Agradecemos aos autores de Robinson et al. 12, para suas contribuições para o manuscrito do qual este protocolo é parcialmente derivado.

O uso de animais são aprovados pelo Oberlin College Animal Care Institucional e Use comissão e estão em conformidade com o Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 21. 1. Preparação para perfusão Viral Nota: Este protocolo usa BSL-1 precauções. Ao empregar BSL-2 precauções, um jaleco descartáveis, luvas, sapato cobre, proteções oculares e um respirador de partículas (tipo N95) são obrigatórios. Todos os indivíduos manipulação BSL-2 compostos devem ser testados para caber um respirador de partículas por uma agência de saúde pública local. Consulte Lowery &amp; Majewska (2010) 22 para obter detalhes adicionais sobre manuseio e armazenamento de vetores virais. <ol><li> Após a primeira utilização, alíquota e armazenar vírus não utilizado em 20 microtubos ul para evitar congelamento e descongelamento repetido. </li><li> Preparar a superfície de trabalho através da remoção de quaisquer objectos desnecessários e esterilizar a superfície com etanol a 70%. Prepara-se uma 1Solução de água sanitária 0% de descontaminação de resíduos AAV. Coloque um copo cheio de solução de lixívia e uma seringa de 10 mL estéril, para a superfície de trabalho. Coloque o tubo de microcentrífuga com o AAV em um recipiente com gelo picado durante a configuração. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga com o vírus em uma morsa padrão. Carregar uma seringa de 10 mL com, pelo menos, 4 ul de AAV. Ter cuidado para não dobrar a ponta da seringa contra a parte inferior do tubo de microcentrífuga durante o carregamento. Certifique-se de que não existem bolhas de ar nos 4 ul de solução de AAV na seringa. </li><li> Descarte o tubo de vírus vazio no copo contendo 10% de alvejante. Armazenar as porções não utilizadas do vírus, tal como especificado pelo fornecedor. </li><li> Adicione água sanitária adicional de 10% para o recipiente de resíduos, e permitir que os resíduos que se sentar por 30 minutos antes de descartar os resíduos líquidos descontaminado. </li><li> Elimine todos os equipamentos de proteção e resíduos de plástico em um recipiente de risco biológico como instruído por diretrizes institucionais. Decontaminate qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus usando 10% de alvejante. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Prepare a área cirúrgica através da colocação de papel absorvente banco sob o aparelho estereotáxico e em um espaço adjacente designada como uma área de manipulação de vírus específico. <ol><li> Coloque um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área de controle de vírus dedicado perto do aparelho cirúrgico. </li></ol></li><li> Induzir um nível constante de anestesia e preparar o rato para a cirurgia. <ol><li> Colocar o rato dentro de uma câmara de indução que contém uma mistura de gás isofluorano (gama de 1 a 3%) e de oxigénio (100% a cerca de 1 l / min) até que haja uma perda de consciência e falta de movimento intencional bruto. Manter a anestesia de isoflurano durante o procedimento cirúrgico. </li><li> Após 6 anestesia profunda é atingida, raspar o rato a partir de entre os olhos para um pouco atrás das orelhas. </li><li> Coloque o rato de volta para a câmara de indução para umadicional 1-3 min. </li><li> Certifique-se de que o sistema de anestesia isoflurano está ligado ao cone de nariz da cirurgia estereotáxica. Abrir a torneira de passagem no tubo de isoflurano para iniciar o fluxo de isoflurano para o stereotax. Manter o isoflurano e oxigênio nos níveis acima especificados. </li><li> Coloque o rato em um aparelho estereotáxico, assegurando a boca para a barra de mordida e garantir os bares de ouvido. </li><li> Aplique lubrificante ocular para os olhos e betadine ao local cirúrgico antes da incisão. </li></ol></li><li> Adicione uma incisão na linha média 2,4 centímetros da pele na superfície dorsal do crânio começando cerca de 2 mm caudal para os olhos. Retrair a pele para expor o crânio. Periodicamente incutir 0,9% de solução salina estéril nas margens do sítio cirúrgico para evitar tecidos de secagem. </li><li> Tecido membranoso claro desde o crânio até bregma e lambda são claramente visíveis. </li><li> Certifique-se de que o crânio é nível medindo as coordenadas dorso-ventral embregma e a lambda. Ajuste o dispositivo estereotáxico de acordo até coordenadas dorso-ventral na bregma e lambda diferem por não mais de 0,04 mm. </li><li> Neste momento, reduzir o gás isoflurano para entre 2 e 2,5%. </li><li> Retorne a broca para bregma, Rezero as coordenadas e depois mover a broca para a desejada medial-lateral e ântero-posterior de coordenadas. </li><li> Perfurar um furo na parte de coordenadas usando uma broca de 0,9 milímetros, uma vez que produz um orifício de tamanho apropriado para uma infusão de 28 g de uma seringa. </li><li> Definir a bomba de infusão para distribuir o vírus, a uma taxa de 0,2 mL / min. Colocar a seringa no braço do dispositivo estereotáxico infusão e diminuir a seringa no desejado de coordenadas. Fornecer a quantidade desejada de vírus (gama 0,1-0,8 uL). Por exemplo, proporcionar 0,8 ul de AAV ao longo de 4 min. Nota: realizar estudos piloto para determinar o volume ideal de infusão e a propagação típica de vírus em cada região de interesse. <ol><li> Após a entrega do vírus é complete deixar a seringa no lugar durante 10 minutos para evitar o refluxo para o tracto da agulha. Lentamente levantar a seringa a uma taxa de cerca de 5 mm / min. Repita até que todas as coordenadas foram infundidos com AAV. </li></ol></li><li> Fechar a ferida usando grampos cirúrgicos e casaco a ferida com pomada antibiótica tópica. </li><li> Siga as orientações institucionais para o manejo da dor pós-operatória. </li><li> Colocar o rato em uma gaiola com cama, uma tampa e sinalização adequada e retornar o rato para a instalação para animais. <ol><li> Se trabalhar sob BSL-2 precauções, recolher roupas de cama para a quantidade de tempo (geralmente 48-72 horas) especificado por diretrizes institucionais. Coloque roupas de cama em um recipiente de resíduos de risco biológico. </li><li> Elimine todos os materiais contaminados com AAV, tal como especificado pelas diretrizes para a sua eliminação segura. </li></ol></li></ol> 3. Aparelho Comportamental Nota: O aparelho de pré-condicionamento sensorial composto por um condicionamento operante padrão Chamber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) com um piso de grade de aço inoxidável, duas paredes laterais de acrílico e duas paredes de metal. <ol><li> Montar um 2,8 W luz sobre uma das paredes de alumínio para servir como a luz da casa e como o estímulo visual quando brilhou a 2 Hz. Montar um alto-falante na câmara para entregar os estímulos auditivos (a 10 seg, 1500 Hz, 78 dB e um tom puro 10 seg 78 dB de ruído branco). <ol><li> Use um comedouro para entregar 45 mg pelotas do alimento para o copo do alimento. Dentro do copo do alimento, fotocélulas infravermelhos detectar o tempo total gasto no copo do alimento antes, durante e após as apresentações dos estímulos e recompensas alimentares. </li><li> Casa das câmaras em armários de atenuação de som (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) equipados com exaustores (~ 68 dB). </li><li> Use um computador PC com software Med Associates para controlar a câmara operante e adquirir os dados. Durante as sessões Condicionado, recolher dados sobre o tempo total gasto com a cabeça no copo do alimento durante presentação do estímulo de luz (5 seg época) e durante a apresentação da recompensa alimentar (5 seg época). Durante a sessão de teste, recolher dados sobre o tempo total gasto no copo do alimento em resposta a apresentações dos estímulos auditivos (10 seg época início, quando os estímulos auditivos são terminadas). </li></ol></li></ol> 4. Visão geral da Pré-condicionamento sensorial Paradigm <ol><li> Após a recuperação da cirurgia, gradualmente restringir comida os ratos a 85% do seu peso corporal alimentar livre. Consulte o pessoal veterinário para um paradigma de restrição alimentar adequado. Nota: O 3-fase paradigma de pré-condicionamento sensorial está ilustrado na Figura 2. </li><li> Sessões de pré-condicionamento (fase 1; Diariamente sessões de treinamento mínimo de 64 conduzida por 4 dias consecutivos): <ol><li> Ratos presentes com 12 ensaios misturados que consistem em entrega de estímulos auditivos e visuais. Incluir intervalos inter-julgamento que média de 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) depois de cada umapresentação uditory. </li><li> Em 6 dos ensaios, presente um tom (de estímulo pré-condicionado) para 10 seg, seguido imediatamente por uma apresentação de 5 segundos a luz intermitente de estímulo. </li><li> Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (estímulo não pareado) sozinho por 10 s. </li></ol></li><li> Sessões de condicionamento (Fase 2; diário sessões de treinamento mínimo de 64 realizados por 5 dias consecutivos): <ol><li> Presente ratos com oito ensaios que consistem de entrega do estímulo visual (a luz intermitente de estímulo) durante 5 segundos imediatamente seguido por entrega de dois pellets de alimentos 45 mg. Incluir intervalos inter-julgamento que média 7 min (intervalo de 6,0 a 8,0 min) depois de cada tentativa. Ocasionalmente ratos necessitam de mais de 5 sessões de condicionamento que aprender a associação comida leve. </li></ol></li><li> Teste de Sessão (Fase 3; uma única sessão de 78 min): <ol><li> Apresentar os ratos com 12 ensaios misturados que consistem de entrega dos estímulos auditivos sozinho. Incluir intervalos inter-julgamento que AVEraiva 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) após cada apresentação auditiva. </li><li> Em 6 dos ensaios, apresentar o estímulo tom (o estímulo pré-condicionados) sozinho por 10 s. </li><li> Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (o estímulo não pareado) sozinho por 10 s. </li></ol></li><li> Contrabalançar os estímulos ao completar o estudo com uma segunda série de ratos que recebem o ruído branco como o estímulo pré-condicionado eo tom como o estímulo não pareado. </li></ol> 5. farmacológica e comportamental Procedimento <ol><li> Ligue a energia para o aparelho comportamental e carregar o código Med-PC para a sessão comportamental adequado. Fios e programar o aparelho comportamental de tal modo que os fãs que são montados nos armários de som atenuando ligar quando o poder está ligado. </li><li> Para preparar um / ml solução 1 mg de clozapina N-óxido (CNO), pesar 5,0 mg de CNO em um tubo de 15 ml e adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de 0,9% estéril saline. Vortex até que a solução é clara. <ol><li> Se a CNO não se dissolve em solução ou se soluções mais concentradas de CNO são desejado adicionar um agente solubilizante, tal como DMSO 23. Especificamente, para preparar uma solução 1 mg / ml de CNO com 0,5% de DMSO, pesar 5,0 mg de CNO e adicionar 25 ul de DMSO para um tubo de 15 ml. Flick suavemente assegurar que o conteúdo permaneça na base do tubo. Quando a solução torna-se claro, adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de solução salina estéril a 0,9%. Mais informações sobre a preparação de soluções de CNO estão disponíveis na página do recurso DREADD wiki 25. </li><li> Prepara-se uma nova solução CNO cada dia em que é administrada. </li></ol></li><li> Injectar o CNO intraperitonealmente a uma dose de 1 mg / kg, aproximadamente, 30 minutos antes do teste comportamental. Por exemplo, injectar uma ratazana de 200 g, com 0,2 ml da solução de CNO 1 mg / ml. O curso dose e do tempo de administração CNO foram selecionados com base em relatórios publicados anteriormente 2,12.<ol><li> Injectar CNO 30 minutos antes de cada sessão de pré-condicionamento (Fase 1; total de 4 dias de injecções) administrar o veículo, mas antes de todas as sessões subsequentes comportamentais. </li></ol></li><li> Depois de 30 minutos, colocar os ratos dentro das câmaras de ensaio de comportamento e iniciar o código de computador para a sessão de comportamento apropriado. </li><li> Após a conclusão da tarefa comportamental, retire imediatamente os ratos das câmaras e retornar os ratos para a colônia animal. </li></ol> 6. As análises dos dados comportamentais Nota: A variável dependente para todas as sessões de comportamento é a quantidade de tempo que a cabeça do rato está dentro do copo do alimento, como detectado pela interrupção das fotocélulas infravermelhos no copo do alimento. Os dados (em segundos) são recolhidos e registados pelo software de computador. <ol><li> Não conduzir análises sobre os dados gerados durante a fase de pré-condicionamento. </li><li> Para as sessões de condicionamento: analisar a cada um dos ratosbilidade de aprender a associação alimentos leves, comparando o comportamento copo do alimento durante a apresentação do estímulo visual entre os 5 sessões comportamentais. Especificamente, calcule o tempo médio gasto no copo do alimento durante a época luz 5 segundos para cada um dos oito ensaios / sessão (ou seja, uma média de oito ensaios que são cada 5 segundos de duração / rato). Compare controlo média e os valores experimentais para cada um dos cinco sessões por dia (ver Figura 3A). <ol><li> Analisar a motivação dos ratos para obter recompensa alimentar, comparando o comportamento copo do alimento durante a entrega da recompensa alimentar (5 seg época) entre os cinco sessões comportamentais usando o mesmo cálculo, conforme especificado para a 5 seg luz época acima. Estes valores irão ser consistentemente mais elevados do que aqueles adquiridos durante a apresentação do estímulo visual (ver Figura 3B). </li></ol></li><li> Para a sessão de testes: calcular um rácio de discriminação que descreve o comportamento copo do alimento dos ratos em resposta a presentations de cada estímulo auditivo. <ol><li> Especificamente, para cada rato, dividir o tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações do estímulo sensorial pré-condicionado (ou seja, o tom) pela soma do tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações da estímulo sensorial pré-condicionada (isto é, o tom de estímulo) mais a média do tempo total gasto no copo do alimento após cada uma das seis formas de apresentação do estímulo não emparelhado (isto é, o estímulo de ruído branco). Cada epoch é de 10 seg de duração. Nota: A pontuação de discriminação de 0,5 ou superior demonstra que os ratos aprenderam as associações inerentes ao paradigma pré-condicionamento sensorial. </li></ol></li></ol> 7. Verificação de AAV Colocação e Expressão <ol><li> Anestesiar e perfundir os ratos transcardialmente usando 4% de paraformaldeído. Devido à utilização de marcadores fluorescentes, não exceder um tempo pós-fixação de 2 horas a minimize perda de antigenicidade e para preservar o sinal fluorescente. </li><li> Desidratar cérebros perfundidos, transferindo-os para um frasco de cérebro contendo 30 ml de uma solução de sacarose a 20% em solução salina de fosfato tamponada (1x) para um mínimo de 2 dias, ou até que o cérebro afunda para o fundo do frasco cérebro. </li><li> Usar um micrótomo deslizante congelamento para fazer secções cerebrais coronais (20-40 um) ao longo de toda a extensão rostro-caudal da região de interesse. </li><li> Realizar imunohistoquímica dirigidos contra o receptor com etiquetas ou a proteína repórter para determinar a localização e a expressão do receptor de design e / ou repórter 12. Um protocolo de coloração imuno-histoquímica é fornecido na página de recursos DREADD wiki 25. </li><li> Monte as secções em lâminas SuperFrost-plus e lamela usando 100-200 mL de um meio de montagem aquoso. </li><li> Realizar a microscopia de fluorescência em tecido cerebral para verificar o posicionamento de AAV e a expressão da proteína 12,24.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li><li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine.">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li><li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> amnesia and the hippocampal system. , (1993).</li><li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network).">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+efferents+of+the+perirhinal,+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat.">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li><li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe:+implications+for+hippocampal+function.">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li><li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning.">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li><li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning.">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li><li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory:+retrograde+and+anterograde+findings.">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li><li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+preconditioning.">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning.">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules.">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li><li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-2+(AAV-2)+causes+trophoblast+dysfunction,+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia.">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li><li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+of+adeno-associated+virus+(AAV)+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples.">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma.">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+Pctk1,+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats:+impact+on+cognitive+function,+synaptic+plasticity+and.">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , (1996).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat:+a+neurophysiological+and+pathological.">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior.">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li><li>wiki, D. R. E. A. D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2014).</li><li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies.">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li><li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm.">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li><li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators.">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li><li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation.">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li><li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes.">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este protocolo descreve como aplicar uma abordagem farmacogenética (DREADD) para investigar como uma região específica do cérebro contribui para uma tarefa de aprendizagem complexo multi-fase. Com a capacidade de silenciar temporariamente e remotamente a atividade neural em regiões cerebrais distintas em toda as fases de aprendizagem, essa combinação de abordagens fornece uma plataforma para investigar uma ampla gama de comportamentos, incluindo formas mais sutis ou mascarados de aprendizagem. No exemplo descrito...

Um emocionante desafio dentro do campo de neurociência comportamental é determinar os substratos neurais de comportamentos complexos. Um certo número de técnicas, tais como lesões permanentes, a inactivação do cérebro através de implantes temporários cânulas e Optogenetics foram utilizados para identificar as contribuições de regiões cerebrais discretas de subcomponentes de comportamentos complexos. Embora estas abordagens informar a nossa compreensão da especificidade regional durante a aprendizagem, cada técnica não é sem limitações. Especificamente, lesões permanentes são tipicamente conduzida antes do teste comportamental, assim os seus efeitos estão presentes ao longo da duração do paradigma. Canulação estudos que envolvem a apresentação de um inactivador neural de curto prazo (por exemplo, tetrodotoxina) pode produzir danos substanciais para o tecido cerebral e podem induzir o stress em indivíduos apenas antes do teste comportamental. Além disso, a inactivação por meio de punção é limitada à região de tecido que envolve oponta da cânula. Por último, enquanto optogenética oferece uma gama de flexibilidade para o controle temporal da actividade em regiões específicas do cérebro, que é o custo proibitivo e tecnicamente exigente. Essas limitações podem ser superadas através de uma abordagem farmacogenética (designer-receptores activados Exclusivamente-a-Designer-Drogas, DREADDs) 1,2. Mais importante, embora o conceito de farmacogenética é sofisticada, a execução da técnica é simples. Similar aos métodos cirúrgicos estereotáxicas tradicionais que envolvem a infusão de uma toxina (por exemplo, o NMDA, ácido iboténico) em regiões cerebrais discretas, esta técnica envolve a infusão de um vírus adeno-associado (AAV) que contém um fragmento de ADN para um inibidor do receptor modificado acoplado a proteína G (hM4Di; o receptor designer) para a região de interesse de roedores laboratoriais padrão (ver Figura 1). O vector viral também contém um repórter fluorescente (mcitrine). Uma vez incorporados nopara as células, o desenhador do receptor (e proteína repórter) são maximamente expressa três semanas pós-infusão ~ e pode ser activada selectivamente para 2-5 horas por administração sistémica da droga desenhador de outra forma biologicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Porque o experimentador é dotado de controle temporal preciso, ainda remota sobre a atividade neural em regiões específicas do cérebro, farmacogenética combina muito bem com paradigmas comportamentais que são realizados em várias fases. Neste exemplo, a contribuição do córtex retrosplenial (RSC) ao estímulo-estímulo de aprendizagem é comparado com o seu papel na aprendizagem pavloviano, porém essa combinação de abordagens é bem adequado para qualquer número de questões que buscam identificar regiões do cérebro como específica contribuir para comportamento complexo. Além disso, embora não descritos no presente protocolo, virais e abordagens transgénicas podem ser usadas para atingir células de tipo específico DREADD expressão 2. Como is inerente em paradigmas comportamentais que envolvem tipos farmacológicos e / ou outras das manipulações experimentais, uma análise cuidadosa do desenho experimental e análise quantitativa subsequente é necessário quando se utiliza a abordagem DREADD. Experimentadores novas para a abordagem DREADD são encaminhados para uma avaliação abrangente da tecnologia atual DREADD 2. Cada dia, os organismos aprender sobre novos estímulos e eventos e seus relacionamentos entre si. Mesmo em um ambiente familiar, tais como casa, é rápido para detectar alterações nas relações entre estímulos, porque essas alterações podem ser preditivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (isto é, relacional) aprendizagem envolve a conjunção de vários estímulos e, tradicionalmente, tem sido associada com o hipocampo, que reside centralmente dentro do lobo temporal medial 4. No entanto, o hipocampo não existe nem actuar isoladamente; regiões corticais, tanto dentro como foralateral do lóbulo temporal medial fornecer informação sensorial crítica para a formação do hipocampo 5-7. Os estudos tradicionais permanentes lesão fornecem evidências convincentes para o envolvimento de um número de regiões corticais (por exemplo, os córtices retrosplï¿½icos, postrhinal e entorrinal) na aprendizagem dependente do hipocampo, mas são limitados em sua capacidade de discernir o papel de uma determinada região durante as fases discretas de 8-10 aprendizagem. O presente protocolo testa a hipótese de que a RSC é necessária para a aprendizagem estímulo-estímulo ao silenciar a RSC durante uma única fase de um 3-fase de pré-condicionamento sensorial paradigma 11,12. Resumidamente, os ratos recebem uma infusão de AAV que contém o receptor de design e ~ 3 semanas mais tarde são administrados a droga Designer (CNO) 30 minutos antes do início do teste de comportamento. No presente protocolo, os ratos experimentais receber CNO durante a primeira fase de testes (quando lear estímulo-estímuloning ocorre) e eles recebem veículo durante os próximos 2 fases de testes. Para controlar os efeitos involuntários de CNO no comportamento, infundir ratos com o receptor designer (hM4Di) e injetar com veículo em vez de CNO. Para dar conta de efeitos gerais de infusão viral e expressão do receptor, infundir um vírus de controle que não contém o receptor designer e administrar CNO. Um número de diferentes serotipos de AAV são utilizadas para entregar material genético. Os actuais orientações NIH para a pesquisa envolvendo recombinante ou moléculas sintéticas que mantém AAV (todos os serotipos) e construções de AAV recombinantes ou sintéticos, em que o transgene não codifica um produto de gene ou potencialmente carcinogénicos ou uma molécula de toxina e são produzidos na ausência de um vírus auxiliar, exigem precauções BSL-1 (Apêndice B-1. Risco do Grupo 1 (RG1) agentes) 13. Uma série de avaliações referentes à estrutura de AAV, utilidade e segurança estão disponíveis 14,15. Notavelmente, embora, Devido a preocupações relativas a possíveis reprodutivos 16,17 e mecanismos potenciais cancerígenos 18-20 em roedores, algumas instituições exigem o uso de BSL-2 precauções quando se trabalha com AAV. Verifique a BSL apropriado antes de usar, consultando os comitês de supervisão em instituições individuais em que a investigação será conduzida, os Centros de Controle de Doenças e as Diretrizes do NIH para a pesquisa envolvendo moléculas de DNA recombinante 13 ao usar vetores virais para manipulação genética nos Estados Unidos. Protecção individual, de formação investigador, contenção vetor, descontaminação, eliminação de materiais descontaminados, e pós-injeção de animais requisitos habitacionais são especificados por estas orientações. Além disso, consultar e siga apropriado Institutional Animal Care e Use as orientações do comitê ou orientações do comitê de supervisão institucionais equivalentes para garantir o manuseio seguro, administração e alienação de AAV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Male, Long Evans Rats, 55-60 d</td>
			<td >Hilltop Lab Animals Inc</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-GFP</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clozapine-N-Oxide</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >4936-10</td>
			<td>Designer Drug</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rat Cage lid (Polycarbonate)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FT 8XL-PC</td>
			<td>Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filer Paper (Replacement)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FP-R-1018XAD</td>
			<td>Filter paper that goes with cage lids</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table Top Vise</td>
			<td >JETS</td>
			<td >2201-265</td>
			<td>For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medline Biohazard liners&#160;</td>
			<td >Staples</td>
			<td >113444</td>
			<td>Biohazard Trash Bags</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle&#160;</td>
			<td >Amazon.com</td>
			<td ></td>
			<td>Biohazard Trash Can</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane, 100 mL</td>
			<td >Patterson Veterinary Supply Inc.&#160;</td>
			<td >07-890-8540</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 942</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 955</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Mask (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 906</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 1474</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microdrill burrs, 0.9 mm</td>
			<td >Fine Science Tools Inc</td>
			<td >19007-09</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Syringe pump with Micro4 Controller&#160;</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model UMP3-1</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit</td>
			<td >Ahdis</td>
			<td >21420</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine Skin Cleanser</td>
			<td >Perdue&#160; Products L.P</td>
			<td >67618-149-04</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triple Antiobiotic Ointment</td>
			<td >Medline Supply</td>
			<td >53329-087-01</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Vet Ointment</td>
			<td >Only Veterinary Supply</td>
			<td >17033-211-38</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite&#160;</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >AD7013MTL</td>
			<td>An alternative to the traditional disection scope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >MS36B</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >28 Gauge 10uL Syringe</td>
			<td >Hamilton&#160;</td>
			<td >80308-701SN</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-018MD</td>
			<td>22&#39;Wx22&#34;Hx16&#34;D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall Modular Test Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-007</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Grid Floor&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-005</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >House Light</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-215M</td>
			<td>Used as the house light and stimulus light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modular Pellet Dispenser&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-203M-45</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pellet Recetacle, Cup Type</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-200R1M</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head Entry Detector for Rat</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-254-CB</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dustless precision food pellets, 45 mg</td>
			<td >Bio-Serv</td>
			<td >F0165</td>
			<td >Behavioral supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cage Speaker for Rat Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-224AM</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable Audio Generator&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ANL-926</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smart Ctrl 8 Input/16 output Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-716P2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large Table Top Cabinet and Power Supply</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >SG-6510D</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCI Interface Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-700P2-R2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19&#34; Monitor</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >COM-103V</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (grannular), 1 kg</td>
			<td >Electron Microsopy Sciences</td>
			<td >19210</td>
			<td>Hazard:&#160; carcinogen, weigh in hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >3724S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >XP Rabbit monoclonal antibody (GFP)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >2956S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rabbit IgG</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >4412S</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td >VWR international</td>
			<td >483111-703</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for remotely silencing neural activity in rodents during discrete phases of learning

Este protocolo descreve como silenciar temporariamente e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os animais estão envolvidos em tarefas de aprendizagem e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptores-exclusivamente-Activated-a-Designer-Drogas) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que se destina a distinguir entre diferentes formas de aprendizagem. Especificamente, a entrega mediada por vírus é utilizado para expressar um receptor geneticamente modificado inibidora acoplado a proteína G (o Designer receptor) para uma região do cérebro discreta no roedor. Três semanas mais tarde, quando os níveis de expressão do receptor desenhador são elevados, um agente farmacológico (Designer fármaco) é administrado sistemicamente 30 min antes de uma sessão comportamental específica. A droga tem afinidade para o receptor de design e, portanto, resulta na inibição de neurónios que expressam o receptor do desenhador, mas caso contrário, é biologicamente inerte. A região do cérebro permanece silenciado por 2-5 hr (depenDing da dose e via de administração). Após a conclusão do paradigma comportamental, tecido do cérebro é avaliada para a colocação correcta e expressão do receptor. Esta abordagem é particularmente útil para determinar a contribuição de regiões cerebrais individuais para os componentes específicos do comportamento e pode ser usado em qualquer número de paradigmas comportamentais.

Os resultados comportamentais Após a conclusão da experiência, a eficácia da inactivação temporária específica da região deve ser avaliada quantitativamente e qualitativamente. O presente exemplo envolve uma fase paradigma comportamental-3 (pré-condicionamento sensorial), em que a CNO foi administrada para atenuar a actividade neural no RSC durante as sessões de pré-condicionamento para testar a hipótese de que o CER é necessário para a formação de associações entre estímulo...

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A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

14.6K visualizações.  Oberlin College. This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

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Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of humans with orofacial pain. To measure meal duration unrestrained rats are continuously kept in sound attenuated, computerized feeding modules for days to weeks to record feeding behavior. These sound-attenuated chambers are equipped with chow pellet dispensers. The dispenser has a pellet trough with a photobeam placed at the bottom of the trough and when a rodent removes a pellet from the feeder trough this beam is no longer blocked, signaling the computer to drop another pellet. The computer records the date and time when the pellets were taken from the trough and from this data the experimenter can calculate the meal parameters. When calculating meal parameters a meal was defined based on previous work and was set at 10 min (in other words when the animal does not eat for 10 min that would be the end of the animal&#39;s meal) also the minimum meal size was set at 3 pellets. The meal duration, meal number, food intake, meal size and inter-meal interval can then be calculated by the software for any time period that the operator desires. Of the feeding parameters that can be calculated meal duration has been shown to be a continuous noninvasive biological marker of orofacial nociception in male rats and mice and female rats. Meal duration measurements are quantitative, require no training or animal manipulation, require cortical participation, and do not compete with other experimentally induced behaviors. These factors distinguish this assay from other operant or reflex methods for recording orofacial nociception.

A lengthening in meal duration represents orofacial nociceptive behavior in rodents similar to the guarding behavior of humans with orofacial pain. Eating is a behavior that requires no training or animal manipulation, requires cortical participation, and is not competing with other experimentally induced behaviors, distinguishing this assay from alternative reflex or operant measurements.

Duração da Refeição como Medida de Respostas Nociceptivas Orofacial em Roedores

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

Comportamento

Automated Visual Cognitive Tasks for Recording Neural Activity Using a Floor Projection Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have developed visual cognitive tasks for rats using the Floor Projection Maze1,2&#160;that are optimized for visual abilities of rats permitting stronger comparisons of experimental findings with other species.
In order to investigate neural correlates of learning and memory, we have integrated electrophysiological recordings into fully automated cognitive tasks on the Floor Projection Maze1,2. Behavioral software interfaced with an animal tracking system allows monitoring of the animal's behavior with precise control of image presentation and reward contingencies for better trained animals. Integration with an in vivo electrophysiological recording system enables examination of behavioral correlates of neural activity at selected epochs of a given cognitive task.
We describe protocols for a model system that combines automated visual presentation of information to rodents and intracranial reward with electrophysiological approaches. Our model system offers a sophisticated set of tools as a framework for other cognitive tasks to better isolate and identify specific mechanisms contributing to particular cognitive processes.

We describe protocols for training rats for chronic electrophysiological recordings in fully automated cognitive tasks on a Floor Projection Maze.

Tarefas cognitivas Visuais automatizadas para gravação Atividade Neural Usando uma projeção Piso Labirinto

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have ...

Measuring Neural and Behavioral Activity During Ongoing Computerized Social Interactions: An Examination of Event-Related Brain Potentials

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, an understanding of how perceptions of social exclusion develop over the course of a social interaction is important for advancing treatments aimed at lessening the harmful costs of being excluded. To date, most scientific examinations of social exclusion have looked at exclusion after a social interaction has been completed. While this has been very helpful in developing an understanding of what happens to a person following exclusion, it has not helped to clarify the moment-to-moment dynamics of the process of social exclusion. Accordingly, the current protocol was developed to obtain an improved understanding of social exclusion by examining the patterns of event-related brain activation that are present during social interactions. This protocol allows greater precision and sensitivity in detailing the social processes that lead people to feel as though they have been excluded from a social interaction. Importantly, the current protocol can be adapted to include research projects that vary the nature of exclusionary social interactions by altering how frequently participants are included, how long the periods of exclusion will last in each interaction, and when exclusion will take place during the social interactions. Further, the current protocol can be used to examine variables and constructs beyond those related to social exclusion. This capability to address a variety of applications across psychology by obtaining both neural and behavioral data during ongoing social interactions suggests the present protocol could be at the core of a developing area of scientific inquiry related to social interactions.

Research on social exclusion has grown tremendously in recent years. As the field expands, it is imperative to develop sophisticated methodologies allowing for the simultaneous measurement of neural and behavioral outcomes during social exclusion. This protocol utilizes event-related brain potentials to record ongoing neural activity during computerized social interactions.

Medindo Neural e Comportamental atividade durante curso computadorizados Interações Sociais: Uma Análise das potenciais cerebrais relacionados a eventos

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, ...

The Double-H Maze: A Robust Behavioral Test for Learning and Memory in Rodents

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their behavioral flexibility and required memory duration, the number of goals and pathways, and also the overall task complexity. A confounding feature in many of these tasks is the lack of control over the strategy employed by the rodents to reach the goal, e.g., allocentric (declarative-like) or egocentric (procedural) based strategies. The double-H maze is a novel water-escape memory task that addresses this issue, by allowing the experimenter to direct the type of strategy learned during the training period. The double-H maze is a transparent device, which consists of a central alleyway with three arms protruding on both sides, along with an escape platform submerged at the extremity of one of these arms.
Rats can be trained using an allocentric strategy by alternating the start position in the maze in an unpredictable manner (see protocol 1; &#167;4.7), thus requiring them to learn the location of the platform based on the available allothetic cues. Alternatively, an egocentric learning strategy (protocol 2; &#167;4.8) can be employed by releasing the rats from the same position during each trial, until they learn the procedural pattern required to reach the goal. This task has been proven to allow for the formation of stable memory traces.
Memory can be probed following the training period in a misleading probe trial, in which the starting position for the rats alternates. Following an egocentric learning paradigm, rats typically resort to an allocentric-based strategy, but only when their initial view on the extra-maze cues differs markedly from their original position. This task is ideally suited to explore the effects of drugs/perturbations on allocentric/egocentric memory performance, as well as the interactions between these two memory systems.

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

O Double-H labirinto: um teste comportamental robusto para Aprendizado e Memória em roedores

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their ...

Quantifying Learning in Young Infants: Tracking Leg Actions During a Discovery-learning Task

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning process. Here a method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process. This discovery-learning task uses an infant activated mobile that rotates and plays music based on specified leg action of infants. Supine infants activate the mobile by moving their feet vertically across a virtual threshold. This paradigm is unique in that as infants independently discover that their leg actions activate the mobile, the infants&#8217; leg movements are tracked using a motion capture system allowing for the quantification of the learning process. Specifically, learning is quantified in terms of the duration of mobile activation, the position variance of the end effectors (feet) that activate the mobile, changes in hip-knee coordination patterns, and changes in hip and knee muscle torque. This information describes infant exploration and exploitation at the interplay of person and environmental constraints that support task-specific action. Subsequent research using this method can investigate how specific impairments of different populations of infants at risk for movement disorders influence the discovery-learning process for task-specific action.

A method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process.

Quantificar Aprendizagem em lactentes jovens: Ações Perna Rastreamento Durante uma tarefa de aprendizagem-Discovery

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning ...

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for quantifying locomotor deficits in rodents is to measure minute disturbances of unconstrained gait overground (e.g., manual BBB score or automated CatWalk). However, cortical inputs are not required for the generation of basic locomotion produced by the spinal central pattern generator (CPG). Thus, unconstrained walking tasks test locomotor deficits due to motor cortical impairment only indirectly. In this study, we propose a novel, precise foot-placement locomotor task that evaluates cortical inputs to the spinal CPG. An instrumented peg-way was used to impose symmetrical and asymmetrical locomotor tasks mimicking lateralized movement deficits. We demonstrate that shifts from equidistant inter-stride lengths of 20% produce changes in the forelimb stance phase characteristics during locomotion with preferred stride length. Furthermore, we propose that the asymmetric walkway allows for measurements of behavioral outcomes produced by cortical control signals. These measures are relevant for the assessment of impairment after cortical damage.

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

Asymmetric Passagem: A Novel de Ensaio Comportamental de Estudos de Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Using the Activity-based Anorexia Rodent Model to Study the Neurobiological Basis of Anorexia Nervosa

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A challenging illness to treat, due to the lack of understanding of the underlying neurobiology, AN has the highest mortality rate among psychiatric illnesses. To address this need, neuroscientists are using an animal model to study how neural circuits may contribute toward vulnerability to AN and may be affected by AN. Activity-based anorexia (ABA) is a bio-behavioral phenomenon described in rodents that models the key symptoms of anorexia nervosa. When rodents with free access to voluntary exercise on a running wheel experience food restriction, they become hyperactive &#8211; running more than animals with free access to food. Here, we describe the procedures by which ABA is induced in adolescent female C57BL/6 mice. On postnatal day 36 (P36), the animal is housed with access to voluntary exercise on a running wheel. After 4 days of acclimation to the running wheel, on P40, all food is removed from the cage. For the next 3 days, food is returned to the cage (allowing animals free food access) for 2 hr daily. After the fourth day of food restriction, free access to food is returned and the running wheel is removed from the cage to allow the animals to recover. Continuous multi-day analysis of running wheel activity shows that mice become hyperactive within 24 hr following the onset of food restriction. The mice run even during the limited time during which they have access to food. Additionally, the circadian pattern of wheel running becomes disrupted by the experience of food restriction. We have been able to correlate neurobiological changes with various aspects of the animals&#8217; wheel running behavior to implicate particular brain regions and neurochemical changes with resilience and vulnerability to food-restriction induced hyperactivity.

Here we present a protocol to induce activity-based anorexia (ABA) in female adolescent mice. ABA is a condition of hyperactivity evoked by imposing food restriction on rodents with access to a running wheel. This phenomenon is being used as a model to study the underlying neurobiology of anorexia nervosa.

Usando a Anorexia Rodent modelo baseado em atividades para estudar a base neurobiológica da Anorexia Nervosa

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental paradigms and analysis tools have been limited to constrained laboratory tasks and contexts due to technical limitations imposed by the available set of measuring and analysis techniques and the age of the subjects. These limitations severely limit the study of developmental neural dynamics and associated neural networks engaged in cognition, perception and action in infants performing &#8220;in action and in context&#8221;. This protocol presents a novel approach to study infants and young children as they freely organize their own behavior, and its consequences in a complex, partly unpredictable and highly dynamic environment. The proposed methodology integrates synchronized high-density active scalp electroencephalography (EEG), inertial measurement units (IMUs), video recording and behavioral analysis to capture brain activity and movement non-invasively in freely-behaving infants. This setup allows for the study of neural network dynamics in the developing brain, in action and context, as these networks are recruited during goal-oriented, exploration and social interaction tasks.

This protocol presents a novel methodology for the neural decoding of intent from freely-behaving infants during unscripted social interaction with an actor. Neural activity is acquired using non-invasive high-density active scalp electroencephalography (EEG). Kinematic data is collected with inertial measurement units and supplemented with synchronized video recording.

Uma nova abordagem experimental e analítico ao Neural Decodificação de Intenções Multimodal Durante Interação Social no Livremente-comportando bebês humanos

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in mice: the Feeding Experimentation Device (FED). FED is an open-source system that was designed to facilitate flexibility in food intake studies. Due to its compact and battery powered design, FED can be placed within standard home cages or other experimental equipment. Food intake measurements can also be synchronized with other equipment in real-time via FED's transistor-transistor logic (TTL) digital output, or in post-acquisition processing as FED timestamps every event with a real-time clock. When in use, a food pellet sits within FED's food well where it is monitored via an infrared beam. When the pellet is removed by the mouse, FED logs the timestamp onto its internal secure digital (SD) card and dispenses another pellet. FED can run for up to 5 days before it is necessary to charge the battery and refill the pellet hopper, minimizing human interference in data collection. Assembly of FED requires minimal engineering background, and off-the-shelf materials and electronics were prioritized in its construction. We also provide scripts for analysis of food intake and meal patterns. Finally, FED is open-source and all design and construction files are online, to facilitate modifications and improvements by other researchers.

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device (FED) is an open-source device for measuring food intake in mice. FED can also synchronize food intake measurements with other techniques via a real-time digital output. Here, we provide a step-by-step tutorial for the construction, validation, and usage of FED.

Alimentando Dispositivo Experimentação (FED): construção e validação de um dispositivo de código aberto para medição Food Intake em roedores

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. Fundamental mechanisms that underlie this temporal control are widely studied using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism. In flies, the clock is typically studied by analyzing multiday locomotor recording. Such a recording shows a complex bimodal pattern with two peaks of activity: a morning peak that happens around dawn, and an evening peak that happens around dusk. These two peaks together form a waveform that is very different from sinusoidal oscillations observed in clock genes, suggesting that mechanisms in addition to the clock have profound effects in producing the observed patterns in behavioral data. Here we provide instructions on using a recently developed computational method that mathematically describes temporal patterns in fly activity. The method fits activity data with a model waveform that consists of four exponential terms and nine independent parameters that fully describe the shape and size of the morning and evening peaks of activity. The extracted parameters can help elucidate the kinetic mechanisms of substrates that underlie the commonly observed bimodal activity patterns in fly locomotor rhythms.

A method to quantify the main temporal features seen in fly circadian locomotor rhythms is presented. The quantification is achieved by fitting fly activity with a multi-parametric model waveform. The model parameters describe the shape and size of the morning and evening peaks of daily activity.