This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Conselho local para Experimentação Animal da Radboud University Nijmegen, em conformidade com as leis e regulamentos (RU-dezembro 2013-205) Holandês. 1. Pontos de Matriz Extracelular gel <ol><li> Execute os seguintes passos um dia antes do isolamento: <ol><li> Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (100 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir a 1:10 em meio de Eagle modificado por Dulbecco; com 4500 mg / L de glicose, 4 mM de L-glutamina, e 110 mg / ml de piruvato de sódio (DMEM). Manter o gel da matriz extracelular, a 4 ° C em todos os momentos. Nota: mudanças bruscas de temperatura irá resultar em revestimento irregular e formação de cristais. </li><li> Manter a solução em gel de matriz extracelular diluído em gelo durante 15 min. </li><li> Pré-descontrair uma micropipeta 20 l para 10 min. </li><li> Coloque lâminas de câmaras de 8 poços para uma placa de Petri de 100 milímetros e transferir o prato sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min.</li><li> Utilizar a micropipeta pré-arrefecido a colocar uma gota de 10 ul de gel de matriz extracelular em cada cavidade. Manter a placa de Petri sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A). </li><li> Remover completamente o restante gel de matriz extracelular (Figura 1B), e secar os poços, a 37 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção de Cabeça Músculos (músculo masseter, digástrico, e músculo levantador do véu palatino) <ol><li> Antes de dissecção, preparar 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 2% de Penicilina-Estreptomicina (P / S). Manter em gelo. </li><li> Após a eutanásia de um rato adulto jovem (9 semanas) com CO 2 / O 2, decapitar a cabeça e retire a pele da cabeça. Transferir a cabeça de PBS arrefecido em gelo suplementado com 2% de P / S em um tubo de 50 ml. </li><li> Músculo masseter (derivado do primeiro arco branquial) <ol><li> Coloque a cabeça com um lateral-se sobre uma almofada de silicone e corrigir com hipodérmica needles (Figura 2A). </li><li> Identificar a glândula parótida e nervo facial (Figura 2A). Expor a fascia profunda cobrindo a glândula. Corte a fáscia e remover a glândula usando tesouras de dissecação. Identificar o conduto auditivo externo. Trace o nervo facial do forame estilomastóideo e retire cuidadosamente os ramos temporais, zigomáticos, e bucais com uma lâmina de bisturi n ° 15. </li><li> Livre a cabeça superficial do músculo masseter, removendo a fáscia. Identificar cabeças tanto superficial e profunda do músculo masseter. Traçar a cabeça superficial até sua aponeurosis tendinosa grossa inserido no processo zigomático da maxila. </li><li> Separa-se o tendão a partir da sua origem no processo de zigomática com uma pinça rectas. Cortá-la com uma lâmina de bisturi n º 15 ou tesouras de dissecação e cuidadosamente vida dele (Figura 2B). </li><li> Dissecar a cabeça superficial do músculo masseter até sua inserção no ângulo e metade inferior de tele Superfície lateral do ramo da mandíbula com uma lâmina de bisturi n ° 15 (Figura 2C). Agora, remover completamente o músculo. </li></ol></li><li> Ventre posterior do músculo digástrico (derivado do 2º branquial arco) <ol><li> Coloque a cabeça em uma posição supina sobre a almofada de silicone e corrigir com agulhas hipodérmicas (Figura 3A). </li><li> Retire a gordura subcutânea que recobre tanto sublingual e submandibular. Em seguida, remova a fáscia superficial e glândulas usando tesouras de dissecação. Expor o músculo digástrico (anterior e posterior da barriga). </li><li> Segure o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, cortá-la, e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (Figura 3B). Fazer a mesma no lado contralateral. </li></ol></li><li> Levator músculo do véu palatino (derivado do quarto arco branquial) <ol><li> Após a dissecção do ventre posterior do músculo digástrico, Localizar o músculo stylohyoid, puxe-o lateralmente e, cuidadosamente, remova-a (Figura 4A). </li><li> Localize o tendão do músculo levantador do véu palatino que insere na bula timpânica (Figura 4A). Dissecá-lo com cuidado e corte-o em ambos os lados. </li><li> Procure a traquéia eo esôfago que corre atrás dele. Levantar o esófago, e expor a faringe, laringe e o palato mole. </li><li> Localize a área do palato mole, onde é inserido o levantador do véu palatino e cortá-lo solto (Figura 4B). Nota: Diretamente após a dissecação, remova cuidadosamente tendões e tecido conjuntivo de cada músculo sob o microscópio estéreo. Submerge todas as amostras rapidamente em etanol a 70%, e transferi-los para PBS arrefecido em gelo suplementado 2% de P / S em um tubo de 15 ml. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de células satélites <ol><li> Execute as seguintes etapas de preparação para SC isolamento a partir de 3 grupos de músculos: <ol><li>Prepare a 7,5 ml de 0,1% de pronase em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água durante 10 minutos antes do isolamento. </li><li> Preparar 35 ml de DMEM suplementado com 10% de Soro de Cavalo (HS) e 1% de P / S. Também pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. </li><li> Preparar 15 ml de meio de cultura, que consiste em DMEM suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS), 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha (CEE). Pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. </li><li> Pré-revestimento seis pipetas de plástico (10 ml) com HS e secas durante pelo menos 10 minutos antes da utilização. </li></ol></li><li> Na capa de cultura, transferir cada músculo em um poço de uma placa de 6 poços. Usando as tesouras de dissecação, cortados do músculo em pedaços pequenos de cerca de 2 mm. Tenha cuidado para não picar o tecido muito. </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 2,5 ml de solução de pronase a 0,1% a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 60 min. Agite ligeiramente a placa após 20, 40 e 60 min. Nota: O duratio exatan da incubação depende de fatores como idade e estirpe dos animais. </li><li> Monitorar sob o microscópio. Confira os fragmentos musculares e parar a digestão enzimática quando os feixes de fibras ter uma aparência solta (Figura 5). </li><li> Adicionar 2,5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar os tubos a 400 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante por decantação. </li><li> Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipetar a solução para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml em plástico (trituração) por pelo menos 20 vezes para homogeneizar o tecido. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 min. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipeta de novo com uma pipeta de plástico de 10 mL até os fragmentos de tecido passa facilmente através da pipeta. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 minutos e recolher o sobrenadante num tubo de 15 ml. </li><li> Put um filtro de células (40 ^ M) para um tubo de 50 ml e transfere-se o sobrenadante contendo as células dissociadas sobre o filtro. Lavar com 1 ml DMEM para a recuperação das células máxima. </li><li> Centrifugar os tubos a 1000 x g durante 10 minutos e descarta-se o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Ressuspender o sedimento em 300 ul de meio de cultura e contar as células num hemocitómetro. </li></ol> 4. A diferenciação das células satélites em Spots de Matriz Extracelular Tapetes <ol><li> Dilui-se a suspensão de células para se obter 1,5 x 10 3 células em 10 ul de meio de cultura. </li><li> Fixe as tampas das câmaras de slides com fita e marcar os pontos com um marcador preto no lado inferior do vidro objeto. </li><li> Usando uma micropipeta, coloque uma gota de suspensão de células 10 ul para o ponto gel matriz extracelular. Verificar se ao microscópio a gota da suspensão de células foi colocada correctamente no local. Incubar durante seis horas a 37 ° C. </li><li> Cuidadosoly adicionar 400 uL de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S a 1% e CEE) e incuba-se durante três dias a 37 ° C. Nota: Neste ponto, recentemente isoladas SC são submetidos a um trauma severo (digestão enzimática e trituração dura) e que eles precisam para se recuperar. Não perturbar as células durante os primeiros três dias 37. A seguir, o meio de cultura pode ser alterada dependendo do tipo de experiência. Os pontos de gel da matriz extracelular podem ser semeadas com uma densidade celular elevada (1,5-2,5 x 10 3/20 l) para o ensaio de diferenciação. O meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) pode ser substituído a cada três dias. </li><li> Alternativamente, se a expansão ea passagem é desejada seguir os seguintes passos: <ol><li> Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (500 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir 1:10 em DMEM e siga as recomendações no ponto 1.1.1. </li><li> Pré-arrefecer uma pipeta de 10 mL durante 10 min a 4 &amp;# 176; C. </li><li> Transferir três frascos T75 sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min. </li><li> Use a pipeta pré-refrigerados para colocar 1 ml de gel de matriz extracelular em cada frasco. Verifique se a superfície é coberta completamente. Manter os frascos sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A). </li><li> Remover completamente o gel matriz extracelular restante com uma pipeta de 10 ml, e secar os poços, a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a contagem, ressuspender as SCs isolados de fresco em 10 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) e as sementes em frascos T75 pré-revestidos. </li><li> Depois de três dias, alterar a forma (e cada terceiro dia) até 80% de confluência é atingido. Para passaging, lavar os frascos T75 três vezes com PBS. Em seguida adicionar 1 ml de solução de tripsina a 0,25% e incubar durante três minutos a 37 ° C. Ressuspender em 9 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / Se 1% de extracto de embrião de galinha) e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Desprezar o sobrenadante. Após a contagem, ressuspender 1 x 10 6 células em 1000 uL de meio de cultura e congelar as células. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SCs de diferentes músculos da cabeça branquiométrico foram isolados a partir de um de 9 semanas de idade de ratos Wistar e cultivadas directamente em manchas de gel de matriz extracelular sem a expansão e passagem em antes. Após o isolamento, as células foram contadas e semeadas à mesma densidade celular. Para o isolamento paralela de três músculos diferentes, este método leva cerca de 4 horas. Para evitar a contaminação da cultura, um passo crítico é a rápida lavagem em álcool a 70% após a dissecação dos músculos. Durante SC isolamento é importante para cortar o tecido muscular em pequenos pedaços (cerca de 2 mm), mas evitar o excesso de picagem pois isso irá resultar num rendimento de célula pequena por causa de danos celulares. Além disso, a duração da digestão enzimática deve ser verificado cuidadosamente sob o microscópio para evitar mais danos. O objectivo da digestão é de dissociar as miofibras. Uma vez que mais de 90% das células isoladas expressam Pax7, não é necessária mais purificação (Figuras 6-8).Isto evita passos de purificação adicionais em outros métodos, tais como pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fraccionamento em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41,43. Por trituração é essencial induzir cisalhamento entre os fragmentos de tecido e a abertura da ponta da pipeta como este permite que a libertação mecânica do SC. Se a trituração com uma pipeta 10 ml (dentro de ponta diâmetro: 1 mm), é difícil, de 5 ml (dentro ponta diâmetro: 2 mm) pipeta pode ser utilizada pela primeira vez. Alternativamente, pipetas de Pasteur de vidro pode ser cortado no diâmetro desejado e ser utilizado. Este método é simples, eficiente e permite o isolamento em simultâneo de SC a partir de diferentes amostras do músculo. As placas de cultura para SCS também pode ser revestida com gelatina ou colagénio, mas os nossos estudos anteriores mostram que o gel de matriz extracelular é muito melhor para a manutenção do potencial miogénica de colagénio 38. As manchas extracelulares da matriz de geltamanho milímetros (10 ul / S de 2 mm ou 20 ul de E / S 4 mm) permite o estudo da proliferação e diferenciação de SCS com um número limitado de células. Para o ensaio de diferenciação de cerca de 8 a 20 vezes menos células são necessários em comparação com uma placa de 24 poços (Ø 15,6 milímetros), e cerca de 80 a 200 vezes menos comparado até 35 mm pratos Petri (Ø 35 mm) 14,38. Desde gel de matriz extracelular é caro, este método também é mais eficiente em termos de custos. Além disso, as lâminas de câmara pode ser substituído por cobertura de plástico desliza para reduzir ainda mais os custos. Para a preparação do gel matriz extracelular acaba de secagem durante a noite das lâminas de câmaras é essencial. À medida que as manchas de gel de matriz extracelulares são transparentes, é necessário marcar os pontos no lado inferior utilizando iluminação traseira. As câmaras de slides são fixados em uma placa de Petri para a manipulação fácil. A expansão adicional de cultura de células não é necessário, o que oferece a possibilidade de estudar o SCs de smalLER músculos ou amostras musculares pequenos. Alternativamente, por exemplo, para PCR ou músculo constrói se são necessários mais células, as SCs de isolados de fresco pode ser primeiro expandida em frascos T75, tal como indicado acima. SCs isolado utilizando este protocolo, não são adequados para a purificação adicional com a citometria de fluxo imediatamente após o isolamento. A digestão com pronase provoca extensa digestão de antigénios da superfície 14. De soro de cavalo e soro fetal bovino que são utilizados para a cultura de células tem de primeiro ser adequadamente caracterizados, antes do isolamento, como diferentes números de lote diferencialmente afectada mioblastos proliferação e diferenciação. Nos últimos anos, há um crescente interesse nos músculos derivados dos arcos branquiais e da mesoderme da cabeça (por exemplo, os músculos extra-oculares) 24. Tem sido claramente demonstrado que músculos da cabeça e dos membros possuem propriedades altamente diferentes. Músculo masséter de animais velhos parece retain sua capacidade regenerativa, em comparação com os músculos dos membros 25,26. SCs dos músculos extra-oculares possuem uma robusta capacidade de proliferação e diferenciação comparável ao SCs de músculos da cabeça, e mostrar um potencial maior do que o enxerto muscular de membros SCs 24. A composição de distribuição do tipo de fibra e miosina varia entre os grupos musculares e também entre as espécies. Músculos originários a partir do primeiro arco branquial em humanos contêm fibras tanto lentas e rápidas (IIA e IIX subtipos), myosins neonatais e myosins típicos para o desenvolvimento de músculo cardíaco. Em roedores estes músculos contêm cerca de 95% IIA fibras rápidas miosina e IIb) 44-46. Estudos sobre os músculos aviário mostram que a SCS a partir de diferentes tipos de fibras musculares variar em capacidade de diferenciação. SCs de fibras rápidas única diferenciar em fibras musculares rápidas, enquanto SCs de fibras lentas podem se diferenciar em ambos os tipos de fibras 47. Além disso, a percentagem de CT no músculo rápidofibras é menor do que na fibras musculares lentas 48,49. Isto indica que a distribuição do tipo de fibra deve ser tida em conta para os estudos sobre os músculos na área craniofacial. Similar aos músculos fenda palatina, o LVP em roedores contém quase exclusivamente fibras rápidas 50. Por essa razão, SCs da LVP são adequados para estudos pré-clínicos no campo da fenda palatina. Este protocolo oferece novas possibilidades para estudar SCs derivadas de músculos da cabeça branquiométrico ou outros músculos menores ou amostras de músculos menores. Isto irá facilitar o desenvolvimento de novas terapias para melhorar a regeneração dos músculos da região maxilofacial em condições tais como fenda palatina mas também em outras condições que afectam os músculos menores.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Cerca de 1: 500 a 1: 1.000 recém-nascidos apresentam uma fissura envolvendo o lábio e / ou palato (CLP); assim, esta é a malformação congênita mais comum em humanos uma. Os músculos do palato mole são essenciais para o funcionamento do palato mole durante a fala, deglutição e sucção. Se uma fenda do palato mole está presente, estes músculos são anormalmente inserido na extremidade posterior do osso palatino. O palato mole move para cima e para baixo durante a fala, impedindo que o ar escape através do nariz. Crianças com uma fenda no palato não têm essa função de controle, resultando em um fenômeno conhecido como disfunção velofaríngea 2,3. Embora os protocolos de tratamento são variáveis, a reparação cirúrgica do palato mole tem lugar na primeira infância (6-36 meses de idade) 4. Os músculos anormalmente inseridos do palato mole pode ser corrigido cirurgicamente 5-7, no entanto, disfunção velopharyngeal persistir em 7% a 30%dos pacientes 2,3,8-10. A capacidade do músculo esquelético para regenerar-se através da acção de células satélites (SCS) está bem estabelecida 11,12. Após a lesão muscular, SCs são activados e migram para o local da lesão. Eles então proliferar, diferenciar, e se fundem para formar novas fibras musculares ou reparar danificado os 13. Quiescentes SCs expressam o fator de transcrição Pax7 14,15, enquanto a sua progênie, os mioblastos proliferação, adicionalmente expressar o fator de determinação miogênica 1 (MyoD) 16. Mioblastos diferenciadores começam a expressar miogenina (MyoG) 17. A diferenciação terminal de mioblastos é marcada pela formação de miofibras, e a expressão de proteínas específicas de músculo, tais como cadeia pesada de miosina (MyHC) 16,18. Recentemente, várias estratégias têm sido utilizadas em medicina regenerativa para melhorar a regeneração do músculo dos músculos do membro 19-23. Estudos específicos sobremúsculos da cabeça branquiométrico também são importantes, pois foi demonstrado recentemente que eles diferem de outros músculos em vários aspectos 24. Em contraste com os músculos dos membros, tem sido sugerido que os músculos da cabeça branquiométrico contêm menos SCs 25, regenerar mais lento, e tecido conjuntivo mais fibrosa é formada após a lesão 26 Além disso, a proliferação de músculos SCs cabeça branquiométrico também expressar outros factores de transcrição. Por exemplo, Tcf21, um fator de transcrição para a formação muscular craniofacial é fortemente expresso na regeneração de músculos da cabeça, mas dificilmente na regeneração de músculos dos membros 25. Os músculos do palato mole de pacientes CLP são geralmente menores e menos bem organizada em comparação com músculos palatinos normais 27,28. Fibras lentas e rápidas estão presentes nos músculos do palato mole, mas as fibras lentas são mais abundantes. Em contraste, os músculos fissura contêm uma maior proporção de fibras rápidas e também uma fonte capilar reduzidaem comparação com os músculos do palato mole normais 29-31. Fibras rápidas são mais propensas a contração induzida por lesão 31-33. O pobre suprimento capilar de acompanhamento também pode promover a fibrose 34,35. Todos estes aspectos podem contribuir para o mau regeneração dos músculos moles do palato após o fecho cirúrgico fenda 36. Em vista disso, um protocolo para o isolamento e caracterização de músculo cabeça branquiométrico SCs é crucial. Isto proporciona a possibilidade de estudar a biologia dos músculos SC cabeça branquiométrico. Além disso, novas terapias com base em engenharia de tecidos podem ser desenvolvidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia em CRE e outras condições comprometedoras da área craniofacial. Em geral, SCs pode ser obtido após dissociação do tecido muscular 14. Picar, digestão enzimática e trituração geralmente são obrigados a liberar SCs de seu nicho. SCs pode ser purificado por meio de pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fractionation em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41-43. Aqui nós apresentamos um novo protocolo econômico e rápido para o isolamento de células satélites de músculos da cabeça branquiométrico de ratos adultos jovens. Este protocolo baseia-se num manuscrito anterior 14 e especificamente adaptado para pequenas amostras de tecido. O isolamento de SCs de músculos representativos provenientes do 1 º, 2 º e 4 º arcos branquiais são descritos. Após o isolamento, baixo número de células satélites são cultivadas em gel matriz extracelular manchas de tamanho milímetro para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a necessidade para a expansão e passaging de SCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Usando este protocolo, o músculo masseter (um lado) produz 0,8-1 x 10 6 células, o músculo digástrico (barriga posterior) produz 1,5-2 x 10 5 células, e levator veli rendimentos musculares palatini 1-1,5 x 10 5 células. Rendimentos celulares dependem do tipo muscular, estirpe e idade do animal. Para a comparação entre os três grupos musculares, SCs isolados de fresco foram semeadas à mesma densidade de células (1,5 x 10 3/10 ul). Imediatamente após o isolamento, mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 6). Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7, MyoD, MyoG e MyHC immunostaining. Cinco campos arbitrários foram contadas por cultura usando uma objetiva de 20X. No dia 4 Pax 7 e Myo D é expresso em todos os grupos musculares (Figuras 6 e 7 e 8), porém a descendência de SatCs do masseter e os músculos digástrico começar exprescante miogenina mais cedo do que o músculo levantador do véu palatino (Figura 9). No dia 10, a expressão de MyoG é fortemente reduzida em todos os grupos (Figura 9). Alguns dias após a semeadura das manchas do gel matriz extracelular, as células em proliferação começar a fundir e formar miotubos multi-nucleadas, que expressam miosina de cadeia pesada. Pequenas miotubos são claramente visíveis no dia 7 (Figura 10). No dia 10, espasmos dos myotubes pode ser observada (Video 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figura 1:. Manchas extracelulares da matriz de gel em uma lâmina de câmara (A) Para a manipulação fácil, colocar a corrediça câmara de 8 poços para uma placa de Petri 100 milímetros. Pipeta 10 ul gel matriz extracelular em cada câmara e coloque-o sobre uma superfície fria (7 min). (B) Câmara slide após o excesso de matriz extracelular gel é removido. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissecção do músculo masseter (A) Cabeça do animal em uma visão lateral. Orelha (E), a glândula parótida (P) e do nervo facial (VII). (B) tendíneas aponeurosis (Te) da cabeça superficial do músculo masseter (Ms) e do músculo temporal (T). Separa-se a sua inserção a partir de tendão com um fórceps. (C) dissecar cuidadosamente o músculo até sua inserção no ramo da mandíbula. E: orelha, P: glândula parótida, VII: nervo facial, T: músculo temporal, Ms: cabeça superficial do músculo masseter, Te: tendão, Mp: cabeça profunda do músculo masseter. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figura 3: Dissecção do ventre posterior do músculo digástrico (.A) Cabeça do animal em decúbito dorsal. Localizar a glândula submandibular (SG), músculo masseter (M), nervo facial (VII) e músculo esternocleidomastóideo (SCM). Remover a glândula submandibular. (B) Localize o anterior digástrico muscular (AD) e ventre posterior (DP). Com uma pinça reta, tomar o tendão anterior do ventre posterior, cortá-lo e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (ty). E: orelha, Sg: glândula submandibular, VII: nervo facial, M: músculo masseter, SMC: esternocleidomastoideu, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, Ty: bula timpânica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figura 4:. Dissecção do músculo elevador do véu palatino (A) Vista geral após a dissecação do músculo digástrico (ventre posterior). Músculo stylohyoid (St) e tendão do músculo levantadorvéu palatino pode ser localizada. Nota da traquéia (T) e esôfago (Es) correndo atrás dele. (B) Depois de levantar a traqueia e o esófago da faringe (P) fica exposto. A inserção do músculo levantador do véu palatino no palato mole é agora visível. A seta indica o palato mole dissecados com os músculos palatino levator Veli em ambos os lados. E: orelha, St: músculo stylohyoid, VII: nervo facial, M: músculo masseter, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, T: traqueia, Es: esôfago, P: faringe, * levator músculo do véu palatino . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figura 5: Aparência do tecido muscular (A) antes e (B), após a digestão enzimática com pronase. Note-se que feixes musculares parecem ser solta após a digestão enzimática. Figura 6: 7 Pax imunocoloração SCs recentemente isoladas, aplicado a gel de matriz extracelular no final do isolamento (cerca de 6 horas após a digestão inicial do tecido).. Cinco campos arbitrárias foram contadas utilizando uma objectiva de 10x com uma média de 210 células por campo. Aproximadamente 90% das células são positivas Pax 7. DAPI: azul, Pax7: vermelho. Barra de escala, 100 mm. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7:. Pax 7, MyoD immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. (A - C) e (D - F) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 a partir de culturas do músculo masséter. (L e H </strong&gt;) O número de Pax7 + e MyoD + núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). DAPI: azul, Pax7: vermelho, e MyoD: verde. Escalas bar, 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figura 8:. Distribuição de Pax7 ± / ± MyoD em culturas de células mononucleares nas culturas a partir do músculo masseter palatina, digástrico e levator veli (A - C) Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. O número total de células é baseada na do número total de núcleos (DAPI). (D) quantificação de dados de Pax7 ± / ± cel MyoDls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figura 9:. Immunostaining Miogenina Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Miogenina. (A - D) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 culturas do músculo levantador do véu palatino. (E) O número de MyoG + núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). Quantificação (F) Dados de células MyoG +. DAPI: azul, Miogenina: verde. Escalas bar, 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figur</a>e. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figura 10:. Myosin Cadeia Pesada immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina (MyHC). Fotomicrografias representativas dos dias 4, 7 e 10 culturas do músculo digástrico (DIG). No dia 7, as pequenas myotubes estão presentes, enquanto no dia 10 myotubes longas e bem organizados são evidentes. Escalas bar, 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1:.. Miotubo contraindo Exemplos de dois campos representativos com myotubes contraindo são mostrados para o dia 10 culturas de músculo digástrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

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Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Este protocolo descreve o isolamento de células de satélite a partir de músculos da cabeça branquiométrico de um rato 9 semanas de idade. Os músculos são originários de diferentes arco branquial. Subsequentemente, as células satélites são cultivadas em um revestimento local de tamanho milímetros para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a expansão e passagem em células de satélite.

Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K visualizações.  Radboud University Medical Center.  Este protocolo descreve o isolamento de células de satélite a partir de músculos da cabeça branquiométrico de um rato 9 semanas de idade. Os músculos são originários de diferentes arco branquial. Subsequentemente, as células satélites são cultivadas em um revestimento local de tamanho milímetros para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a expansão e passagem em células de satélite. 

Vídeo: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...