Gostaríamos de agradecer a Sarah Dick para a prestação de leitura crítica e comentários. MAR detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá em Genética Molecular e é um estudioso de Pesquisa Internacional do Howard Hughes Medical Institute. Este trabalho foi financiado por doações para MAR dos Institutos Nacionais de Saúde, do Howard Hughes Medical Institute, dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Associação de Distrofia Muscular e do Canadá Research Chair Programa.

Todos os experimentos foram tratadas de acordo com a Universidade de Ottawa regulamentos para cuidados com os animais e manuseio. Ver Tabela 1 para uma visão geral do protocolo. 1. Antes de iniciar o isolamento <ol><li> Prepare as seguintes soluções: A colagenase do tipo I de 0,2% em DMEM (meio de Dulbecco modificado por Eagle; glucose elevada, L-glutamina, com 110 mg / ml de piruvato de sódio). Para dois músculos EDL preparar 2 ml de Collagenease 0,2% em DMEM. Filtrar a solução através de filtro de 0,22 ^ m. 10 min antes do isolamento, Pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. Alíquotas adicionais de colagenase não diluído pode ser congelada a -20 ° C para uso posterior. Nota: utilizar DMEM com piruvato de sódio ao longo de todo o processo. Fibras não sobrevivem em meio de sódio-piruvato livre. <ul><li> A lavagem de mídia (usar para executar todas as lavagens). Suplemento DMEM com 1% de Penicilina / Estreptomicina. Filtrar com 00,22 uM de filtro antes do uso. </li><li> Meios de Cultura de miofibras. Suplemento DMEM com FBS a 20% de extracto de embriões, 1% de galinha e 1% de Penicilina / Estreptomicina. Filtrar através de filtro de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Matrigel pratos revestidos. Para fibras de cultura para longo período de tempo, recomendamos a utilização Matrigel como substrato de revestimento. Para preparar Matrigel pratos revestidos, descongelar uma aliquota de Matrigel, a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, diluir 1:10 em DMEM Matrigel. Matrigel manter a 4 ° C em todos os momentos e evitar mudanças bruscas de temperatura, pois isso irá criar cristais microscópicos na solução resultando em Matrigel revestimento desigual. Pratos lugar para ser revestido em gelo. Pratos casaco com volume suficiente para cobrir a superfície. Deixe descansar por 1 min. Remover completamente o Matrigel sobra. Deixe pratos seco a 37 ° C durante pelo menos 3 horas antes da sua utilização ou durante a noite. </li></ul> Nota: aliquotas de Matrigel diluída pode ser re-utilizada várias vezes para fins de revestimento, se armazenado a 4 &amp; deg; C. </li><li> Por último, não se esqueça de limpar a estação de microscópio e ferramentas de dissecação com etanol 70%. </li><li> Por dois isolamentos EDL (um rato) preparar cinco pratos de Petri de plástico (60 * 15mm) como segue: <ul><li> Quatro pratos para o isolamento (1 para o músculo dissociação, 3 para lavagens de série). Todos os pratos devem ser revestidos com soro de cavalo (HS) para evitar miofibras de se ligarem ao plástico. Para revestir, pipeta de 3 ml de soro de cavalo em cada prato redemoinho, para permitir o revestimento mesmo, remover o soro de cavalo e deixar que o prato seco durante pelo menos 30 min. Adicionar 4 ml de DMEM a cada placa. Mantenha pratos a 37 ° C em 5% de uma incubadora de CO 2 antes da sua utilização. </li></ul> Nota: soro do cavalo pode ser re-utilizada várias vezes, se mantidas estéreis. Alternativamente, uma solução de HS a 10% em DMEM pode ser utilizado para revestir os pratos. Use pratos SH revestidos durante todo o protocolo de cultura e miofibras quando em condições de flutuação. <ul><li> Um prato será utilizado para miofibras de cultura, após o isolamento. Alttamanhos prato ernative ou formatos pode ser utilizada para a cultura final de miofibras dependendo aplicações a jusante. No entanto, não sugerem prato tamanhos maiores do que 60 * 15 milímetros. Miofibras podem ser mantidas em suspensão durante não mais do que 96 horas antes de contração hiper ocorre. Por vezes mais cultura, recomendamos o uso de Matrigel pratos revestidos ou placas. </li></ul></li><li> Para um isolamento de fibra (2 EDL), preparar duas pipetas de Pasteur estéril: uma pipeta de grande diâmetro para manipulação muscular e uma pipeta de diâmetro pequeno para a manipulação de células musculares. Use uma caneta de diamante para cortar cada pipeta de vidro para o comprimento desejado e polonês calor para suavizar as bordas da pipeta. Ao utilizar a chama, o ponta curva da pipeta pequeno furo. Isso vai ajudar a lidar com fibras individuais. Chama para esterilizar. Brasão pipeta cada um com HS antes do uso. </li></ol> 2. Dissecção muscular e digestão <ol><li> Para efeitos dessas experiências, de 8 semanas de idade SV129, Pax7 creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) e Myf5-Cre; Rosa26YFP foram utilizados. </li><li> Pulverizar membros posteriores com etanol a 70%. Pin o animal (o rosto) para uma placa de apoio para ter uma melhor compreensão do membro posterior durante o procedimento. </li><li> Com a ajuda de uma tesoura, corte através de todo o comprimento do membro e expor o músculo subjacente. Remova a pele, bem como todo o cabelo ou da pele (Figura 1A). </li><li> Com uma tesoura fina, corte através da fáscia fina, sem danificar os músculos subjacentes. Visualmente localizar o EDL. O EDL é encontrada no compartimento anterior do membro posterior, imediatamente abaixo do músculo tibial anterior (TA). </li><li> Com a ajuda de duas pinças, expor os tendões distais. </li><li> Corte os tendões distais (tanto do TA e EDL) com afiadas tesouras Cohann-Vannas primavera. </li><li> Com a ajuda de fórceps mantenha ambos TA e EDL músculos por os tendões e os músculos delicadamente puxar-se no sentido da extremidade proximal. Neste ponto, você deve ser capaz de ver claramentemúsculo EDL logo abaixo do músculo TA. Agora, separar a partir do músculo EDL TA puxando os dois tendões em sentidos opostos (Figura 1B). Evite alongamento do músculo EDL ao executar esta operação pois isso irá danificar as fibras musculares. </li><li> Expor o tendão EDL. Para melhor visualizar o tendão proximal pode ajudar neste momento para remover o músculo TA. Também pode ajudar a cortar algum tecido conectivo em torno do joelho (Figura 1C). </li><li> Cortar o tendão proximal e retire cuidadosamente o EDL (Figura 1D). </li><li> Mantendo o músculo por meio de seus tendões, transferi-lo para 2 ml de solução de colagenase previamente preparada. Incubar a 37 ° C num banho de água. Nota: para o isolamento de fibras de sucesso, é importante isolar a EDL a partir do tendão de tendão de modo que a integridade da fibra muscular é mantida. Passos 2,3-2,9 pode ser realizada sob um microscópio de dissecação. Como alternativa, o uso de um magnlificação de vidro também pode ajudar a ter uma melhor visão dos músculos. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,9 para isolar o EDL segundo. Transferir o EDL em segundo lugar no mesmo tubo. Para evitar a digestão irregular, o isolamento do segundo EDL deve ser completado não mais de 5 minutos após a primeira. Nota 1: O tempo de incubação pode ter de ser ajustada em função da actividade da colagenase. De incubação mais longo ou mais curto pode ser necessária, dependendo do tamanho, idade e / ou condição do músculo (por exemplo, músculos precisam de tempo mais longo fibróticas digestão). Nota 2: Se examinar o comportamento das células satélite em condições de quiescência, agitação durante o tempo de digestão muscular pode ativar as células satélites 10. </li><li> Durante o tempo de digestão, visite regularmente o músculo para evitar o excesso de digestão. Pare a digestão quando os músculos começam a relaxar e miofibras são visíveis. Para parar a digestão, transferir cuidadosamente ambos os músculos para uma placa de Petri, pré-aquecido com 4 ml de DMEM (dissociatino prato). Use a pipeta tamanho grande diâmetro para realizar esta operação. Nota: evitar overdigestion muscular, o que resulta inevitavelmente em isolamento de hiper miofibras contratados. </li></ol> 3. Único miofibras Dissociação e Cultura <ol><li> Para liberar miofibras, use a pipeta de vidro de grande diâmetro para lavar o músculo com meio morna até fibras naturalmente começam a ser liberados. Não triturar o músculo como isso vai resultar inevitavelmente em fibras prejudiciais. Execute este e os seguintes passos sob um microscópio de dissecação. </li><li> Continuar lançando miofibras até que o número desejado seja alcançado. Se o prato é necessária, à temperatura ambiente durante mais de 10 min a 5 min permitir (mínimo) de incubação a 37 ° C, 5% de CO 2 para re-equilibrar o meio. Observação: se o meio atinge temperaturas abaixo fisiológica (37 ° C) durante um período de tempo prolongado miofibras morrerá. </li><li> Utilizando o tamanho pequeno furo pipeta, transfer viver miofibras simples para um novo prato pré-aquecido (primeira de três lavagens consecutivas). Lidar com cada fibra muscular individualmente em vez de transferir em massa de fibras musculares de uma só vez. Se necessário, incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 10-15 minutos para re-equilibrar o meio. </li><li> Repetir o passo 3.3 para mais 2 vezes ou até que todas as fibras musculares mortas e detritos são removidos. Recomendamos pelo menos três lavagens consecutivas para adequada limpeza. Nota: miofibras mortos aparecerá tão curto e hiper contratada sob a luz do microscópio. </li><li> Incubar miofibras individuais a 37 ° C, 5% de CO 2 no prato última lavagem (DMEM apenas) durante pelo menos uma hora antes de mudar para o meio de cultura. Isto permite ajustar a miofibras as condições in vitro, na ausência de soro. Nós descobrimos que a cultura imediato de miofibras em meio rico soro aumenta o encolhimento das fibras. </li><li> Após uma hora, a transferência de miofibras um prato pré-aquecido ou novo para o formato de cultura apropriadodependendo da aplicação a jusante. Fibras de cultura em meio de soro de alta para permitir a ativação de células satélites. Alternativamente, diferentes concentrações de soro ou extractos de embrião de galinha podem também ser usados. Alterar médio em dias alternados. </li></ol> 4. Aplicações jusante <ol><li> Imunocoloração. Miofibras vivo podem ser fixadas e coradas em qualquer ponto de tempo durante o isolamento. Imunofluorescência podem ser realizadas tanto em miofibras flutuantes e substrato anexado. Se a coloração miofibras flutuantes, utilizar uma pipeta de vidro de pequeno diâmetro para transferir miofibras de uma solução para a outra. Em alternativa, é possível manter miofibras no mesmo poço ao longo de todo o procedimento e adicionar / remover soluções utilizando uma pipeta de vidro. Evitar a aspiração normal como isso vai resultar na remoção das fibras musculares, bem. Resumidamente, remover completamente o meio de cultura; miofibras fix em paraformaldeído a 4%, pré-aquecido (PFA), durante 5 min. Extensivamente lavar em tempos vários PBS. Incubaçãote em miofibras de glicina a 1% em PBS ou outras soluções de têmpera padrão para minimizar o PFA coloração de fundo. Se necessário, permeabilizar miofibras com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 min, seguido por uma lavagem de 5 minutos em PBS. Incubar as fibras em solução de bloqueio (10% de soro de cavalo, 0,1% de Triton X-100, 1% NaN) durante 1 hora à temperatura ambiente ou, de preferência durante a noite a 4 ° C. Soluções alternativas de bloqueio pode ser utilizado, dependendo do anticorpo de interesse. Lavar uma vez com PBS durante 5 min. Incubar com o anticorpo primário apropriado diluído em solução de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes em fibras 5 min por lavagem com PBS para remover qualquer anticorpo não ligado. Incubar com o anticorpo secundário adequado, durante 45 minutos a 1 h à temperatura ambiente. Lavar 3 vezes em 5 minutos por lavagem em PBS. Contracoloração núcleos com 1 mg / ml DAPI. Se corar fibras flutuantes, transferir cada fibra a uma lâmina de vidro para microscópio adequado. Retire o excesso de PBS ou médio prazo. Aplicar montagem medihum e adicione lamela. Avance para visualizar miofibras sob um microscópio de fluorescência. Ver Figura 4 para imunofluorescência representante no miofibras EDL. Procedimentos de coloração que utilizam fixadores alternativos mais fortes encontram-se descritos em Verma, M. et al. 11 e Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonucleótido ou plasmídeo de transfecção transiente. Miofibras vivo podem ser transfectadas com plasmídeo ou siRNA para gene específico / s de interesse. Ao usar siRNA, transfecção dupla é recomendado para knockdown do gene eficiente. Sugerimos realizar a transfecção primeira após 8 horas a partir do isolamento. Seis horas após a transfecção, substitua por meio fresco. Para a transfecção siRNA, sugerimos iniciar usando uma concentração final de 50 nM. Knockdown expressão do gene pode ser analisado por extração de RNA ou, preferivelmente, por imunocoloração. </li><li> Infecção viral. Infecção de miofibras vivos é possível embora a incidência de célulamorte é maior do que com o oligo de transfecção e a eficiência da infecção pode ser variável, dependendo das condições do músculo e da idade. Por exemplo, fibras musculares dos músculos adultos intactos são particularmente não responsivo a infecção viral, devido à presença da lâmina basal, que foi mostrado para proporcionar uma barreira de protecção contra a infecção pelo anfitrião 13, 14. Lentivirais são preferidos sobre os vectores retrovirais, pois eles podem infectar células quiescentes (mitótica não). Para infecção viral, é aconselhável que as fibras em um prato de cultura revestido com Matrigel ou placa e deixar miofibras ajustar às condições de media para o primeiro 24 hr. </li><li> Viver Imaging. Vivo imaging de miofibras é particularmente demorado e necessita de um microscópio equipado com um 37 ° C, 5% de CO 2 da câmara. É útil quando se avalia o comportamento das células satélites individuais. Trabalho feito com essa técnica tem sido fundamental para a descoberta da heterogeneidade da célula satélite e estudar sua BehaVior sobre as fibras (15 e 16). </li></ol>

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G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. 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Não há interesses conflitantes.

O isolamento e cultura de miofibras individuais a partir de músculos intactos fornece um excelente modelo in vitro para estudar o processo de regeneração muscular. Uma característica única do presente sistema é a preservação de células satélites no seu ambiente fisiológico abaixo da lâmina basal. Mais importante, a técnica pode ser utilizada para investigar o comportamento de células estaminais musculares, tanto quiescência e estados activados. Ao longo dos últimos 20 anos, o sistema de cultura de células musculares forneceu introspecções significativas sobre a biologia da população de células satélite em relação a ambos os determinantes intrínsecos e extrínsecos. Por fibras musculares individuais de cultura, a heterogeneidade de células satélites em relação à fibra muscular, tipo de músculo ou potencial regenerativo foi abordada 15. Elaborar estudos usando imagens ao vivo de um único fibras cultivadas permitidos para as informações sobre o padrão de satélite ganhando a migração de células 16. A aquisição de dados é um quantitativoslso possível. Embora demorado, que fornece informações importantes sobre a distribuição e a ocorrência de eventos específicos (células estaminais rácio divisão proliferação, diferenciação e assimétrico, etc.) Juntamente com as aplicações acima descritas, a proteína ou a extracção de ARN a partir de fibras individuais é também possível, embora o isolamento da população pura de células satélites por FACS ou outros meios podem proporcionar uma melhor plataforma para investigar mudanças de expressão de proteínas ou genes num nível molecular. Em nossa experiência, o passo mais importante para o isolamento de fibra de sucesso é o &quot;tendão para tendão&quot; isolamento (passos 2,5-2,9 no texto do protocolo). Isto garante que, após a digestão do músculo, as fibras são libertadas a partir do EDL com danos mínimos ou sem aumentando assim o seu desempenho nas etapas seguintes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente / Material </td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Prepare frescos todos os momentos para melhores resultados. Alíquotas adicionais de colagenase não diluído pode ser armazenado a -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM alta glicose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Adição de Pen / Strep é necessário para minimizar a contaminação do ar </td></tr><tr><td> Caracterizado soro fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lote # KUJ35152 </td></tr><tr><td> O soro de cavalo </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lote # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Extrato de embrião de galinha </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Evitar o congelamento-descongelamento ciclos. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Alíquotas de armazenar a -20 ° C. Evitar o congelamento-descongelamento ciclos. Armazenar aliquotas diluídas a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Scissor Primavera 6 milímetros Lâminas-Straight-Sharp </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Iris extra fino Tesoura-10,5 centímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Íris Fórceps Curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipetas </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamante Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm prato de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 uM filtro </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Uma fonte de luz adicional pode ser necessário para ter uma visão melhor foco </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Regeneração muscular no adulto é realizada por células estaminais residentes chamadas células satélite. Células satélites são definidas pela sua posição entre a lâmina basal e o sarcolema de cada fibra muscular. O conhecimento científico actual do seu comportamento fortemente dependente da utilização do protocolo de isolamento única fibra muscular. Em 1985, Bischoff descrito um protocolo para isolar as fibras individuais em directo da flexor Brevis (FDB) de ratos adultos, com o objectivo de criar um sistema in vitro em que a associação física entre a fibra muscular e as células estaminais são preservados os seus 1. Em 1995, o protocolo Rosenblattmodified Bischoff tal que as miofibras são individualmente colhidos e tratados separadamente, após digestão com colagenase em vez de serem isolados por sedimentação por gravidade 2, 3. O Rosenblatt ou Bischoff protocolo já foi adaptado para diferentes músculos, idade ou condições 3-6. A técnica de isolamento é uma única fibra muscular indispensávelferramenta devido suas vantagens únicas. Em primeiro lugar, no protocolo fibromuscular único, as células satélites são mantidas abaixo da lâmina basal. Esta é uma característica única do protocolo como outras técnicas, como a classificação de fluorescência celular ativado exigem química e mecânica do tecido dissociação 7. Embora o sistema de cultura de fibra muscular não pode substituir para estudos in vivo, ele oferece uma excelente plataforma para abordar relevantes propriedades biológicas de células-tronco musculares. Miofibras individuais podem ser cultivadas em condições normais de revestimento, ou em condições de flutuação. Células satélites em miofibras flutuantes são submetidos a praticamente nenhuma influência diferente do ambiente de fibra muscular. Rigidez do substrato e do revestimento têm sido mostrados para influenciar a capacidade de células satélites &quot;para regenerar músculos 8, 9 de modo a ser capaz de controlar a cada um destes factores de forma independente permite a discriminação entre nicho-dependentes e independentes de respostas. Diferentes concentrações de soro têmTambém foi mostrado para ter um efeito sobre a transição da quiescência da activação. Para preservar o estado de quiescência das suas células satélites associados, as fibras devem ser mantidas em meio de soro baixo 1-3. Isto é particularmente útil quando se estuda os genes envolvidos no estado de repouso. Em meio rico soro, as células satélites ativar rapidamente, proliferam, migram e se diferenciar, assim, imitando o processo regenerativo in vivo 1-3. O sistema pode ser utilizado para realizar uma variedade de ensaios, tais como o teste de inibidores químicos; expressão ectópica de genes de vírus da entrega; gene baseada oligonucleótido knock-down ou imagens ao vivo. Este artigo descreve o protocolo de vídeo utilizado atualmente em nosso laboratório para isolar miofibras simples do extensor longo dos dedos (EDL) músculos de camundongos adultos (6-8 semanas de idade).

Aqui descrevemos o isolamento de miofibras individuais a partir do músculo EDL de camundongos adultos. Miofibras sucesso produzir depender de vários fatores, tais como a atividade da colagenase ou condições musculares ou idade. Mais importante ainda, o isolamento do músculo do tendão para resultados de tendão em comprimento, miofibras intactas de músculo EDL. Figura 1 mostra uma passo a passo representação gráfica do &quot;tendão para tendão&quot; isolamento. Uma vez que o músculo é totalmente digerido, miofibras são libertados pela aplicação de uma pressão suave para o músculo. Figura 2A mostra uma imagem representativa de um experimento de isolamento de fibra muscular após a primeira lavagem. Neste ponto, a cultura contém uma mistura de feixes de fibras musculares individuais que aparecem como longas e brilhantes estruturas tubulares, hiper contraído miofibras que são escuro e curto e detritos a partir do processo de digestão. Para o fim de, pelo menos, três lavagens consecutivas, apenas simples miofibras vivos devem permanecer na dish para a cultura ou a análise a jusante (Figura 2B). A Figura 2C mostra uma fibra longa, ao vivo, em comparação com uma fibra de hiper contraído (C &#39;). No momento do isolamento, as células satélites aparecem como pequenas saliências na superfície de fibra muscular (Figura 3A). Se mantidas em meio rico de soro, as células satélites activar, proliferam, migram e eventualmente fundir em miotubos (B). Após 15 dias de cultura, todos os miotubos expressar o Myf5 repórter YFP (C) o que sugere que a regeneração muscular no adulto é realizada por células que, em algum momento durante o seu desenvolvimento exprimiram o factor determinante miogênica Myf5. Todas as células satélites expressar o fator de transcrição emparelhado caixa Pax7 17. A linha de rato repórter Pax7Cre-TdTomato pode ser utilizado para rastrear as células satélite através da expressão do sinal TdTomato fluorescente (Figuras 3D e E). Figura 4 mostra um representante IMMUnofluorescence da dupla Pax7 + / células satélites MyoD. Classicamente dupla Pax7 + / + MyoD células satélites são considerados proliferativas progenitores musculares comprometidos, que quer concluir o programa de diferenciação por baixo regulação Pax7 mantendo expressão MyoD ou retorno à quiescência por baixo regulação MyoD e manter Pax7 expressão 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Isolamento músculo EDL de rato dos membros posteriores. Um dos membros posteriores. De um rato adulto 8 semana de idade. Setas indicam o tendão (joelho) eo tendão distal (pé) proximal. B. Posição anatômica do músculo tibial anterior (TA) e extensor longo dos dedos (EDL) muscular. C. Ao segurar o EDL através do tendão proximal, o músculo é puxado para o joelho para expor o tendão distal. D. O tendão distal écortadas ea EDL é liberado. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Os resultados representativos de uma única experiência de fibra muscular isolamento. A. Imagem de campo brilhante de uma experiência de isolamento de fibra muscular na etapa a primeira lavagem. Seta vermelha indica miofibras ao vivo, seta branca indica hiper miofibras contratados e seta amarela indica células, células musculares ou detritos ECM. B. Após lavagens consecutivas em DMEM, apenas miofibras vivo permanecem. C e C &#39;. Imagem representa uma longa intacto vivo fibromuscular (C) e uma hiper curto contratada fibra muscular (C &#39;). Bar de 10 um. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figur<html> e 3. Os resultados representativos de uma única experiência de fibra muscular cultura. Uma. Imagem campo brilhante de uma fibra muscular, único vivo com seu celular via satélite associado (seta), logo após o isolamento (Tempo 0). B. Miofibras individuais foram plaqueados em Matrigel e cultivadas em meio rico de soro durante 15 dias. Seta branca indica miotubos diferenciadas em comparação com as células individuais (seta amarela) c. Miofibras individuais de um Myf5Cre; rato RosaYFP foram cultivados como em B. A seta indica a Myf5 miotubos derivados. D e E. Miofibras individuais de Pax7Cre; TdTomato foram isoladas e fixadas logo após. As setas indicam Pax7 células satélites quiescentes positiva (E, vermelho). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (D). Bar: 50 ^ m. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. maneiras &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Exemplo de coloração por imunofluorescência de células satélites em miofibras. Miofibras individuais foram isoladas e cultivadas durante 72 horas em condições de flutuação. Células satélites em miofibras foram marcadas para o satélite célula específica marcador Pax7 (B, vermelho) e do fator miogênico MyoD regulamentar (C, verde). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (A). Barras: 50 ^ m. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> A dissecção do músculo (5 min cada músculo) </td><td><ul><li> Tendão para tendão isolamento </li><li> Ferramentas afiadas </li><li> Dano muscular mínima </li></ul></td></tr><tr><td> Digestão muscular (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturasensível </li><li> Evite overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Isolamento de fibra </td><td><ul><li> Evitar o excesso de manipulação de fibras </li><li> Eliminar os detritos com várias lavagens </li></ul></td></tr><tr><td> Cultura de Fibra (até 3-4 semanas) </td><td><ul><li> Formato: qualquer </li><li> Revestimento: soro de cavalo, Matrigel </li><li> Meio: basal ou elevado soro </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral do protocolo de isolamento de fibra muscular. O protocolo de isolamento de fibra muscular consiste em 4 passos principais. Para cada etapa, o tempo aproximado e os principais pontos críticos são discutidos. Para uma discussão detalhada de cada etapa, consulte o texto do protocolo.

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão ouro<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar a passagem de células através da activação de satélite quiescência e a diferenciação. É importante notar que o sistema de cultura de células musculares único preserva a associação de células fibromuscular / haste, que é um componente essencial do nicho de células-tronco do músculo.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

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Biology

62.1K visualizações.  Ottawa Hospital Research Institute. Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão ouro In vitro Sistema para estudar a passagem de células através da activação de satélite quiescência e a diferenciação. É importante notar que o sistema de cultura de células musculares único preserva a associação de células fibromuscular / haste, que é um componente essencial do nicho de células-tronco do músculo.

Vídeo: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...