Nous remercions les auteurs de Robinson et al. 12 pour leurs contributions à le manuscrit à partir de laquelle ce protocole est partiellement dérivé.

L&#39;utilisation d&#39;animaux sont approuvés par le Oberlin College institutionnel de protection des animaux et utilisation comité et sont en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire 21. 1. Préparation pour perfusion virale Remarque: Ce protocole utilise BSL-1 précautions. Quand on emploie BSL-2 précautions, une blouse de laboratoire jetable, gants, couvre-chaussures, protections oculaires et un respirateur de particules (tapez N95) sont obligatoires. Toutes les personnes qui les manipulent BSL-2 composés doivent être aptes testé pour un respirateur de particules par une agence de santé publique local. Reportez-vous à Lowery &amp; Majewska (2010) 22 pour plus de détails sur la manipulation et le stockage de vecteurs viraux. <ol><li> Lors de la première utilisation, aliquote et stocker le virus utilisé dans 20 microtubes pi pour éviter le gel et le dégel répétés. </li><li> Préparer la surface de travail en supprimant tous les objets inutiles et la stérilisation de la surface avec 70% d&#39;éthanol. Préparer un 1Solution d&#39;eau de Javel 0% pour décontaminer les déchets de l&#39;AAV. Placez un bécher rempli de la solution d&#39;eau de Javel et une seringue stérile de 10 pi sur la surface de travail. Placer le tube à centrifuger avec l&#39;AAV dans un récipient avec de la glace pilée lors de mise en place. </li><li> Placer le tube à centrifuger avec le virus dans un étau standard. Charger une seringue de 10 ul avec au moins 4 pi d&#39;AAV. Prenez soin de ne pas plier l&#39;embout de la seringue contre le fond du tube de microcentrifugeuse pendant le chargement. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans les 4 pi de solution de AAV dans la seringue. </li><li> Jeter le tube vide de virus dans le bécher contenant 10% de l&#39;eau de Javel. Rangez le restant du virus comme indiqué par le fournisseur. </li><li> Ajouter supplémentaire de 10% de javel pour le conteneur de déchets, et laissez les déchets reposer pendant 30 min avant d&#39;éliminer les déchets liquides décontaminés. </li><li> Éliminer tous les équipements de protection et de déchets en plastique dans un container prévu comme indiqué par les directives institutionnelles. Décontaminate tout équipement ou surfaces ayant été en contact avec le virus en utilisant 10% de javel. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Préparer la zone chirurgicale en plaçant le papier absorbant banc sous l&#39;appareil stéréotaxique et sur un espace adjacent désigné comme une zone de manipulation de virus dédié. <ol><li> Placez un récipient de déchets de Javel à 10% dans la zone de manipulation du virus dédié près de l&#39;appareil chirurgical. </li></ol></li><li> Provoquer un niveau stable de l&#39;anesthésie et de préparer le rat pour la chirurgie. <ol><li> Placez le rat dans une chambre d&#39;induction qui contient un mélange de gaz isoflurane (plage de 1 à 3%) et d&#39;oxygène (100% à environ 1 L / min) jusqu&#39;à ce que il ya une perte de conscience et le manque de mouvement intentionnel brut. Maintenir anesthésie à l&#39;isoflurane pendant toute la procédure chirurgicale. </li><li> Après 6 anesthésie profonde est atteint, de se raser le rat d&#39;entre les yeux légèrement derrière les oreilles. </li><li> Placez le rat nouveau dans la chambre d&#39;induction pour une1-3 min supplémentaire. </li><li> Assurez-vous que le système d&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane est connecté à la pointe avant de la chirurgie stéréotaxique. Ouvrez le robinet d&#39;arrêt sur le tube isoflurane pour commencer l&#39;écoulement de l&#39;isoflurane à l&#39;stereotax. Maintenir l&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène aux niveaux indiqués ci-dessus. </li><li> Placez le rat dans un appareil stéréotaxique de fixation de la bouche sur la barre de morsure et la fixation des barres d&#39;oreilles. </li><li> Appliquer un lubrifiant oculaire pour les yeux et la bétadine sur le site chirurgical avant l&#39;incision. </li></ol></li><li> Ajouter un 2,4 cm incision médiane de la peau sur la surface dorsale du crâne à partir d&#39;environ 2 mm caudale pour les yeux. Rétracter la peau pour exposer le crâne. Périodiquement inculquer 0,9% saline stérile stérile sur les marges du site chirurgical pour empêcher les tissus de séchage. </li><li> Tissus membraneux Effacer du crâne jusqu&#39;à ce bregma et lambda sont clairement visibles. </li><li> Assurez-vous que le crâne est de niveau en mesurant les coordonnées dorsales-ventrale aubregma et au lambda. Ajuster le dispositif stéréotaxique en conséquence jusqu&#39;à ce que les coordonnées dorsale-ventrale au bregma et lambda diffèrent pas de plus de 0,04 mm. </li><li> A cette époque, de réduire le gaz isoflurane à entre 2 et 2,5%. </li><li> Retour à la perceuse bregma, remettre à zéro les coordonnées et ensuite passer la perceuse à la médio-latérale désirée et antéro-postérieure de coordonnées. </li><li> Percer un trou à l&#39;aide de coordonnées d&#39;un foret de 0,9 mm car il produit un trou de taille appropriée pour un 28 G perfusion seringue. </li><li> Mettre la pompe à perfusion pour délivrer virus à un débit de 0,2 ul / min. Placer la seringue dans le bras de perfusion du dispositif stéréotaxique et abaisser la seringue dans la coordination souhaitée. Fournir la quantité voulue de virus (varier de 0,1 à 0,8 ul). Par exemple, offrir 0,8 pi de AAV plus de 4 min. Remarque: mener des études pilotes pour déterminer le volume d&#39;infusion idéale et la propagation typique de virus dans chaque région d&#39;intérêt. <ol><li> Après la livraison du virus est complete laisser la seringue en place pendant 10 min pour empêcher le reflux dans les voies de l&#39;aiguille. Soulevez lentement la seringue à un taux d&#39;environ 5 mm / min. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les coordonnées ont été infusé avec AAV. </li></ol></li><li> Fermer la plaie en utilisant des agrafes chirurgicales et manteau de la plaie avec une pommade antibiotique topique. </li><li> Suivez les directives institutionnelles pour la gestion de la douleur post-opératoire. </li><li> Placez le rat dans une cage avec literie, un couvercle et une signalisation adéquate et retourner le rat à l&#39;animalerie. <ol><li> Si vous travaillez sous BSL-2 précautions, literie pour recueillir la quantité de temps (généralement 48-72 h) spécifié par les directives institutionnelles. Placez la literie dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux. </li><li> Jetez tous les matériaux d&#39;AAV contaminés comme spécifié par les lignes directrices pour leur élimination sûre. </li></ol></li></ol> 3. Appareil Behavioral Remarque: L&#39;appareil de préconditionnement sensorielle consiste en un conditionnement opérant cham normeber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) avec un plancher inoxydable grille en acier, 2 parois latérales en plexiglas et 2 parois métalliques. <ol><li> Monter un 2,8 W lumière sur l&#39;un des murs d&#39;aluminium pour servir de la lumière de la maison et que le stimulus visuel lorsque flashé à 2 Hz. Monter un haut-parleur sur la chambre de livrer les stimuli auditifs (10 sec, 1500 Hz, 78 dB et un son pur dB bruit blanc 10 sec 78). <ol><li> Utilisation d&#39;une trémie d&#39;alimentation pour délivrer 45 mg de granulés de produits alimentaires dans la coupe des aliments. Dans la coupe de la nourriture, des cellules photoélectriques infrarouges détectent le temps total passé dans la tasse de nourriture avant, pendant et après les présentations des stimuli et des récompenses alimentaires. </li><li> Maison des chambres dans des armoires de insonorisants (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) équipés de ventilateurs d&#39;extraction (~ 68 dB). </li><li> Utiliser un ordinateur PC avec le logiciel Med Associates pour contrôler la chambre opérant et acquérir les données. Pendant les séances de conditionnement, de recueillir des données sur le temps total passé avec la tête dans la tasse de nourriture pendant presentation du stimulus lumineux (5 sec époque) et lors de la présentation de la récompense alimentaire (5 sec d&#39;époque). Au cours de la session de test, recueillir des données sur le temps total passé dans la tasse alimentaire en réponse aux présentations des stimuli auditifs (10 sec époque du début, quand les stimuli auditifs sont terminées). </li></ol></li></ol> 4. Aperçu de la sensorielle préconditionnement Paradigm <ol><li> Suite à la récupération de la chirurgie, de restreindre progressivement l&#39;alimentation des rats à 85% de leur poids corporel d&#39;alimentation libre. Consultez le personnel vétérinaire pour un paradigme de restriction alimentaire approprié. Remarque: le préconditionnement 3-sensoriel paradigme de phase est illustrée à la figure 2. </li><li> Préconditionnement Sessions (Phase 1; quotidiennes des sessions de formation de 64 min menée sur 4 jours consécutifs): <ol><li> Rats présents avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des stimuli auditifs et visuels. Inclure les intervalles inter-essai que moyenne de 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chacun unprésentation uditory. </li><li> Le 6 des essais, présente une tonalité (relance préconditionnés) pendant 10 secondes, suivi immédiatement par une présentation de 5 sec du stimulus de lumière clignotante. </li><li> Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (stimulus non apparié) seul pendant 10 sec. </li></ol></li><li> séances de conditionnement (Phase 2; Daily sessions de formation 64 min menée dans 5 jours consécutifs): <ol><li> Rats présents avec 8 essais qui se composent de la livraison du stimulus visuel (le stimulus de lumière clignotante) pendant 5 secondes immédiatement suivi par la livraison de deux boulettes de nourriture de 45 mg. Inclure les intervalles inter-essai cette moyenne 7 min (intervalle 6,0 à 8,0 min) après chaque essai. Parfois rats nécessitent plus de 5 séances de conditionnement d&#39;apprendre l&#39;association de la nourriture légère. </li></ol></li><li> Session d&#39;essai (phase 3; une seule session de 78 min): <ol><li> Présenter les rats avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des seuls stimuli auditifs. Inclure les intervalles inter-essai que AVErage 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chaque présentation auditive. </li><li> Le 6 des essais, présenter le stimulus de tonalité (le stimulus préconditionnés) seul pendant 10 sec. </li><li> Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (le stimulus non apparié) seul pendant 10 sec. </li></ol></li><li> Contrebalancer les stimuli en complétant l&#39;étude avec une deuxième série de rats qui reçoivent le bruit blanc que le stimulus préconditionnés et le ton que le stimulus non apparié. </li></ol> 5. pharmacologique et comportementale procédure <ol><li> Tournez sur la puissance de l&#39;appareil de comportement et charger le code Med-PC pour la session de comportement approprié. Fil et le programme de l&#39;appareil de comportement telles que les fans qui sont montés sur les armoires de son atténuation allument quand l&#39;appareil est sous tension. </li><li> Pour préparer une solution à 1 mg / ml de N-oxyde de la clozapine (CNO), peser 5,0 mg de CNO dans un tube conique de 15 ml et ajouter 5 ml d&#39;eau stérile ou stérile 5 ml de 0,9% saliNE. Vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. <ol><li> Si CNO ne se dissout pas dans la solution ou si des solutions plus concentrées de CNO on souhaite ajouter un agent de solubilisation, tel que le DMSO 23. Plus précisément, pour préparer une solution à 1 mg / ml de CNO avec 0,5% de DMSO, 5,0 mg de peser CNO et ajouter 25 ul de DMSO dans un tube conique de 15 ml. Flick doucement assurer que le contenu reste à la base du tube. Lorsque la solution devient limpide, ajoutez 5 ml d&#39;eau stérile ou 5 ml de solution saline stérile à 0,9%. Des instructions supplémentaires pour la préparation de solutions de CNO sont disponibles sur la page des ressources DREADD wiki 25. </li><li> Préparer une nouvelle solution CNO chaque jour qu&#39;il est administré. </li></ol></li><li> Injecter le CNO intrapéritonéale à une dose de 1 mg / kg environ 30 min avant le test comportemental. Par exemple, une injection de 200 g de rat avec 0,2 ml de la / ml solution CNO 1 mg. Le cours de la dose et la durée d&#39;administration CNO ont été sélectionnés sur la base de rapports précédemment publiés 2,12.<ol><li> Injecter CNO 30 min avant chaque session de préconditionnement (phase 1; total de 4 jours d&#39;injections), mais administrer le véhicule avant de toutes les sessions ultérieures de comportement. </li></ol></li><li> Après 30 min, placer les rats dans les chambres de tests comportementaux et lancer le code informatique pour la session de comportement approprié. </li><li> À la fin de la tâche comportementale, retirer immédiatement les rats issus des chambres et retourner les rats à la colonie animale. </li></ol> 6. Les analyses des données comportementales Note: La variable dépendante pour toutes les sessions de comportement est la quantité de temps que la tête du rat est à l&#39;intérieur de la tasse de nourriture comme détecté par l&#39;interruption des cellules infrarouges dans la tasse de nourriture. Les données (à sec) sont recueillies et enregistrées par le logiciel de l&#39;ordinateur. <ol><li> Ne pas effectuer des analyses sur des données générées pendant la phase de préconditionnement. </li><li> Pour les séances de conditionnement: analyser l&#39;un de chacun des ratsbilité d&#39;apprendre l&#39;association de la nourriture légère en comparant le comportement de tasse alimentaire durant la présentation du stimulus visuel à travers les 5 sessions de comportement. Plus précisément, calculer le temps moyen passé dans la tasse de nourriture pendant la lumière époque 5 sec pour chacun des 8 essais / session (soit une moyenne de 8 essais qui sont chacun 5 secondes dans la durée / rat). Comparez commande moyenne et les valeurs expérimentales pour chacune des 5 séances par jour (voir la figure 3A). <ol><li> Analyser la motivation des rats pour obtenir récompense alimentaire en comparant le comportement de coupe alimentaire lors de la livraison de la récompense alimentaire (5 sec d&#39;époque) à travers les 5 sessions de comportement en utilisant le même calcul spécifiée pour l&#39;époque de la lumière 5 sec ci-dessus. Ces valeurs seront systématiquement plus élevés que ceux acquis durant la présentation du stimulus visuel (voir la figure 3B). </li></ol></li><li> Pour la session de test: calculer un ratio de la discrimination qui décrit le comportement de la Coupe alimentaire des rats en réponse à pressentations de chaque stimulus auditif. <ol><li> Plus précisément, pour chaque rat, diviser le temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus préconditionnés sensorielle (par exemple, le ton) par la somme du temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations de la stimulus sensoriel préconditionnés (ie, le stimulus de la tonalité) et de la moyenne du temps total passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus non apparié (à savoir, le bruit stimulus blanc). Chaque époque est de 10 secondes dans la durée. Note: Un score de discrimination de 0,5 ou plus démontre que les rats ont appris les associations inhérentes dans le paradigme de préconditionnement sensorielle. </li></ol></li></ol> 7. Vérification de l&#39;AAV placement et d&#39;expression <ol><li> Anesthésier et perfuser les rats transcardiaque utilisant 4% de paraformaldéhyde. Grâce à l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents, ne pas dépasser un temps de post-fixation de 2 h à minla perte de l&#39;antigénicité de imize et pour préserver le signal fluorescent. </li><li> Déshydrater cerveaux perfusés en les transférant dans un pot de cerveau contenant 30 ml d&#39;une solution de saccharose à 20% dans une solution saline tamponnée phosphate (1x) pour un minimum de 2 jours ou jusqu&#39;à ce que le cerveau coule au fond du pot de cerveau. </li><li> Utiliser un microtome coulissant congélation pour faire des coupes de cerveau coronale (20-40 um) dans toute l&#39;étendue rostrocaudal de la région d&#39;intérêt. </li><li> Mener immunohistochimie dirigé contre le récepteur étiqueté ou la protéine rapporteur pour déterminer l&#39;emplacement et l&#39;expression du récepteur de concepteur et / ou rapporteur 12. Un protocole de coloration immunohistochimique est fourni sur la page des ressources DREADD wiki 25. </li><li> Montez les sections sur des lames et lamelle SuperFrost-plus à l&#39;aide de 100-200 ul d&#39;un milieu de montage aqueux. </li><li> Effectuer la microscopie à fluorescence sur le tissu du cerveau de vérifier le placement de l&#39;AAV et l&#39;expression des protéines 12,24.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li><li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine.">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li><li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> amnesia and the hippocampal system. , (1993).</li><li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network).">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+efferents+of+the+perirhinal,+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat.">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li><li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe:+implications+for+hippocampal+function.">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li><li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning.">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li><li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning.">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li><li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory:+retrograde+and+anterograde+findings.">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li><li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+preconditioning.">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning.">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules.">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li><li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-2+(AAV-2)+causes+trophoblast+dysfunction,+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia.">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li><li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+of+adeno-associated+virus+(AAV)+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples.">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma.">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+Pctk1,+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats:+impact+on+cognitive+function,+synaptic+plasticity+and.">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , (1996).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat:+a+neurophysiological+and+pathological.">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior.">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li><li>wiki, D. R. E. A. D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2014).</li><li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies.">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li><li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm.">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li><li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators.">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li><li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation.">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li><li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes.">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce protocole décrit comment appliquer une approche pharmacogénétique (DREADD) d&#39;étudier comment une région spécifique du cerveau contribue à une tâche d&#39;apprentissage complexe multi-phase. Avec la possibilité de faire taire temporairement et à distance l&#39;activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau à travers les phases de l&#39;apprentissage, cette combinaison d&#39;approches fournit une plate-forme pour enquêter sur un large éventail de comportements, y compris les formes plus nu...

Un défi passionnant dans le domaine de la neuroscience comportementale est de déterminer les substrats neuronaux de comportements complexes. Un certain nombre de techniques telles que des lésions permanentes au cerveau, l&#39;inactivation temporaire par implants de canules et optogénétique ont été utilisées pour identifier les contributions des régions discrètes du cerveau à sous-composantes de comportements complexes. Bien que ces approches informent notre compréhension de la spécificité régionale lors de l&#39;apprentissage, chaque technique est pas sans limites. Plus précisément, les lésions permanentes sont généralement menées avant le test comportemental, ainsi leurs effets sont présents tout au long de la durée du paradigme. études de canulation qui impliquent la présentation d&#39;un inactivateur de neurones à court terme (par exemple, la tétrodotoxine) peut produire des dommages importants aux tissus du cerveau et peut induire un stress chez les sujets juste avant les tests de comportement. En outre, l&#39;inactivation par insertion de canule est limitée à la région de tissu qui entoure lapointe de la canule. Enfin, tout en optogénétique propose une gamme de flexibilité pour le contrôle temporel de l&#39;activité dans des régions spécifiques du cerveau, il est coût prohibitif et techniquement exigeant. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant une approche pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues, DREADDs) 1,2. Surtout, alors que le concept de la pharmacogénétique est sophistiqué, l&#39;exécution de la technique est simple. Similaires à des méthodes chirurgicales stéréotaxiques traditionnels qui impliquent infusion de la toxine (par exemple, NMDA, l&#39;acide iboténique) dans les régions du cerveau discrètes, cette technique implique l&#39;infusion d&#39;un virus adéno-associé (AAV) qui contient un fragment d&#39;ADN d&#39;un récepteur du G-protéine inhibitrice modifié couplée (hM4Di; le récepteur de designer) dans la région d&#39;intérêt des rongeurs de laboratoire standard (voir Figure 1). Le vecteur viral contient également un rapporteur fluorescent (de mcitrine). Une fois incorporé danspour les cellules, le récepteur de concepteur (et protéine rapporteur) sont au maximum exprimé ~ 3 semaines après la perfusion et peuvent être activés sélectivement pour 2-5 heures par l&#39;administration systémique du médicament concepteur contraire biologiquement inerte, la clozapine N-oxyde (CNO) 1 , 3. Parce que l&#39;expérimentateur est doté de contrôle temporel précis, encore à distance sur l&#39;activité neuronale dans des régions spécifiques du cerveau, la pharmacogénétique combine particulièrement bien avec les paradigmes comportementaux qui sont menées en plusieurs phases. Dans cet exemple, la contribution du cortex rétrosplénial (RSC) au stimulus stimulus apprentissage est comparé à son rôle dans l&#39;apprentissage pavlovien, mais cette combinaison d&#39;approches est bien adapté à un certain nombre de questions qui visent à déterminer comment les régions spécifiques du cerveau contribuent à comportement complexe. En outre, bien que non décrite dans le présent protocole, les approches virales et transgéniques peuvent être utilisés pour atteindre cellule spécifique de type DREADD expression 2. Comme is inhérente à paradigmes comportementaux qui impliquent pharmacologiques et / ou d&#39;autres types de manipulations expérimentales, un examen attentif de la conception expérimentale et l&#39;analyse quantitative ultérieure est nécessaire lors de l&#39;utilisation de l&#39;approche DREADD. Expérimentateurs nouvelles à l&#39;approche DREADD sont renvoyés à un examen complet de la technologie de DREADD actuelle 2. Chaque jour, les organismes apprennent de nouveaux stimuli et les événements et leurs relations les uns aux autres. Même dans un environnement familier, comme la maison, on est prompt à détecter des altérations dans les relations entre les stimuli parce que ces changements peuvent être un facteur prédictif d&#39;événements significatifs. Tel stimulus stimulus (ie, relationnelle) apprentissage implique la conjonction de multiples stimuli et a toujours été associée à l&#39;hippocampe, qui réside au centre du lobe temporal médial 4. Cependant, ne existe pas l&#39;hippocampe, ni agir dans l&#39;isolement; régions corticales à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieurcôté du lobe temporal médian fournir des informations sensorielles critique pour la formation hippocampique 7.5. Études de lésions permanentes traditionnels fournissent des preuves convaincantes de la participation d&#39;un certain nombre de régions corticales (par exemple, les cortex rétrosplénial, postrhinal et entorhinal) dans l&#39;apprentissage de l&#39;hippocampe-dépendante, mais sont limités dans leur capacité à discerner le rôle d&#39;une région en particulier lors des phases distinctes de apprentissage 8-10. Le présent protocole teste l&#39;hypothèse que la SRC est nécessaire pour l&#39;apprentissage de stimulus-relance en faisant taire la SRC au cours d&#39;une seule phase d&#39;un 3-phase de préconditionnement sensorielle paradigme 11,12. En bref, les rats reçoivent des perfusions d&#39;un AAV qui contient le récepteur de concepteur et ~ 3 semaines plus tard sont administré le concepteur médicament (CNO) 30 min avant le début des tests comportementaux. Dans le présent protocole, les rats expérimentaux reçoivent CNO lors de la première phase de test (lorsque stimulus stimulus LearNing se produit) et ils reçoivent véhicule pendant les deux prochaines phases de test. Pour contrôler les effets involontaires des CNO sur le comportement, infuser rats avec le récepteur de concepteur (hM4Di) et injecter avec le véhicule à la place du CNO. Pour tenir compte des effets généraux de perfusion virale et l&#39;expression du récepteur, insuffler un virus de contrôle qui ne contient pas le récepteur de concepteur et administrer CNO. Un certain nombre de différents serotypes de l&#39;AAV sont utilisées pour fournir le matériel génétique. Les NIH Guidelines actuelles pour la recherche impliquant recombinant ou des molécules synthétiques soutient que l&#39;AAV (tous les sérotypes) et constructions de AAV recombinants ou synthétiques, dans lequel le transgène ne code pas non plus un produit de gène potentiellement tumorigène ou une molécule de la toxine et sont produites en l&#39;absence d&#39;un virus auxiliaire, exige BSL-1 (groupe précautions Annexe B-1. risque 1 (RG1) Agents) 13. Un certain nombre de critiques se rapportant à la structure de l&#39;AAV, l&#39;utilité et la sécurité sont disponibles 14,15. En particulier, bien que, En raison de préoccupations relatives à 16,17 et potentiels mécanismes cancérogènes possibles sur la reproduction 18-20 chez les rongeurs, certains établissements exigent l&#39;utilisation de BSL-2 précautions lorsque vous travaillez avec AAV. Vérifiez la BSL appropriée avant d&#39;utiliser en consultation avec les comités de surveillance dans les établissements individuels où la recherche sera menée, les Centers for Disease Control et les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant l&#39;ADN recombinant molécules 13 lors de l&#39;utilisation de vecteurs viraux pour la manipulation génétique aux États-Unis. Les besoins en logement de protection individuelle, formation des enquêteurs, vecteur confinement, décontamination, l&#39;élimination des matériaux décontaminés, animales et post-injection sont spécifiées par ces directives. En outre, consulter et suivre appropriée institutionnel de protection des animaux et utilisation des lignes directrices du comité ou des directives équivalentes du comité de surveillance institutionnels pour assurer la manipulation, l&#39;administration et la disposition de l&#39;AAV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Male, Long Evans Rats, 55-60 d</td>
			<td >Hilltop Lab Animals Inc</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-GFP</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clozapine-N-Oxide</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >4936-10</td>
			<td>Designer Drug</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rat Cage lid (Polycarbonate)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FT 8XL-PC</td>
			<td>Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filer Paper (Replacement)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FP-R-1018XAD</td>
			<td>Filter paper that goes with cage lids</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table Top Vise</td>
			<td >JETS</td>
			<td >2201-265</td>
			<td>For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medline Biohazard liners&#160;</td>
			<td >Staples</td>
			<td >113444</td>
			<td>Biohazard Trash Bags</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle&#160;</td>
			<td >Amazon.com</td>
			<td ></td>
			<td>Biohazard Trash Can</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane, 100 mL</td>
			<td >Patterson Veterinary Supply Inc.&#160;</td>
			<td >07-890-8540</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 942</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 955</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Mask (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 906</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 1474</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microdrill burrs, 0.9 mm</td>
			<td >Fine Science Tools Inc</td>
			<td >19007-09</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Syringe pump with Micro4 Controller&#160;</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model UMP3-1</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit</td>
			<td >Ahdis</td>
			<td >21420</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine Skin Cleanser</td>
			<td >Perdue&#160; Products L.P</td>
			<td >67618-149-04</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triple Antiobiotic Ointment</td>
			<td >Medline Supply</td>
			<td >53329-087-01</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Vet Ointment</td>
			<td >Only Veterinary Supply</td>
			<td >17033-211-38</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite&#160;</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >AD7013MTL</td>
			<td>An alternative to the traditional disection scope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >MS36B</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >28 Gauge 10uL Syringe</td>
			<td >Hamilton&#160;</td>
			<td >80308-701SN</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-018MD</td>
			<td>22&#39;Wx22&#34;Hx16&#34;D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall Modular Test Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-007</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Grid Floor&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-005</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >House Light</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-215M</td>
			<td>Used as the house light and stimulus light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modular Pellet Dispenser&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-203M-45</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pellet Recetacle, Cup Type</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-200R1M</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head Entry Detector for Rat</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-254-CB</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dustless precision food pellets, 45 mg</td>
			<td >Bio-Serv</td>
			<td >F0165</td>
			<td >Behavioral supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cage Speaker for Rat Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-224AM</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable Audio Generator&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ANL-926</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smart Ctrl 8 Input/16 output Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-716P2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large Table Top Cabinet and Power Supply</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >SG-6510D</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCI Interface Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-700P2-R2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19&#34; Monitor</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >COM-103V</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (grannular), 1 kg</td>
			<td >Electron Microsopy Sciences</td>
			<td >19210</td>
			<td>Hazard:&#160; carcinogen, weigh in hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >3724S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >XP Rabbit monoclonal antibody (GFP)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >2956S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rabbit IgG</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >4412S</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td >VWR international</td>
			<td >483111-703</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for remotely silencing neural activity in rodents during discrete phases of learning

Ce protocole décrit comment faire taire temporairement et à distance l&#39;activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau tandis que les animaux sont engagés dans des tâches d&#39;apprentissage et de mémoire. L&#39;approche combine la pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues) avec un paradigme comportemental (préconditionnement sensorielle) qui est conçu pour distinguer entre les différentes formes d&#39;apprentissage. Plus précisément, la livraison médiée viral est utilisé pour exprimer un récepteur du G-protéine inhibitrice génétiquement modifié couplé (designer Receptor) dans une région du cerveau discret dans le rongeur. Trois semaines plus tard, lorsque les niveaux d&#39;expression des récepteurs de concepteur sont élevés, un agent pharmacologique (designer drogues) est administré par voie systémique 30 min avant une session de comportement spécifique. Le médicament a une affinité pour le récepteur de créateur et, par conséquent conduit à l&#39;inhibition des neurones qui expriment le récepteur de concepteur, mais est par ailleurs biologiquement inerte. La région du cerveau reste réduit au silence pour 2-5 heures (Depending de la dose et la voie d&#39;administration). À la fin du paradigme comportemental, le tissu cérébral est évaluée pour le placement correct et l&#39;expression du récepteur. Cette approche est particulièrement utile pour déterminer la contribution des différentes régions du cerveau à des composants spécifiques de comportement et peut être utilisé dans un certain nombre de paradigmes comportementaux.

Résultats de comportement À la fin de l&#39;expérience, l&#39;efficacité de l&#39;inactivation temporaire spécifique à la région doit être évaluée quantitativement et qualitativement. Le présent exemple concerne un paradigme trois phases du comportement (préconditionnement sensoriel), dans lequel CNO a été administrée afin d&#39;atténuer l&#39;activité neuronale dans le RSC pendant les sessions de préconditionnement pour tester l&#39;hypothèse que la SRC est nécessaire pour ...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning at JoVE.com

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Une méthode de distance Silencing activité neuronale chez les rongeurs Pendant phases distinctes de l&#39;apprentissage

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

14.6K vues.  Oberlin College. This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Vidéo: A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of humans with orofacial pain. To measure meal duration unrestrained rats are continuously kept in sound attenuated, computerized feeding modules for days to weeks to record feeding behavior. These sound-attenuated chambers are equipped with chow pellet dispensers. The dispenser has a pellet trough with a photobeam placed at the bottom of the trough and when a rodent removes a pellet from the feeder trough this beam is no longer blocked, signaling the computer to drop another pellet. The computer records the date and time when the pellets were taken from the trough and from this data the experimenter can calculate the meal parameters. When calculating meal parameters a meal was defined based on previous work and was set at 10 min (in other words when the animal does not eat for 10 min that would be the end of the animal&#39;s meal) also the minimum meal size was set at 3 pellets. The meal duration, meal number, food intake, meal size and inter-meal interval can then be calculated by the software for any time period that the operator desires. Of the feeding parameters that can be calculated meal duration has been shown to be a continuous noninvasive biological marker of orofacial nociception in male rats and mice and female rats. Meal duration measurements are quantitative, require no training or animal manipulation, require cortical participation, and do not compete with other experimentally induced behaviors. These factors distinguish this assay from other operant or reflex methods for recording orofacial nociception.

A lengthening in meal duration represents orofacial nociceptive behavior in rodents similar to the guarding behavior of humans with orofacial pain. Eating is a behavior that requires no training or animal manipulation, requires cortical participation, and is not competing with other experimentally induced behaviors, distinguishing this assay from alternative reflex or operant measurements.

La durée du repas comme mesure des réponses nociceptives orofaciales chez les rongeurs

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

Recherche

Sciences du comportement

Automated Visual Cognitive Tasks for Recording Neural Activity Using a Floor Projection Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have developed visual cognitive tasks for rats using the Floor Projection Maze1,2&#160;that are optimized for visual abilities of rats permitting stronger comparisons of experimental findings with other species.
In order to investigate neural correlates of learning and memory, we have integrated electrophysiological recordings into fully automated cognitive tasks on the Floor Projection Maze1,2. Behavioral software interfaced with an animal tracking system allows monitoring of the animal's behavior with precise control of image presentation and reward contingencies for better trained animals. Integration with an in vivo electrophysiological recording system enables examination of behavioral correlates of neural activity at selected epochs of a given cognitive task.
We describe protocols for a model system that combines automated visual presentation of information to rodents and intracranial reward with electrophysiological approaches. Our model system offers a sophisticated set of tools as a framework for other cognitive tasks to better isolate and identify specific mechanisms contributing to particular cognitive processes.

We describe protocols for training rats for chronic electrophysiological recordings in fully automated cognitive tasks on a Floor Projection Maze.

Tâches cognitives visuels automatisés pour l&#39;enregistrement de neurones activité en utilisant une projection au sol Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have ...

Measuring Neural and Behavioral Activity During Ongoing Computerized Social Interactions: An Examination of Event-Related Brain Potentials

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, an understanding of how perceptions of social exclusion develop over the course of a social interaction is important for advancing treatments aimed at lessening the harmful costs of being excluded. To date, most scientific examinations of social exclusion have looked at exclusion after a social interaction has been completed. While this has been very helpful in developing an understanding of what happens to a person following exclusion, it has not helped to clarify the moment-to-moment dynamics of the process of social exclusion. Accordingly, the current protocol was developed to obtain an improved understanding of social exclusion by examining the patterns of event-related brain activation that are present during social interactions. This protocol allows greater precision and sensitivity in detailing the social processes that lead people to feel as though they have been excluded from a social interaction. Importantly, the current protocol can be adapted to include research projects that vary the nature of exclusionary social interactions by altering how frequently participants are included, how long the periods of exclusion will last in each interaction, and when exclusion will take place during the social interactions. Further, the current protocol can be used to examine variables and constructs beyond those related to social exclusion. This capability to address a variety of applications across psychology by obtaining both neural and behavioral data during ongoing social interactions suggests the present protocol could be at the core of a developing area of scientific inquiry related to social interactions.

Research on social exclusion has grown tremendously in recent years. As the field expands, it is imperative to develop sophisticated methodologies allowing for the simultaneous measurement of neural and behavioral outcomes during social exclusion. This protocol utilizes event-related brain potentials to record ongoing neural activity during computerized social interactions.

Mesure Neural and Behavioral activité au cours de cours informatisés Interactions sociales: Un examen des potentiels cérébraux événements liés

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, ...

The Double-H Maze: A Robust Behavioral Test for Learning and Memory in Rodents

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their behavioral flexibility and required memory duration, the number of goals and pathways, and also the overall task complexity. A confounding feature in many of these tasks is the lack of control over the strategy employed by the rodents to reach the goal, e.g., allocentric (declarative-like) or egocentric (procedural) based strategies. The double-H maze is a novel water-escape memory task that addresses this issue, by allowing the experimenter to direct the type of strategy learned during the training period. The double-H maze is a transparent device, which consists of a central alleyway with three arms protruding on both sides, along with an escape platform submerged at the extremity of one of these arms.
Rats can be trained using an allocentric strategy by alternating the start position in the maze in an unpredictable manner (see protocol 1; &#167;4.7), thus requiring them to learn the location of the platform based on the available allothetic cues. Alternatively, an egocentric learning strategy (protocol 2; &#167;4.8) can be employed by releasing the rats from the same position during each trial, until they learn the procedural pattern required to reach the goal. This task has been proven to allow for the formation of stable memory traces.
Memory can be probed following the training period in a misleading probe trial, in which the starting position for the rats alternates. Following an egocentric learning paradigm, rats typically resort to an allocentric-based strategy, but only when their initial view on the extra-maze cues differs markedly from their original position. This task is ideally suited to explore the effects of drugs/perturbations on allocentric/egocentric memory performance, as well as the interactions between these two memory systems.

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

Le Double-H Maze: un test comportemental robuste pour l&#39;apprentissage et la mémoire chez les rongeurs

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their ...

Quantifying Learning in Young Infants: Tracking Leg Actions During a Discovery-learning Task

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning process. Here a method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process. This discovery-learning task uses an infant activated mobile that rotates and plays music based on specified leg action of infants. Supine infants activate the mobile by moving their feet vertically across a virtual threshold. This paradigm is unique in that as infants independently discover that their leg actions activate the mobile, the infants&#8217; leg movements are tracked using a motion capture system allowing for the quantification of the learning process. Specifically, learning is quantified in terms of the duration of mobile activation, the position variance of the end effectors (feet) that activate the mobile, changes in hip-knee coordination patterns, and changes in hip and knee muscle torque. This information describes infant exploration and exploitation at the interplay of person and environmental constraints that support task-specific action. Subsequent research using this method can investigate how specific impairments of different populations of infants at risk for movement disorders influence the discovery-learning process for task-specific action.

A method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process.

Quantifier l&#39;apprentissage chez les jeunes enfants: Suivi Leg Actions Au cours d&#39;une tâche de découverte-learning

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning ...

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for quantifying locomotor deficits in rodents is to measure minute disturbances of unconstrained gait overground (e.g., manual BBB score or automated CatWalk). However, cortical inputs are not required for the generation of basic locomotion produced by the spinal central pattern generator (CPG). Thus, unconstrained walking tasks test locomotor deficits due to motor cortical impairment only indirectly. In this study, we propose a novel, precise foot-placement locomotor task that evaluates cortical inputs to the spinal CPG. An instrumented peg-way was used to impose symmetrical and asymmetrical locomotor tasks mimicking lateralized movement deficits. We demonstrate that shifts from equidistant inter-stride lengths of 20% produce changes in the forelimb stance phase characteristics during locomotion with preferred stride length. Furthermore, we propose that the asymmetric walkway allows for measurements of behavioral outcomes produced by cortical control signals. These measures are relevant for the assessment of impairment after cortical damage.

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

Asymétrique Walkway: A Novel Assay pour l&#39;étude du comportement asymétrique Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Using the Activity-based Anorexia Rodent Model to Study the Neurobiological Basis of Anorexia Nervosa

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A challenging illness to treat, due to the lack of understanding of the underlying neurobiology, AN has the highest mortality rate among psychiatric illnesses. To address this need, neuroscientists are using an animal model to study how neural circuits may contribute toward vulnerability to AN and may be affected by AN. Activity-based anorexia (ABA) is a bio-behavioral phenomenon described in rodents that models the key symptoms of anorexia nervosa. When rodents with free access to voluntary exercise on a running wheel experience food restriction, they become hyperactive &#8211; running more than animals with free access to food. Here, we describe the procedures by which ABA is induced in adolescent female C57BL/6 mice. On postnatal day 36 (P36), the animal is housed with access to voluntary exercise on a running wheel. After 4 days of acclimation to the running wheel, on P40, all food is removed from the cage. For the next 3 days, food is returned to the cage (allowing animals free food access) for 2 hr daily. After the fourth day of food restriction, free access to food is returned and the running wheel is removed from the cage to allow the animals to recover. Continuous multi-day analysis of running wheel activity shows that mice become hyperactive within 24 hr following the onset of food restriction. The mice run even during the limited time during which they have access to food. Additionally, the circadian pattern of wheel running becomes disrupted by the experience of food restriction. We have been able to correlate neurobiological changes with various aspects of the animals&#8217; wheel running behavior to implicate particular brain regions and neurochemical changes with resilience and vulnerability to food-restriction induced hyperactivity.

Here we present a protocol to induce activity-based anorexia (ABA) in female adolescent mice. ABA is a condition of hyperactivity evoked by imposing food restriction on rodents with access to a running wheel. This phenomenon is being used as a model to study the underlying neurobiology of anorexia nervosa.

Utilisation de l&#39;anorexie rongeurs modèle basée sur les activités à l&#39;étude des bases neurobiologiques de l&#39;anorexie mentale

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental paradigms and analysis tools have been limited to constrained laboratory tasks and contexts due to technical limitations imposed by the available set of measuring and analysis techniques and the age of the subjects. These limitations severely limit the study of developmental neural dynamics and associated neural networks engaged in cognition, perception and action in infants performing &#8220;in action and in context&#8221;. This protocol presents a novel approach to study infants and young children as they freely organize their own behavior, and its consequences in a complex, partly unpredictable and highly dynamic environment. The proposed methodology integrates synchronized high-density active scalp electroencephalography (EEG), inertial measurement units (IMUs), video recording and behavioral analysis to capture brain activity and movement non-invasively in freely-behaving infants. This setup allows for the study of neural network dynamics in the developing brain, in action and context, as these networks are recruited during goal-oriented, exploration and social interaction tasks.

This protocol presents a novel methodology for the neural decoding of intent from freely-behaving infants during unscripted social interaction with an actor. Neural activity is acquired using non-invasive high-density active scalp electroencephalography (EEG). Kinematic data is collected with inertial measurement units and supplemented with synchronized video recording.

Une nouvelle approche expérimentale et analytique à l&#39;multimodal Neural Décodage d&#39;intention lors de l&#39;interaction sociale dans Librement-comporter nourrissons humains

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in mice: the Feeding Experimentation Device (FED). FED is an open-source system that was designed to facilitate flexibility in food intake studies. Due to its compact and battery powered design, FED can be placed within standard home cages or other experimental equipment. Food intake measurements can also be synchronized with other equipment in real-time via FED's transistor-transistor logic (TTL) digital output, or in post-acquisition processing as FED timestamps every event with a real-time clock. When in use, a food pellet sits within FED's food well where it is monitored via an infrared beam. When the pellet is removed by the mouse, FED logs the timestamp onto its internal secure digital (SD) card and dispenses another pellet. FED can run for up to 5 days before it is necessary to charge the battery and refill the pellet hopper, minimizing human interference in data collection. Assembly of FED requires minimal engineering background, and off-the-shelf materials and electronics were prioritized in its construction. We also provide scripts for analysis of food intake and meal patterns. Finally, FED is open-source and all design and construction files are online, to facilitate modifications and improvements by other researchers.

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device (FED) is an open-source device for measuring food intake in mice. FED can also synchronize food intake measurements with other techniques via a real-time digital output. Here, we provide a step-by-step tutorial for the construction, validation, and usage of FED.

Alimentation Expérimentation Dispositif (FED): Construction et validation d&#39;un périphérique Open-source pour la mesure de la prise alimentaire chez les rongeurs

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. Fundamental mechanisms that underlie this temporal control are widely studied using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism. In flies, the clock is typically studied by analyzing multiday locomotor recording. Such a recording shows a complex bimodal pattern with two peaks of activity: a morning peak that happens around dawn, and an evening peak that happens around dusk. These two peaks together form a waveform that is very different from sinusoidal oscillations observed in clock genes, suggesting that mechanisms in addition to the clock have profound effects in producing the observed patterns in behavioral data. Here we provide instructions on using a recently developed computational method that mathematically describes temporal patterns in fly activity. The method fits activity data with a model waveform that consists of four exponential terms and nine independent parameters that fully describe the shape and size of the morning and evening peaks of activity. The extracted parameters can help elucidate the kinetic mechanisms of substrates that underlie the commonly observed bimodal activity patterns in fly locomotor rhythms.

A method to quantify the main temporal features seen in fly circadian locomotor rhythms is presented. The quantification is achieved by fitting fly activity with a multi-parametric model waveform. The model parameters describe the shape and size of the morning and evening peaks of daily activity.