We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

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The authors have nothing to disclose.

Aqui, apresentamos abordagens Phenomic para a caracterização funcional de genes de fago putativos. As técnicas incluem um ensaio desenvolvido capaz de metabolismo anabólico monitorização hospedeiro, as placas multi-fenótipo de ensaio (MAPs), em adição ao método estabelecido de metaboloma, capaz de efeitos no metabolismo catabólico de medição. Nós fornecemos ferramentas adicionais para gerenciar os grandes conjuntos de dados resultantes destas tecnologias, permitindo uma alta taxa de transferência de processamento e análise 24. Por último, através da comparação de uma proteína capsídeo anotada fago, fago thioredoxin, dois genes metabólicos fagos putativos, e que a resposta experimental média propomos várias estratégias para interpretar ambos os conjuntos de dados e categorias de genes, com ênfase na identificação de tendências fenotípicas e identificação de outliers. Como mencionado, as duas abordagens medir quantitativamente apenas metade do metabolismo de acolhimento. Para interpretar a função relativa de qualquer um dosnovas proteínas sob investigação, os dados de ambos os métodos é obrigado a fornecer provas de função. Enquanto isso não é um foco de nosso manuscrito atual, saídas de dados de cada método phenomic é colocada através de análises combinatórias que se concentram em técnicas de agrupamento, como floresta aleatório e análise de componentes principais. Além disso, as hipóteses resultantes da análise combinada deve ser posteriormente validada por metodologias genéticas tradicionais. Finalmente, os métodos apresentados são fortemente influenciados pela fisiologia bacteriana e, portanto, seguir as mesmas normas. Ao proceder a qualquer método, considerações devem ser feitas para garantir grupos independentes, clonais são experimentadas; evite a contaminação; uma única variável está sendo testado; e controles apropriados estão sendo correu simultaneamente. A falha em conta para esses pontos irá resultar em resultados pouco claros, semelhante a qualquer ensaio fisiológico. Multi-placas de ensaio fenótipo(Mapas) O desenvolvimento de mapas proporciona um elevado rendimento e adaptável ensaio em comparação com as tecnologias actualmente disponíveis (Figura 5A e Tabelas 1,2). O ensaio utiliza suprimentos, equipamentos e técnicas fundamentais disponíveis em todos os laboratórios de microbiologia. A incorporação de um oleoduto computacional, PMAnalyzer 24, para posterior processamento e análise de dados assegura uma leitura de dados rápido. Além disso, ambos os aspectos experimentais e analíticas de a abordagem pode ser facilmente ajustado ou sintonizado para fins personalizados. Por exemplo, se uma grande proporção dos dados não passar de filtragem descrito no ponto 4, pode-se peneirar manualmente através das curvas de crescimento para identificar problemas. Se o problema surge devido a rigorosos parâmetros de filtro, ajustes no script pode ser feita. Em alternativa, se os problemas estão associados com o processo experimental (isto é, a condensação prolongada; imprópria transferência de cel bacterianals, etc), então repetições adicionais podem ser facilmente repetido. Conforme descrito na Cuevas et al. 24, o PMAnalyzer é um único programa festança escrito como um script que executa os certificados de análise e de análise como um gasoduto coesa, automatizado. Todos os scripts são livremente acessível a partir de um repositório Git a 25 por determinar o valor médio para cada ponto de tempo através de dados triplicado, e, posteriormente, parametriza a curva logística para obter o tempo de latência, taxa de crescimento máxima, asymptote, e um romance prazo, nível de crescimento. O valor médio foi escolhido em detrimento do significativo no nosso estudo para reduzir o efeito de grandes valores aberrantes, no entanto, o certificado pode ser facilmente adaptado para calcular a média de dados em duplicado. Devido à reduzida variação (SE) visto através de dados em duplicado (Figura 2A) que manteve o uso da mediana no PMAnalyzer para ajuste de uma curva logística. Além disso, o ponto de corte para o crescimento neste estudo (GL ≥ 0,4) foi determined comparando como dados separados entre nível de crescimento e taxa de crescimento máximo (Figura 1A, B). Dependendo do modelo de instrumentos e sistema utilizado este termo pode variar, requerendo redefinição deste cortado valor. Uma grande vantagem do nosso ensaio é a capacidade para comparar fenótipos usando um único parâmetro que caracteriza o crescimento microbiano em geral, que definimos como nível de crescimento (OG). GL é uma média harmónica, e portanto mitiga os efeitos de grandes valores extremos nos dados. A utilização de uma média harmônica com os valores-equipados logísticos deslocado para fornecer um resumo de crescimento foi formada através de tentativa e erro. Outros métodos tentou diferenciar crescimento foram: tempo que levou para chegar a parâmetros específicos de curva (meia μ max, μ max, e capacidade de carga), o coeficiente de determinação (R 2), e combinações de R 2 multiplicado por parâmetros da curva específicos. Usando uma média harmônica com deslocouvalores logística-fit para o GL proporcionou a maior gama na avaliação de crescimento, assim, tornou-se o método de escolha. Uma consideração a ser observado é que os padrões da curva de crescimento dinâmicos têm o potencial de se perder quando se utiliza um único parâmetro ou um modelo ajustado. Por exemplo, os parâmetros da curva individuais da curva logística e GL sejam incapazes de representar crescimento bifásica. Em um ambiente único de carbono, este efeito sobre o crescimento implica mediação da proteína virai em qualquer conversão do substrato ou mudança de utilização do substrato. Efeitos adicionais potencialmente perdidos ao não considerar vários parâmetros de crescimento incluem: tempo de latência prolongada, propondo um aumento da carga de máquinas ou produtos viral; rápida aceleração fase exponencial, sugerindo proteínas virais acoplados a sediar vias de produção de energia; ou níveis mais elevados de biomassa, o que implica a formação de apoio viral no hospedeiro e a absorção de nutrientes anabolismo (dados não mostrados). Assim, traçando curvas de crescimento nascentes ( <strong&gt; Figura 2A, B) fornece informações sobre as tendências ao longo do tempo enquanto o GL tem em conta as principais variáveis ​​do modelo logístico, fornecendo um único número quantitativo para representar o sucesso global de um clone. Ao considerar as diferentes respostas contribuíram por genes estruturais e metabólicas nos mapas, observa-se que as diferentes classes de substrato em questão fornece a maior evidência para a função da proteína. Por exemplo, as proteínas metabólicas são frequentemente associados com a aquisição de nutrientes limitantes, que são inespecíficos para sediar 16,32 metabolismo central. MAP experiências preliminares revelam que os clones ancorando genes de fago metabólicas putativos têm um aumento da fase de retardamento quando cultivada em fontes de carbono metabolismo central (Figura 2A). Por outro lado, os clones portadores de genes estruturais putativas, que exigem grandes proporções de piscinas de energia anfitrião e dNTP, resultar em uma resposta falso positivo no crescimento de centosubstratos metabolismo de carbono ral e de aminoácidos. Isto é provavelmente devido à acumulação de proteínas insolúveis resultantes filamentação no hospedeiro e / ou corpos de inclusão, tal como observado por microscopia (Figura 2A e dados não mostrados). Enquanto uma análise mais aprofundada é necessária para validar estes resultados preliminares, os mapas são capazes de recuperar as respostas fenotípicas que se correlacionam com a hipótese de funções das classes de genes de fagos específicos. Em adição para a elucidação das proteínas virais desconhecidos, os mapas são um romance recurso para investigar a diversidade funcional e metabólica de uma bactéria indivíduo ou uma comunidade de bactérias. MAP componentes são concebidos para alteração fácil de suportar o crescimento de uma gama de bactérias; incluindo marinho, auxotróficas, e os micróbios anaeróbicos. Para facilitar estes esforços a basal e pré-definido de crescimento media exigem espécies químicas adicionais ou ajustados antes de um género de bactérias diferentes podem ser apoiados nos mapas.Uma nota nesta uso dos mapas é manter a mídia definidas, que proíbe a utilização de ingredientes tais como triptona, extrato de levedura e peptona. Metabolomics O campo de metaboloma é dependente de bases de dados de metabolitos, que incluem metabolitos isolados identificados por espectrometria de massa. A instalação do núcleo aqui escolhido tem um dos maiores bancos de dados de metabolômica. É interessante notar que mais de metade dos metabolitos resultantes das nossas experimentações foram não identificável (~ 65%), enquanto outros nunca antes tinha sido registado na nossa hospedeiro, Escherichia coli (exemplos incluem: Indolo 3 ácido acético 33, ácido salicílico 34, e o ácido di-hidroabiético 35). Este facto pode ser atribuído a qualquer uma forte tendência no sentido da base de dados de metabolitos de planta, ou as proteínas específicas em investigação. Independentemente disso, o resultado é um número limitado de metabolitos conhecidos disponíveis para a representação de dados e análise. No future, vários métodos de metabolômica usando vários bancos de dados permitiria uma maior cobertura metabolito. Atualmente, ambos conhecidos e desconhecidos metabólitos são usados ​​quando comparando e contrastando as nossas proteínas virais novos. Usando essa abordagem, nós supor que os clones que albergam proteínas funcionalmente semelhantes compartilharão uma maior semelhança em seu perfil metabolômica completa. Análise metaboloma preliminares revelaram que enquanto que os genes estruturais e metabólicas não se separam claramente uns dos outros, os genes que exibem efeitos semelhantes no hospedeiro quando superexpresso se correlacionam (Figura 6). Por exemplo, os agrupamentos de genes Cápside anotados em estreita colaboração com os genes metabólicos putativos destaque neste estudo, EDT2440 e EDT2441. As investigações com um programa preditor topologia transmembranar e o péptido de sinal disponíveis publicamente mostrou evidência de que ambos os genes putativos metabólicas abrigar um único domínio transmembranar. Curiosamente 5 out of the nove clones no primeiro grupo de cluster (mais à esquerda da porção de dendrograma) previram domínios de transmembrana usando o mesmo programa de topologia. Investigações adicionais são necessárias, no entanto, é provável que os metabolitos presentes durante a sobre-expressão destes clones estão associados a resposta ao stress resultante da membrana celular ou cargas estruturais. Esta evidência suporta que, embora os dados de metabolômica possui uma maior quantidade de ruído, o método é capaz de destacar os sinais que diferenciam efeitos gerais de genes, dentro e através de uma classe de genes. Para determinar se o método é capaz de extrair a informação específica da função do gene, metabolitos foram agrupados em vias metabólicas específicas. O ser hipótese, se um clone afecta metabolitos específicos para um único percurso, em seguida, o gene sobre-expresso é activa em que via. Antes da criação do nosso pipeline de garantia de qualidade metabolômica, dados preliminares revelou que mais de umd metabolitos eram tipicamente sub-representados &quot;desconhecido&quot;, proporcionando pouca informação sobre os percursos que estão associados com (dados não mostrados). Metabolômica dados pré-processados, no entanto, revela que a maioria dos perfis de metabolitos são semelhantes e somente um número restrito de abundâncias metabolitos desconhecidos e conhecidos variar entre os clones, por exemplo, a putrescina e uracilo (Figura 6). Para proporcionar maior resolução de esforços a função da proteína são feitas experimentalmente para comparar os genes de fago contra novos genes de fago conhecidos, que podem ser utilizados para preencher os &quot;buracos&quot; de metabolito baseados caracterização funcional. Usando esta técnica, a função atribuída de genes virais conhecidos fornece uma referência para a função dos genes desconhecidos. No entanto, o fator limitante de análise metabolômica é o tamanho ea importância do banco de dados. Para corrigir essas limitações, bases de dados metabolômica relacionáveis ​​a esta pesquisa precisam ser desenvolvidas; talcomo uma base de dados de metabolitos e seus abundâncias especificamente a recolha de E. ASKA Os clones de E. coli, em que um único ORF 36 é sobre-expresso. Evidência para a necessidade de tais bancos de dados foi fornecido em 2013 quando pesquisadores da Lawerence Berkeley National Laboratory compilou o primeiro banco de dados abrangente de metabólitos específicos para bibliotecas inteiras de bactérias mutantes modelo 37. Esta pesquisa forneceu novos insights sobre genes necessários para a utilização de metabólitos específicos, revelando a clara conexão entre fenótipo e genótipo. Ao considerar metabolômica como uma ferramenta, é importante para definir o regime de processamento seguido na instalação do núcleo. Um artefacto de a maioria dos procedimentos experimentais é a variância do dia-a-dia, associada com os instrumentos de utilização. Até à data todas as análises GC-MS implementa a utilização de normas internas que estão incluídos em cada corrida analítica; no entanto, a adição de amostras internos específicos do projeto &lt;/ Em&gt; correu cada dia de experimentação remove variância adicional. Estas considerações devem ser abordadas com antecedência para evitar problemas de normalização e preconceitos. Outra solução é a processar todas as amostras em uma instalação de núcleo na mesma máquina e, como um único lote, uma opção disponível, em qualquer instalação de núcleo. As várias ferramentas ambos introduzidos e re-explorados neste manuscrito fornecer novos meios para rastrear e caracterizar genes de fago funcionalmente desconhecidos. A simplicidade e capacidade de adaptação das técnicas experimentais com o uso de dutos agilizar computacionais garante esses métodos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de esforços de pesquisa e campos. Nosso objetivo é que as abordagens Phenomic apresentados aqui vai ajudar outras investigações de proteínas de fagos novos, além de sistemas que são igualmente funcionalmente indefinido.

Os vírus que infectam bactérias (aka bacteriófago ou fago) são estimados de existir em mais do que 10 31, como partículas de vírus (VLP) globalmente e ultrapassam todos os outros organismos no ambiente de um 1,2. O primeiro estudo a investigar metagenômica as comunidades virais associadas a ambientes marinhos focada na quantificação da diversidade visto dentro da fração viral 3. Além disso, Breitbart e seus colegas descobriram que mais de 65% das sequências virais da comunidade compartilhada nenhuma homologia com as seqüências disponíveis em bases de dados públicas. Metagenomic estudos posteriores encontraram evidências semelhantes: metagenomes de sedimentos marinhos em San Diego, Califórnia conter 75% desconhecidos sequências virais 4; metagenomes de lagos hipersalinas do Mar Salton conter 98% desconhecidos sequências virais 5; e metagenomes associado de corais contêm 95-98% desconhecidos sequências virais 6. Esta acumulação de informação não anotadas resultou emmaterial genético do fago ser &quot;a matéria escura do universo biológico&quot; 7. Caracterização genômica de fago se baseia na identificação de similaridade de sequência através da comparação em bases de dados de ácidos nucleicos e de proteínas existentes. Porque a informação genética codificada-fago é predominantemente desconhecido, os métodos baseados em homologia são ineficazes. Dentro do seu genoma, fagos codificam tipicamente três tipos principais de genes: genes de transcrição e de replicação, genes do metabolismo, e os genes estruturais. Os genes de transcrição e replicação (classe I / II genes 8) incluem polimerases, primases, endo / exo-nucleases, e cinases. Estes genes são altamente conservadas devido à sua importância na infecção pelo fago, transcrevendo e replicar material genético do fago. Polimerases de fago são prontamente identificados utilizando métodos tradicionais de homologia de sequência, devido à sua conservação global 9 e ter sido mostrado para servir como marcadores filogenéticos eficazes 10.Em contraste, o fago metabólica e genes estruturais (genes II / III de classe 8) estão cada vez mais frequentemente divergente e anotada como genes hipotéticos. Fago genes metabólicos afectar a capacidade metabólica do hospedeiro e não são necessariamente necessário para a replicação virai. Estes genes, muitas vezes referidos como genes metabólicos auxiliares (11), AMGs parecem modular o metabolismo de acolhimento e permitir que a progressão óptima da infecção e do sucesso da maturação do virião. AMGs têm sido associados com a utilização e absorção de nutrientes limitantes ou em vias de produção de energia. Alguns exemplos incluem genes fotossistema encontrados nos genomas de vários cyanophage 12-16, os genes ligados ao metabolismo e regulados pelo fosfato de 17,18, e a utilização da via da pentose fosfato de fago dNTP biossíntese 18,19. Em comparação, os genes estruturais estão entre os meados de genes tardios produzidos durante a infecção e variam entre diferentes fago-hosistemas de st. A produção de proteínas estruturais são dependentes da disponibilidade de dNTP viral, e piscinas de energia para a sua transcrição, tradução e montagem 8. As proteínas da cápside de fibra e cauda estrutural são considerados como os mais divergentes de todos os genes que codificam proteínas virais e são necessárias para produção de viriões de sucesso. Sua divergência é tipicamente atribuído ao papel activo que desempenham na formação vírus-anfitrião coevolução 20. Proteínas divergentes, independentemente da classe de genes, são facilmente esquecido quando usando técnicas de homologia e alinhamento de sequências tradicionais. Um esforço para corrigir as limitações observadas com os rigorosos comparações de sequência resultou em ferramentas da bioinformática capazes de utilizar as características de sequências para determinar associação, tais como redes neurais artificiais 21. Redes neurais artificiais (RNAs) permitir a predição de genes estruturais e metabólicas, no entanto, necessitam de validação experimental jusante para caracterizar diretamentea função do gene. O objetivo deste artigo é o de fornecer protocolos Phenomic capazes de monitorar tanto o metabolismo anabólico e catabólico de uma bactéria hospedeira durante a expressão de um gene fago novela, funcionalmente previu através de RNAs. O campo de phenomics, a biologia associado com fenótipos celulares, está bem estabelecida na biologia de sistemas para ajudar na investigação de proteínas com função desconhecida ou pleiotrópico. Phenomic ferramentas são usadas para conectar informação fenotípica à informação genotípica. Nossa hipótese de genes de fago putativos que a sua função (s) podem ser determinadas através da observação de acolhimento efeitos fisiológicos durante a expressão do gene fago. Para investigar essa hipótese, foram escolhidos dois métodos quantitativos. Placas de multi-fenótipo de ensaio (MAPs) foram utilizados para monitorizar a utilização do substrato de acolhimento e a formação subsequente de biomassa, enquanto metaboloma medido diversidade metabolito hospedeiro e abundância relativa durante o crescimento em Environ específicacondições mentais. Proteínas estruturais e metabólicas putativos foram sobre-expressos em Escherichia coli e os resultados representativos de ambas as experiências são comparados. Inúmeras técnicas visuais e dutos de processamento de alto rendimento são apresentados para facilitar a replicação experimental. Por último, a reprodutibilidade e a precisão dos métodos apresentados são discutidos no contexto de efeitos fisiológicos esperado para uma proteína da cãpside e anotada proteína metabólica fago, tioredoxina, mais dois AMGs putativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Investigações em curso em interações fago-hospedeiro são dependentes de extrapolar o conhecimento a partir de (meta) genomas. Curiosamente, 60-95% de todas as sequências de fagos partes sem homologia com proteínas anotados actuais. Como resultado, uma grande proporção de genes de fagos são anotados como hipotética. Esta realidade afeta fortemente a anotação dos dois genes metabólicos estruturais e auxiliares. Apresentamos aqui os métodos Phenomic concebidos para capturar a resposta fisiológica (s) de um hospedeiro seleccionado durante a expressão de um destes genes de fago desconhecidos. Multi-fenótipo placas de ensaio (MAPs) são utilizados para monitorizar a diversidade de utilização do substrato de acolhimento e formação subsequente de biomassa, enquanto fornece metaboloma análise bi-produto através da monitorização abundância e diversidade metabolito. Ambas as ferramentas são utilizadas simultaneamente para proporcionar um perfil fenotípico relacionado com a expressão de um único fago putativo enquadramento de leitura aberto (ORF). Os resultados representativos para os dois métodos são comparadas, highlighting as diferenças perfil fenotípico de uma série transportar tanto genes de fago estruturais ou metabólicas putativos. Além disso, as técnicas de visualização e de alto rendimento condutas computacionais que facilitaram a análise experimental são apresentados.

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Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K visualizações.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.