Os autores gostariam de agradecer ao Dr. John Harbell por seu apoio e tempo científico dedicado ao projecto IET. Os autores também gostaria de agradecer a Beiersdorf AG (Alemanha), IIVS (EUA), Mary Kay Inc. (EUA), Avon Products Inc. (EUA), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Suíça), Pierre Fabre Laboratoire (França), Harlan Laboratories (Reino Unido), e LVMH Parfume (França) para a participação no Centro de Estudos Multi-Internacional de pré-validação e de validação do teste de irritação ocular 15.

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model.">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378 (2009).</li><li>Harbell, J., Curren, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+the+prediction+of+ocular+and+dermal+toxicity.">In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity.</a> Handbook of Toxicology. , (2001).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation.">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li><li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation.">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li><li>MatTek Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+validation+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation.">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructed+Human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+Test+Method+for+Identifying+Chemicals+Not+Requiring+Classification+and+Labelling+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.+Draft+proposal+for+a+new+test+guideline..">Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. 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Taxas de publicação do presente artigo foram pagos pela MatTek Corporation.

Nós apresentamos o Olho Irritação Test (Figura 1), que foi desenvolvido para o modelo de tecido EpiOcular. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS Categorias 1 e 2 combinados) a partir de materiais que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria) com alto grau de sensibilidade e especificidade 17. O IET, tal como apresentado aqui não discrimina entre GHS Categoria 1 de Categoria 2 produtos químicos. O EIT foi validado para a classificação e rotulagem de irritação ocular potencial de uma vasta gama de produtos químicos, incluindo cosméticos e farmacêuticos ingredientes. Em conjunto com outros testes in vitro, o IET irá servir como um substituto para o ensaio de irritação in vivo do olho de coelho. O IET utiliza dois protocolos similares mas distintas de materiais líquidos e sólidos, os quais variam no tempo de exposição e períodos de incubação de pós-exposição (Figura 1). O endpoint utilizado na EITé a viabilidade do tecido, determinada pelo ensaio de MTT, que tenha sido previamente usado em modelos validados de tecidos epiteliais humanos 20,21. Para realizar este ensaio, não é necessário nenhum equipamento especial além de equipamentos de cultura de células padrão. Devido ao nível elevado de reprodutibilidade de tecido-a-tecido, n = 2 tecidos, em vez de o habitualmente recomendado n = 3 são utilizados. A capacidade de utilizar n = 2 tecidos é um aspecto crítico do protocolo, uma vez que permite que um operador experiente para processar simultaneamente dois tecidos, minimizando assim a variabilidade do ensaio que podem surgir devido ao diferente tratamento dos tecidos individuais 14. Além disso, usando n = 2 tecidos por artigo, o teste de irritação de 10 substâncias de teste do mesmo estado físico (sólido ou líquido), juntamente com os controlos positivos e negativos, pode ser avaliada utilizando um kit (24 tecidos). Outros pontos-chave que garantem classificação confiável de materiais estão as especificações para o controlo positivo substance (a viabilidade do tecido ≤50.0%), reprodutibilidade entre os tecidos duplicados (diferença &lt;20,0%), e leituras de controle negativo (&gt; 0,8 e &lt;2,5). Ao realizar o teste IET, é importante para aderir ao protocolo e validado para a dosagem sugerida e enxaguamento horários (Tabelas 3 e 4), uma vez que o desvio a partir do protocolo ou alterações nos períodos de incubação pode resultar em resultado alterada. Da mesma forma, os desvios do tempo de 3 horas para MTT incubação irá resultar em leituras diferentes MTT e pode afetar o resultado do ensaio. Ocasionalmente, um produto químico de teste pode ter propriedades ópticas ou outras que possam interferir com o ensaio de viabilidade de tecido ou a redução de MTT causa de MTT. Por exemplo, um produto químico de teste pode reduzir directamente o MTT em azul-violeta do produto de reacção, ou pode ser uma substância que absorve a luz colorida no mesmo intervalo de formazano de MTT (~ 570 nm). No entanto, esses produtos químicos de teste vai present um problema apenas, se no momento do ensaio MTT, uma quantidade suficiente do material ainda está presente no (ou absorvidas por) o tecido. Para evitar esta interferência, procedimentos de lavagem extensivos são incorporados ao protocolo de TIE. Se a lavagem não remove o TA eo TA interfere com a redução do MTT, controles adicionais devem ser usadas para detectar e corrigir para ele. Resumidamente, se houver suspeita de redução MTT direta da substância química de ensaio, 50 jul (ou 50 mg de sólidos) do produto químico em questão é incubada durante 3 horas com uma solução de MTT a trabalhar na SCC (NC, 50 mL de água deionizada estéril, deve ser executados simultaneamente). Se a solução MTT fica azul-roxa, o artigo de teste se presume ter reduzido o MTT. Neste caso, um teste de funcionamento utilizando os controlos de tecidos mortos a criodessecagem, devem ser realizadas para avaliar se a substância de ensaio é obrigatório para o tecido e que conduz a uma redução do MTT sinal falso. Se houver redução MTT apreciável no TA-exposto, controlo de tecido morto(em relação à quantidade no tecido viável não tratada), a viabilidade dos tecidos significativo do artigo de teste deve ser corrigida subtraindo a viabilidade média do controlo morto. O IET erra no lado da segurança, como demonstrado pela baixa incidência de falsos negativos classificações 14,15,18. É importante ressaltar que nenhum dos GHS Categoria 1 produtos químicos, que são corrosivos para o olho e que representam o mais sério perigo ocular, foram classificadas como não-irritante neste ensaio 14,15,18,19. Finalmente, uma das principais vantagens do método de ensaio rhce em vitro, é a possibilidade de testar puro líquido e matérias sólidas (as quais não é possível com culturas de células, submersas bidimensionais). O EIT contribuirá significativamente para a determinação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS. A substituição dos animais para determinar otoxicidade cular tem sido uma meta da pesquisa toxicológica por muitos anos. O método de ensaio EIT concluiu um estudo de validação formal apoiado por EURL ECVAM em 2014 eo EpiOcular EIT foi implementada nas Orientações de ensaio da OCDE como a OCDE TG 492 em 2015.

Produtos de consumo, como cosméticos, detergentes e produtos de limpeza domésticos incluem uma variedade de produtos químicos que podem induzir sérios danos se entrar em contato com os olhos. Portanto, o teste desses agentes para irritação dos olhos é exigido pelas agências reguladoras dos EUA e da UE para garantir a segurança dos consumidores 1. Uma avaliação do potencial de irritação ocular de misturas e formulações é também um requisito para o cumprimento REACH (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) legislação para a rotulagem dos ingredientes cosméticos no âmbito da Directiva Cosméticos da UE para o transporte de produtos químicos, e para a rotulagem dos pesticidas e produtos domésticos 2. Atualmente, as agências reguladoras requerem avaliação de perigo ocular usando o Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS) 3. GHS é baseada principalmente no teste de irritação ocular de Draize, o ensaio de irritação ocular mais amplamente utilizado em que substâncias estranhas e mixtures são introduzidos directamente no saco conjuntival do olho do coelho 4. Segundo a classificação GHS, GHS Categoria 1 (substâncias corrosivas oculares) refere-se a testar produtos químicos que causam lesão inicial grave para os tecidos oculares ou sérios danos aos olhos e visão que não é totalmente reversível nos 21 dias após a exposição 3,5. GHS Categoria 2 se refere a testar substâncias químicas que produzem mudanças significativas no olho que são totalmente reversível nos 21 dias de exposição. Produtos químicos de teste que não são corrosivos ou irritantes são referidos como GHS n Categoria. Por mais de 40 anos, o teste de olho de coelho Draize tem sido criticado por sua falta de reprodutibilidade, superestimação da resposta humana, bem como a utilização de animais vivos 5-8. Estas preocupações têm incentivado muitas propostas de aperfeiçoamento, redução e substituição do ensaio in vivo 9. A necessidade de alternativas à experimentação animal validados foi reforçadapela adopção da sétima alteração à Directiva Cosméticos, que proibiu a utilização de animais na avaliação da segurança dos produtos cosméticos (em 2005) e ingredientes (em 2009) 2. Desde 1996, o modelo de tecido córnea semelhante reconstruído tem sido amplamente utilizada na indústria cosmética para avaliar o potencial de irritação de matérias-primas, as formulações à base de surfactante, e misturas que são concebidos para serem utilizados no composto, ou nas imediações do, olho 10-13. A utilização do modelo de tecido rhce permite a aplicação tópica directa do material de teste sobre a superfície do tecido, na sua forma nativa, não diluído. Desta forma, as formulações não solúveis em água podem ser controlados sem a sua diluição com solventes. Em resposta a EURL do ECVAM (Laboratório de Referência da União Europeia Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) pedido de um método amplamente aplicável, simples e econômica do Irritação dos olhos Test (EIT), que utiliza um single tempo de exposição e é capaz de separar substâncias irritantes oculares e corrosivos a partir de materiais que não necessitam de marcação foi desenvolvido (Figura 1) 14. Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e 39 de sólidos), o IET alcançado 95,5 / 68,2 / e 81,8% de sensibilidade / especificidade e precisão (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS &amp; A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS &amp; A global. Em 2007, um estudo de pré-validação multi-laboratório patrocinado pela Cosmetics Europa (anteriormente Colipa), sob os auspícios do ECVAM EURL avaliada a relevância ea fiabilidade do IET, com o objetivo de trazê-lo para validação formal 15. Neste estudo, 298 ensaios independentes foram realizados em sete laboratórios independentes. Os resultados do estudo demonstraram concordância de 99,7% na previsão com baixos coeficientes de variação entre todos os laboratórios participantes 15. Como resultado, em 2010 o protocolo EIT entrou formal EURL ECVAMprograma de validação. O estudo de validação utilizados 104 produtos químicos de teste codificados, incluindo substâncias individuais e misturas químicas, para os quais os dados de referência in vivo (dados de irritação ocular de Draize) estavam disponíveis. Baseado no sucesso deste trabalho, uma diretriz projecto de ensaio da OCDE foi apresentado em 2014. Prevê-se que o IET contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS da ONU.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

Para cumprir com a Emenda Sétimo à legislação Directiva Cosméticos e REACH EU EU, são necessários que não envolvam animais métodos alternativos validados para avaliação confiável e precisa de toxicidade ocular no homem. Para endereçar esta necessidade, nós desenvolvemos um teste de irritação ocular (TIE), que utiliza um modelo tridimensional humana reconstruída córnea epitelial semelhante (rhce) de tecido que é baseado em células humanas normais. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS categorias 1 e 2 combinado) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria). O teste utiliza dois protocolos distintos, um concebida para produtos químicos líquidos e um segundo protocolo, similar para artigos de teste sólidos. O modelo de previsão IET utiliza um único período de exposição (30 minutos para os líquidos, para 6 h de sólidos) e uma única viabilidade do tecido de corte (60,0% como determinado pelo ensaio de MTT). Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e sólidos 39) IET alcançado 95,5 / 68,2 / 81,8% e sensitivity / especificidade e precisão (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS &amp; A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS &amp; A global. O EIT contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de produtos químicos líquidos e sólidos sem a utilização de animais para atender aos requisitos regulamentares de teste. O método EpiOcular EIT foi implementada em 2015 para as Directrizes de Ensaio da OCDE como TG 492.

Resultados IET representativos realizados com 10 artigos de teste (TA) e controlos negativos e positivos estão apresentados na Tabela 6 e na Figura 3. A média de OD = 1,31 para o NC corresponde a 100% de viabilidade do tecido, portanto, o PC (média OD = 0,41) tinha a viabilidade do tecido relativa de 31,2%. Quando o protocolo IET foi realizado em 15 experiências independentes válidos em 7 laboratórios usando o protocolo de exposição líquido e em 8 experiências válidas independentes em 4 laboratórios, utilizando o protocolo de exposição contínua, a viabilidade média dos tecidos para o PC, utilizando o protocolo de líquido foi de 36,4 ± 4,0 e 32,3% ± 6,4% para o protocolo de sólidos. Em todos os casos, os resultados do controlo positivos estavam abaixo do valor de corte de 60,0% 15. Como mostrado na Figura 3, a TA1, TA2, TA4, TA7, e tinha TA8 viabilidades dos tecidos&gt; 60,0% e, portanto, foram classificados como &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10 teve viabilidades tecido X04; 60,0% e, portanto, foram classificados como &quot;I&quot;. A diferença de viabilidade do tecido entre os tecidos foi duplicado &lt;20,0% para todas as agências de viagens com uma exceção de TA2. Portanto, os resultados para todos os artigos de teste, com uma exceção de TA2, foram considerados &quot;qualificados&quot; desde que se conheceram todos os critérios de aceitação do IET (Seção 10.2). Devido a grande variabilidade entre tecidos em duplicado para TA2 na experiência inicial, uma segunda experiência foi necessária para obter resultados IET qualificados. O método de ensaio EIT como aqui descrito, utilizando o modelo de tecido RHCE foi utilizado para a avaliação da irritação ocular em diversos estudos de validação multilaboratory, incluindo a validação formal pelo ECVAM EURL / Cosméticos Europa 15,17-19. Em todos os estudos, o IET se mostrou reprodutível e foi capaz de identificar corretamente produtos químicos (ambas as substâncias e misturas) que não requer classificação e rotulagem da irritação ocular ou lesões oculares graves acgundo ONU GHS 15,17-19. O método de ensaio EIT cumprido os critérios de aceitação do grupo de gestão de validação (VMG), para irritação dos olhos para a sensibilidade, especificidade e acurácia geral e atualmente encontra-se pendente implementação formal como um substituto parcial para o teste in vivo coelho Draize 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema do protocolo EIT para artigos de teste líquidos e sólidos abreviações utilizadas: AM, meio de ensaio;. SCC, condições de cultura padrão; PBS de Dulbecco tamponada com fosfato salino; RT, temperatura ambiente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figura 2:. A configuração da placa de 96 poços normalizada para o teste de viabilidade MTT tecido Duas alíquotas de 200 ul são transferred aos poços apropriados de uma pré-marcado com 96-poços. Abreviaturas utilizadas: NC, controle negativo; PC, controlo positivo; TA1-TA20, artigos de teste 1-20; Solução em branco, extrator. 96- configuração placa MTT é usado com planilha Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido RHCE e os resultados do IET. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figura 3: Resultados do IET obtida para 10 artigos de teste, NC e controles de PC usando o modelo de tecido RHCE O gráfico é gerado a partir de uma planilha do Excel projetado para apresentar os resultados do IET.. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido&gt; 60,0% são classificados como não-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Tempo para as etapas de trabalho protocolo EIT (um dia de trabalho para um operador) começam </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada linha corresponde a um par de tecidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pedido de passos: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Líquidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposição </td><td> Pós- Embeber </td><td> Pós- <td> MTT Reação </td><td> MTT Extração </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> depois </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> AT 4- </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3:. Cronograma de amostras para testes de artigos de teste líquidos etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste (TAS), lavagem e pós-estabilização, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e medição de OD MTT são apresentados nas colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o teste de ensaio de 10 assistentes técnicos e controles pode ser terminado em um dia. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Hora de início para as etapas do protocolo do IET (2 dias trabalhar para um operador) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada linha corresponde a um par de tecidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dia 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Dia 2 (dia seguinte) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pedido de passos: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sólidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposição </td><td> Pós- Embeber </td><td> Pós- Incubaction </td><td> MTT Reação </td><td> MTT Extração </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 6 hr </td><td> 26 min </td><td> 18 hr </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 12:56 </td&gt; <td> depois </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 12:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> AT 4- </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 4: calendário amostra para o teste dos artigos em ensaio sólidos. Etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste, Enxaguar e Pós-molhe, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e Mensuração de MTT OD são apresentados em colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o ensaio testando 10 ATs e controles é realizado ao longo de um período de dois dias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Quantidade </td><td> Reagente </td><td> Condições de armazenamento </td><td> Fonte </td><td> Descrição </td><td> Data de validade </td></tr><tr><td> 1 frasco, 2 ml </td><td> Concentrado de MTT (MTT-100-CON) </td><td> Protegido da luz (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Congelado concentrado MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 frasco, 8 ml </td><td> MTT diluente </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Para a diluição de concentrado de MTT antes da utilização no ensaio de MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 garrafa, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Solução de extracção </td><td> N / D </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Componentes do MTT-100 kit de ensaio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Código N ° </td><td> Tecido </td><td colspan="2"> Dados não tratados </td><td colspan="2"> Dados corrigidos em branco </td><td rowspan="2"> média de OD </td><td rowspan="2"> % De viabilidade </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98,4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32,8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93,5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63,4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10,4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.227 </td><td> 93,4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36,7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30,6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87,5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71,4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19,4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> significar </td><td> Dif. </td><td> média de </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Classificação </td></tr><tr><td></td><td> de OD </td><td> de OD </td><td> viabilidades [%] </td><td> de viabilidades </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1.314 </td><td> 0,041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0,043 </td><td> 31,2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0,127 </td><td> 98,3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0,333 </td><td> 76,1 </td><td> 25.36 </td><td> 12,68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11,6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0,078 </td><td> 90,4 </td><td> 5,94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41,8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34,6 </td><td> 8,07 </td><td> 4.03 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0,101 </td><td> 83,7 </td><td> 7,65 </td><td> 3,82 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75,0 </td><td> 7,23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4,74 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15,4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr></tbody></table> Tabela 6:. Resultados do IET obtidos por 10 artigos de teste, controles NC e PC As mesas estão produced por uma planilha do Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido e os resultados do IET. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido&gt; 60,0% são classificados como não-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.0K visualizações.  MatTek Corporation.  Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria). 

Vídeo: Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bioengenharia

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...