou danificar a membrana. Para lavar a placa adicione 250 microliters de PBS a cada poço.
Depois de repetir a lavagem mais duas vezes, adicione 100 microliters de captura anti-cobaia interferon anticorpo gama VE4 para cada poço. Em seguida, incubar a placa por pelo menos 12 horas a 4 graus Celsius. Após o período de incubação, lave as placas três vezes.
Adicione 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, lave as placas mais três vezes.
Prepare tubos cônicos com 4,5 ml de gradiente de densidade de temperatura ambiente. Em seguida, misture um volume igual de Hanks'Balanced Salt Solution com o sangue. Coloque gradualmente o sangue diluído sobre o meio gradiente de densidade, tomando cuidado para não perturbar a interface.
Depois disso, centrifufique os tubos a 800 x g por 30 minutos sem freios à temperatura ambiente. Remova o tubo da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar as camadas. Depois de identificar corretamente as camadas aspiram a camada completa de casaco buffy para colher os PBMCs.
Camada lenta do sangue diluído do HBSS no meio gradiente de densidade. Evite qualquer perturbação do tubo e desligue os freios centrífugas. Transfira as células para um novo tubo de 15 ml.
Em seguida, diluir as células em R10 médio para um volume total de 15 ml. Após a pelotização das células, descarte o supernasce e resuspenque as células em 15 ml de meio R10. Passe a suspensão da célula através de um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo.
Conte as células e determine o número de células vivas com o teste de exclusão azul trypan. Em seguida, diluir as células com meio R10. Primeiro remova o tampão de bloqueio e lave as placas.
Para cada amostra de PBMC indicam triplicados do controle positivo, controle negativo e cada estimulante específico do experimento. Diluir a piscina de peptídeos proteicos em R10 médio a três vezes a concentração final desejada. Depois disso, adicione 50 microliters da mistura média peptídeo R10 aos poços de teste estimulante da placa.
Em seguida, adicione 50 microliters de formulação de peptídeos DE MT em meio R10 aos poços de controle negativos da placa. Adicione em meio R10 aos poços de controle positivo da placa, em seguida, adicione 100 microliters da suspensão PBMC a todos os poços. Coloque a placa ELISpot sobre uma superfície uniforme na incubadora e evite perturbar a placa durante o período de incubação.
Depois de remover cuidadosamente a placa da incubadora, inverta a placa para remover o sobrenatante. Em seguida, lave a placa três vezes. Adicione 100 microliters de detecção biotinilada diluída capturam anticorpos anti-cobaias interferon gama N-G3 a cada poço.
Em seguida, incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas. Inverta a placa para remover a solução de anticorpos e repita a lavagem três vezes. Depois de remover o PBS da placa, adicione 100 microliters de STREPTAVIDIN conjugados ALP diluídos no bloqueio de tampão a cada poço.
Em seguida, incubar a placa em temperatura ambiente por uma hora. Inverta a placa para descartar a solução de streptavidin ALP e lave a placa duas vezes. Inverta a placa e borre-a contra uma toalha de papel limpa para remover qualquer excesso de PBS.
Depois desta lavagem a placa com 250 microliters de água DD Ultrapure por poço. Inverta a placa e remova o excesso de água com uma toalha de papel limpa. Em seguida, adicione 100 microliters da solução de substrato BCIP/NBT a cada poço.
Incubar a placa em temperatura ambiente por 20 minutos protegido da luz. Enxágüe a placa quatro vezes com água DI. Em seguida, inverta e toque a placa para remover o excesso de água.
Por fim, remova a drenagem plástica da parte inferior da placa e deixe a membrana secar completamente. Após uma centrifugação de gradiente de densidade bem sucedida como demonstrado anteriormente, o líquido viscoso vermelho na parte inferior do tubo deve conter a maioria dos glóbulos vermelhos. A camada de casaco buffy está entre a camada de plasma e o meio gradiente de densidade.
Antes de tratar os poços antes de adicionar o anticorpo de captura, o ensaio apresentou melhor definição, juntamente com uma redução no número de pontos inespecíficos nos poços de controle negativos. As manchas são indicativas de interferon gama produzindo células T dentro da população pbmc. Ao tentar essa técnica, é importante lembrar-se de processar o sangue com cuidado, mas rapidamente.
Isso melhorará a viabilidade celular, melhorará a formação de manchas e reduzirá a formação de pontos não específicos. Não se esqueça que trabalhar com sangue e substrato BCIP/NBT pode ser perigoso e precauções como o uso de EPI apropriado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento. Acredito que este protocolo permite que os pesquisadores estudem doenças com um importante componente de células T, como TB, Ebola e HSV.
É importante ressaltar que irá refinar o desenvolvimento de protocolos de vacinação no modelo de cobaia e reduzirá o uso de modelos animais menos relevantes.
