Os autores gostariam de estender muitos agradecimentos aos Drs.. Josep Planas e Juan Castillo por sua experiência profissional no desenvolvimento e aplicação do presente protocolo cultura para pequenos peixes e anfíbios. Agradecimentos também são devidos aos inúmeros indivíduos que incansavelmente assistida com a dissecção e dissociação do tecido muscular de muitos peixes (tanto em espécies e número), incluindo Matthew carregamento, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily e Sinibaldo Romero. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Alabama em Birmingham Departamento de Biologia fundos de arranque, Center for Research Protease NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 e NDSU avançar NSF Grant # HRD-0811239 para PRB. O suporte também foi fornecido pela UAB Nutrição Obesidade Centro de Pesquisa prêmio # P30DK056336, NIH NIDDK. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não necessariamenterepresenta a visão oficial do NIH.

Declaração de Ética: Todos experimentação envolvendo animais vertebrados descritos aqui foi previamente aprovado pelo Comitê da Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Animal Care e Use e é consistente com as diretrizes estabelecidas pela Secretaria de Laboratório Animal Welfare, National Institutes of Health de os EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos. 1. Preparação para a Cultura <ol><li> Preparar o meio de base da seguinte forma: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L), em DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L). <ol><li> Determinar o pH e ajustar a 7,40 com HCl ou NaOH. </li><li> Determinar e ajustar a osmolalidade ~ 300 mOsm com NaCl (se necessário). </li><li> Filtro esterilizar utilizando (2) sistemas de esterilização de 1 L de vácuo e armazenar a 4 ° C protegidos da luz durante até 2-3 meses. NOTA: Ver Tabelas 1 e 2 para o reagente completo, ferramentas, consumveis, e informações sobre o equipamento. </li></ol></li><li> Prepara-L-lisina-tratados poli placas por dissolução de 5 mg de irradiadas-γ poli-L-lisina (&gt; 300.000 mw) em 50 ml de água ultrapura esterilizada. Misturar suavemente por inversão durante 10 minutos à temperatura ambiente, assegurar a dissolução completa dos polímeros de lisina. </li><li> Pipetar a quantidade necessária de poli-L-lisina solução em cada poço, de acordo com o tipo de placa (Tabela 3). Permitir que as placas de suporte em fluxo laminar capuz durante 5 minutos. </li><li> Em seguida, remova-poli-L-lisina solução e lavar duas vezes com água estéril. Permitir placas para o ar seco em fluxo laminar capô por 20 minutos. </li><li> Obter 1 mg de laminina (origem Engelbreth-Holm-Swarm) e dissolver em 50 ml de meio de base para uma concentração final de 20 ug / ml. Aplicar a solução de laminina para placas de cultura celular de poli-L-lisina-tratados em 2 mg / cm 2. (Ver Tabela 3 para diferentes tamanhos de placas) </li><li> Agite suavemente a solução para garantir full bem cobertura. Selar as placas com fita laboratório e colocar em incubadora por 24 horas. A incubadora deve ser definido como a temperatura apropriada para a espécie a ser utilizadas (ver Tabela 7), e sem gases adicionais necessitam de ser adicionados à incubadora. NOTA: A laminina devem ser autorizados a aderir às placas por 24 horas antes de semear células. Não fazer isso irá resultar em pobre para não adesão celular. </li><li> Prepare mídia, como descrito na Tabela 4. Mídia completa é melhor preparada no dia de uso. </li><li> Em preparação para o isolamento de tecido, montar os seguintes itens e autoclave: 300-500 ml copo (s); pratos de vidro de Petri; bisturi alças; fórceps (fina e grossa); tesoura de dissecção; e várias folhas de papel autoclave repelente de água. NOTA: Para cada pessoa ajudar com o processo de dissecação, (2) alças de bisturi, (1) pinças (tipo dependendo da preferência pessoal), (1) tesoura de dissecção, e (5-10) folhas de papel autoclave repelente de água sãosuficiente. </li><li> Além dos artigos acima autoclavados, montar etanol a 70%, um equilíbrio do peso, 50 ml de tubos cónicos estéreis (número depende do tamanho da cultura), e gelo. </li></ol> 2. Dissecção de tecido <ol><li> Antes de começar, certifique-se de que um estoque suficiente de peixes. NOTA: A idade do peixe a ser utilizado é de importância crítica. Enquanto os peixes de duas espécies diferentes podem ser de pesos semelhantes, um peixe mais jovem de uma espécie irá possuir mais do que um peixe PPM mais velho de outra espécie. Como regra geral, os peixes mais novos, especialmente quando se trabalha com salmonídeos, são as melhores. Para danionins, peixe tão antiga como um ano pode ser utilizada de forma otimizada, enquanto salmonídeos de idade 4-6 meses ou mais jovens (até 15 g) são ideais. </li><li> Para cada 5 g de tecido a ser dissecado, alíquota de 25 ml do meio de isolamento para um estéril tubo de 50 ml. </li><li> Pesar, massa registro e número do tubo (s). Colocar os tubos em gelo. </li><li> Eutanásia 2-3 peixede cada vez, por imersão em&gt; 300 mg / L de sódio tamponada com bicarbonato de tricaina metanossulfonato. Permitir o movimento do opérculo cessar durante&gt; 5 minutos e, em seguida, mergulhe peixe em etanol a 70% (contida nos copos estéreis) durante 30 segundos. </li><li> Retire o peixe a partir de etanol 70% e colocar em autoclave papel repelente de água. Diretamente atrás do opérculo, usar um bisturi para fazer uma incisão superficial, superficial. Remover as escamas da pele e agarrando a pele através da incisão acima mencionado e puxar para cauda de peixe. </li><li> Após a remoção da pele, extirpar o epaxial, fast-glicolítico muscular &#39;branco&#39; do peixe de ambos os lados (evitando o músculo &#39;vermelho&#39; slow-oxidativo localizado perto da linha lateral) e coloque no meio de isolamento. Descartar o restante dos peixes tal como exigido pela instituição. Células Embora seja perfeitamente possível PPM cultura provenientes de músculo vermelho, quase todas as publicações usando teleósteos PPM tem utilizado isolados do epaxial m: NOTAyotome. </li><li> Repita os passos 2,4-2,6 até uma quantidade suficiente de músculo é obtido. Durante a dissecção, garantir que o tecido do músculo permanece reunido em gelo para manter a viabilidade celular. </li></ol> 3. Dissociação mecânica <ol><li> Despeje um tubo de 25 ml / 5 g de tecido muscular em uma placa de Petri de vidro. Usando dois bisturi lida com anexados # 10 lâminas de bisturi, tecido picada até obter uma consistência de chorume ou purê. Um movimento &quot;vai-e-vem&quot; de puxar as lâminas de bisturi após se funciona melhor. Nota: Enquanto homogeneizadores tecido pode parecer adequado, o número de células viáveis ​​serão drasticamente reduzidos, se não abolido. </li><li> Usando uma pipeta de 25 ml sorológica e pipeta sorológica, remover o tecido empapado e substituir no tubo cônico de origem. </li><li> Repita os passos 3,1-3,2 até todos os tecidos em todos os tubos foi dissociado mecanicamente. </li><li> Tecido Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e 10 ° C. </li><li> Folldevido a centrifugação, descartar os 25 ml de sobrenadante de mídia com uma pipeta 25 ml sorológico, aspirador a vácuo, ou por decantação cuidadosa. </li><li> Adicionar 25 ml de meio de lavagem a cada tubo de tecido, ressuspender e recentrifuge como acima. </li><li> Lavar duas vezes com meio de lavagem, remoção do sobrenadante de cada vez. </li></ol> 4. Dissociação enzimática <ol><li> Durante o passo 3.4, preparar uma solução de colagenase por combinação de 0,22 g de colagenase do tipo IV e de 44 ml de meio de base (ou quantidade suficiente para g/0.22 0,11 ml). </li><li> Misture um copo por 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro esterilizar com uma seringa de 50 ml e um filtro de seringa de 0,45 um. NOTA: Mais do que um filtro de seringa pode ser necessário, dependendo da preparação da colagenase. Colagenase obtidos a partir de diferentes Worthington Biochemical fornecedores representa mais dificuldade durante a filtração. A colagenase é utilizado para dissociar ligações peptídicas em colagénio que constituem o endomísio. Estedigestão vai remover essa barreira protetora das fibras musculares. </li><li> Por cada grama de tecido muscular, ressuspender o tecido numa solução de colagenase a 0,2%. Para se 5 g de tecido muscular, adicionar 10 ml de solução de colagenase e de 15 ml de meio de base. </li><li> Adicionar 10 ul de PSF por ml de solução / meio base de colagenase (por exemplo, 250 ul para 25 ml). Certifique-se de que o tecido é bem suspenso, pois isso irá afetar a eficiência da digestão enzimática. </li><li> Incubar o tecido muscular em colagenase durante 60 minutos a 18 ° C com oscilação suave. Dependendo do grau de dissociação mecânica e espécies, a digestão de colagenase pode ser prolongado até 90 minutos, embora isto possa afectar a viabilidade celular. </li><li> Seguindo os tubos de digestão com colagenase, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido em 25 ml de meio de lavagem. </li><li> Recentrifuge a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita com o meio de lavagem uma segunda vez. </li><li> Depois de lavar duas vezes o tecido, o tecido do músculo ressuspender em 25 ml de meio de lavagem e tritura-se com uma pipeta 10 ml serológico até o tecido / homogenato médio passa dentro e para fora da pipeta com relativa facilidade. 5-10 triturações é geralmente suficiente. <ol><li> Repetir com uma pipeta de 5 mL e, em seguida, serológico cânula de metal de 16 gauge ligada a uma seringa. </li></ol></li><li> Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar o sobrenadante. </li><li> Durante a centrifugação acima de 5 minutos, a preparação da solução de digestão de tripsina por combinação de 0,25 g de tripsina com 5 ml de meio de base. </li><li> Agita-se a 4 ° C durante 10-15 minutos e filtra-se esterilizar com uma seringa de 20 ml e de 0,45 um filtro de seringa. </li><li> Recuperar tubos cónicos e adicionar 100 ul de solução de tripsina e 4,9 ml de meio de dissociação para cada 1 g de tecido muscular de cada tubo. Para example, adicionar 500 mL de solução de tripsina e de 24,5 ml de meio de dissociação de 5 g de tecido muscular. NOTA: A tripsina é uma serina-protease que irá separar as células precursoras a partir de miogénicas a lâmina basal. </li><li> Tecido Ressuspender no tripsina / dissociação médio. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C. </li><li> Após a primeira incubação com tripsina, tubos cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina. </li><li> Para o sedimento restante do tecido, repetir os passos 4,12-4,15, combinando o sobrenadante seguinte passo 4.15 com o meio sobrenadante / isolamento a partir da primeira digestão de tripsina. </li><li> ALTERNATIVAMENTE: Os colagenase e tripsina digestões podem ser combinadas para optimizar os rendimentos de células. &lt;ol&gt; <li> Para fazer isto, tritura-se o digerir com colagenase usando uma cânula de metal (6 de comprimento e calibre 16 funciona melhor) ligada a uma seringa de 20 ml, até o homogeneizado passa facilmente através da cânula. </li><li> Para o homogeneizado, adicionar 500 mL de solução de tripsina (preparado no passo 4.10) e incubar a 18 ° C durante 20 minutos. </li><li> Seguindo os tubos de incubação, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 minuto, a 12 ° C. </li><li> Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. </li><li> Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina. </li><li> Prossiga com o passo 4.18 como com o protocolo padrão. </li></ol></li><li> Dispensar a final sobrenadante / isolamento mistura meio em tubos de 50 ml cônico e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o celularpelotas. Pipeta de 2 ml de meio completo a cada tubo, dissolvendo cada sedimento celular. </li><li> Combinar as células suspensas em meio completo em um tubo de 50 ml. </li><li> Lavar cada tubo com 1 mL de meio completo, que combina com o conjunto de células ressuspensas anteriormente. </li><li> Tritura-se com uma cânula de metal e uma seringa de 5-10 vezes. </li><li> Filtrar a suspensão de células através de um coador de células de 100 mM, lavagem com meio completo. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m. </li><li> Adicionar meio completo suficiente para 50 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C. </li></ol> 5. Contar, diluição e Sementeira de Células <ol><li> Após a centrifugação final no passo 4.25, remover o sobrenadante por decantação cuidado ou com uma pipeta sorológica. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio completo. </li><li> Com células totalmente ressuspenso, remover 20 ul, De suspensão de células e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 5 mL de corante azul de Tripan e aguarde 5 minutos. Usando um hemocitómetro, determinar o número de células viáveis. </li><li> Após a determinação, diluir as células com a concentração necessária. Teleósteos PPM são mais cultivadas a 150.000-200.000 células por cm 2. Para uma estratégia de seis cavidades, chapeamento, diluir as células a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml suporta a proliferação e diferenciação suficiente. </li><li> Recuperar-L-lisina-tratados poli, placas revestidas de laminina e células de sementes. (Veja a Tabela 5 para as diluições específica de placa e os volumes de chapeamento.) NOTA: A Tabela 6 descreve o número médio de células isoladas por grama de tecido de músculo isolado a partir de várias espécies de teleósteos. Truta arco-íris (O. mykiss) apresentam menos PPM por grama de tecido muscular do que peixe-zebra (D. rerio) e, assim, exigem mais peixe para isolar a partir de semeadura adequada. </li><li> Selar as placas com fita de laboratório e em lugar incubadora de refrigeração, à temperatura adequada. PPM de todas as espécies listadas aqui (exceto para os ratos) pode ser incubados sob condições atmosféricas normais, sem a suplementação de dióxido de carbono (CO 2). (Ver Tabela 7). </li><li> Em alternativa: Alguns laboratórios têm adotado um protocolo que exige permitindo PPM a aderir ao substrato de cultura para 40 minutos. <ol><li> Em seguida, lave as placas com os meios de lavagem para remover as células frouxamente unidas e não aderentes. Aviso: Esta etapa é muito importante para evitar a adesão &quot;não específica&quot; de outras células (por exemplo, os fibroblastos) para os substratos cultura. </li><li> Adicionar mídia completas e células lugar na incubadora e cuidar como detalhado abaixo. </li></ol></li></ol>

Não há nada a divulgar.

O programa miogénica, em qualquer espécies examinadas, pode ser mais facilmente estudado por meio de um sistema in vitro. Com efeito, após o isolamento, as células precursoras miogénicos (PPM) em peixes ou células myosatellite (MSCs) em mamíferos facilmente entrar neste processo altamente regulado que envolve a proliferação, a retirada do ciclo celular, e a diferenciação terminal de mioblastos e a fusão dos mioblastos em miotubos nascentes. A falta generalizada de linhagens transgênicas repórter g...

Compreensão considerável de myogenesis mamíferos foi obtida através da recapitulação do processo em ambos os rato primária (Mus musculus) culturas de mioblastos ea linha celular derivada de rato bem descrita, C2C12 5. Começando nos anos 1950, 6, estas culturas conduziram a muito avanço na compreensão do programa murinemyogenic e, por extensão, miogenese em outros vertebrados. Além disso, uma única célula técnicas myofiber explantes têm aumentado a compreensão das interações entre células satélites e fibras musculares em torno 7-9. Culturas celulares são particularmente atraentes para as investigações de miogênese, devido ao curto espaço de tempo a partir de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidade de transfecção de RNAi 11-14, transgênico 15,16 e superexpressão estudos 14,17,18, a expansão in vitro seguida de transplante in vivo 18-20, e até mesmo uma miniaturaarison de células precursoras miogênicas e seus agentes reguladores em todo taxa 21,22. Embora as diferenças devidas ao meio artificial do sistema de cultura têm sido descritos 5,23, estes sistemas in vitro têm provado ser indispensável para a dissecção do programa que regula a formação de complexo de multinucleadas, myofibersfrom terminalmente diferenciada mononucleated células progenitoras proliferativas conhecidos como myosatellite células (MSCs) entre os mamíferos. Fora da classe Mammalia, no entanto, a conservação e / ou divergência de mecanismos que controlam myogenesis são mal compreendidos, em grande parte devido à dificuldade em cultura de células precursoras miogênicas (PPM) e mioblastos de vários táxons. De facto, as culturas de mioblastos primários apenas tenham sido descritas em três aves 24-26, um réptil 27, algumas anfíbios 28-30, e alguns peixes 1,3,4,31-33. Linhagens de células miogênicas contínuos de vediferentes roedores 34-36 rtebrates são ainda mais raros, com a única linha de não-mamíferos miogênica célula sendo derivado de codornas japonesas (Cortunix japonica), QM7 37. Apesar de muitas tentativas de imortalização, uma linha celular miogênica teleósteos permanece indefinida e um protocolo para a transfecção eficiente dessas células só foi publicado este ano 15. Assim, os protocolos claros e bem otimizadas para cultivar PPM primárias e mioblastos de uma variedade de vertebrados são muito necessárias, não só para expandir ainda mais o nosso conhecimento sobre a evolução do programa miogênica, mas para empregar o poder da fisiologia comparativa para fazer descobertas em o tratamento de doenças do músculo esquelético e distúrbios humanos. Enquanto a literatura contém muitos relatos de isolamento MPC / mioblastos 38-49, é comum que os autores descrevem os protocolos para esses isolamentos em breve, muitas vezes incompletos, formatos. Além disso, os protocolos mais instrutivas reported foram desenvolvidos para ratos 50-53, e algumas delas contam com seleção anticorpo 54,55 ou transgenes fluorescência 56,57, tornando estes protocolos inutilizável ou íntimos espécie não roedora impraticáveis ​​utilizadas por biólogos musculares. Com pouco sabe sobre piscine, anfíbio, réptil e miogênese, um protocolo detalhado e completo, descrito com orientação audiovisual e com eficiência demonstrada em espécies distantemente relacionadas, seria mais útil para o campo. Descrita pela primeira vez por Powell e seus colegas em 1989 58, o seguinte protocolo foi inicialmente desenvolvido para isolar PPM e mioblastos de peixes salmonídeos (ou seja, a truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, e salmão do Atlântico, Salmo salar) e alguns ciprinídeos maiores (ou seja, peixinho, Carassiusauratusauratus) . Em 2000, Fauconneau e Paboeuf otimizado uma cultura de mioblastos primário para truta arco-íris 59, e minoroptimizations made que o protocolo utilizável em vários peixinhos menores do clade Danioninae (peixe-zebra, Danio rerio, e Danio gigante, Devario aequipinnatus) 32, devido às muitas ferramentas genéticas disponíveis para o trabalho do peixe-zebra e, portanto, seus parentes próximos. Peixes teleósteos são organismos atrativos para estudo devido à sua estratégia de crescimento divergentes (pelo menos na maioria das espécies). Grandes salmonídeos, como a maioria dos peixes, crescer indeterminadamente, com potencial de crescimento desenfreado por uma assíntota na maturidade, mesmo em idade avançada 60-62. Ao contrário de peixe-zebra, grandes danionins como o Danio gigante 63 e potenciais de crescimento exibição Danio moustached típicos de peixes teleósteos, tornando a sua justaposição direta uma plataforma ideal para a compreensão se escolha o destino da célula MPC desempenha um papel na hiperplasia do músculo esquelético contra hipertrofia. Da mesma forma, temos demonstrado que este protocolo pode ser utilizado com ratos e axolotls, com rendimento relativamente alto celular e VIABíndices ILIDADE. Salamandras Urodelos, como a axolotl mexicano (Ambystomamexicanum), possuem a notável capacidade de regenerar tecidos, incluindo membros e caudas 64-66 inteiras. Esta característica faz com que esses anfíbios modelos interessantes de perda de massa muscular esquelética e envelhecimento. Usando o protocolo descrito abaixo, uma abordagem similar pode ser efectuada, como foi feito em muitas espécies de peixes, fornecendo um contexto comparativo ainda maior de tais estudos. Como muitos biólogos verdadeiramente apreciam comparativos, os avanços mais significativos em biologia básica e translacional biomedicina pode ser feita quando os dados são analisados ​​dentro do mais amplo espectro (aqui, toda a linhagem dos vertebrados).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

Devido à dificuldade e tempo inerente envolvido com o estudo do programa miogênica in vivo, sistemas de cultura primários derivados das células-tronco adultas residentes do músculo esquelético, as células precursoras miogênicas (PPM), têm se mostrado indispensável para a nossa compreensão do desenvolvimento do músculo esquelético de mamíferos e crescimento. Particularmente entre a taxa basal de vertebrados, no entanto, os dados são limitados descrevendo os mecanismos moleculares que controlam a auto-renovação, a proliferação e diferenciação de PPM. De particular interesse são potenciais mecanismos que estão na base da capacidade de vertebrados basais a sofrer considerável postlarval esquelético myofiber hiperplasia (ou seja, peixes teleósteos) e regeneração completa após perda apêndice (ou seja Urodelos anfíbios). Além disso, o uso de mioblastos em cultura pode ajudar na compreensão da regeneração e da recapitulação do programa miogénica e as diferenças entre eles. Paraeste fim, que descrevem em pormenor um protocolo robusto e eficiente (e variações neles) para isolar e manter PPM e sua descendência, mioblastos e de miotubos imaturas, em cultura celular, como uma plataforma para a compreensão da evolução do programa miogénica, começando com o mais vertebrados basais. Capitalizando sobre o status organismo modelo do peixe-zebra (Danio rerio), relatamos a aplicação deste protocolo a pequenos peixes do clado ciprinídeo Danioninae. Em paralelo, este protocolo pode ser utilizado para realizar uma abordagem comparativa mais ampla, isolando PPM do axolotl mexicano (Ambystomamexicanum) e até mesmo roedores de laboratório. Este protocolo é agora amplamente utilizados no estudo myogenesis em várias espécies de peixes, incluindo a truta arco-íris, salmão e besugo 1-4.

Vinte e quatro horas após a sementeira, as células precursoras miogénicos (PPM) deve ser visível ligado ao substrato de laminina (ver as figuras 1a e 1d). Após a sementeira, as células (PPM) adoptar uma forma fusiforme, indicativo desse tipo de células (Figura 1) e são MyoD1 + (Figura 2). Na espécie Danio, PPM parecem ser mais compacto, com processos bipolares menores do que os PPM de espécie Oncorhynchus e Salmo. No...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a identificação de mecanismos reguladores conservadas e divergentes ao longo as linhagens de vertebrados.

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K visualizações.  University of Alabama at Birmingham.  A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferencia...

Vídeo: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biologia

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...