Os autores gostariam de agradecer a ZEBET no BfR (Alemanha), BASF SE (Alemanha), Inc. IIVS (EUA), Zet-LSL (Áustria) para a participação no estudo multicêntrico de validação Internacional da EpiDerm Modificado SIT (5 ).

I. condicionado Tissue - Dia 0 <ol><li> Após o recebimento do kit EpiDerm EPI-200 SIT, verificar todos os componentes do kit de integridade (para detalhes veja a Tabela kit de reagentes e equipamentos específicos). </li><li> Para cada três tecidos EpiDerm, prepare uma placa de 6 poços estéreis pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. </li><li> Em condições estéreis, abrir o saco plástico contendo a placa de 24 poços contendo os tecidos EpiDerm e remova a gaze estéril. </li><li> Use uma pinça estéril, para remover cada inserção que contém o tecido EpiDerm e coloque a pastilha na placa de 24 poços vazios. Durante esta etapa, remover qualquer restantes transporte agarose que adere às paredes externas da inserção pelo gentil blotting em papel de filtro estéril. </li><li> Dentro dos próximos cinco minutos, inspecionar visualmente os tecidos. Não use tecidos defeituosos ou tecidos que são completamente cobertas com líquido. </li><li> Utilizando uma zaragatoa de algodão ponta, com cuidado secar a superfície dos tecidos. Tente não tocar o tecido diretamente - efeitos capilares são suficientes para eliminar a umidade da superfície do tecido. </li><li> Após a secagem da superfície do tecido, a transferência de três tecidos para a linha superior das placas de seis poços pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. Libertar quaisquer bolhas de ar aprisionadas debaixo do inserções. </li><li> Coloque as placas de 6 poços contendo as inserções na incubadora para a 60 ± 5 min de pré-incubação a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR (Umidade Relativa). </li><li> No final dos anos 60 período de 5 min ± pré-incubação, transferir as inserções dos poços superior nos poços inferiores da placa de 6 poços. Coloque as placas de volta para a incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por um dia para o outro pré-incubação (18 ± 3 h). </li><li> Coloque o restante do meio de ensaio para a (5 ± 3 ° C). Geladeira Após a noite de pré-incubação, os produtos químicos teste pode ser aplicado para os tecidos EpiDerm. Nota: O procedimento de pré-incubação pode ser encurtado em caso de entrega tardia do tecido (por exemplo, se os tecidos chegam na quarta-feira em vez de terça-feira). </li></ol> II. Exposição a substâncias químicas - Dia 1 <ol><li> Prepare uma placa de 6 poços por produto químico teste preenchendo a linha superior apenas com 0,9 ml por poço de meio de ensaio. </li><li> Aproximadamente 5 minutos antes da exposição prevista para produtos químicos, remover as placas de 6 poços contendo os tecidos pré-condicionado da incubadora. </li><li> Avaliar a superfície dos tecidos e retirar a umidade usando cotonetes estéreis. </li><li> Rotular todos os seis tampas bem-placa com os códigos de testar o material ou nomes. </li><li> Dose os tecidos com os produtos químicos teste em intervalos de 1 minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição. Mantenha as placas com tecidos dosado na capa estéril, até que o tecido última é dosado. </li><li> Para testar produtos químicos líquidos, dispensar 30 mL da solução diretamente sobre o tecido e colocar a malha de nylon na superfície dos tecidos. Se necessário, suavemente a posição da malha usando o bulbo de vidro dirigido Pasteur pipeta. Não pressione a superfície do tecido. </li><li> Para semi-sólidos de teste, use uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 mL diretamente sobre o tecido. Se necessário, a disseminação química com pipeta Pasteur para cobrir a superfície do tecido, tanto quanto possível. </li><li> Para materiais sólidos, pouco antes da aplicação da substância de ensaio, umedecer a superfície do tecido com 25 mL de DPBS estéril. Isto irá melhorar o contato da superfície do tecido com a substância química de ensaio. Encha uma colher de 25 mg aplicação calibrada afiada (ou qualquer outra ferramenta apropriada) com aproximadamente 25 mg de material finamente moído teste. Aplicar o teste químico sólido à superfície do tecido. Se necessário, use uma lâmpada de cabeça Pasteur Pipeta para esvaziar completamente a colher. Agite suavemente o inserções para melhorar a difusão do sólido na superfície. </li><li> No caso de substâncias com consistência cerosa, tentar formar um &quot;cookie como&quot; flat pedaço de cerca de 8 mm de diâmetro e coloque-o em cima do tecido, que foi previamente umedecido com DPBS estéril. Para melhorar o contato entre substância e tecidos, pesar o &quot;cookie&quot; com um aço inoxidável ou de plástico ajuda. </li><li> Aplicar DPBS como o controle negativo e SDS 5% como controle positivo para os tecidos de controle. </li><li> Após a administração do tecido passado, transferir todas as placas para 35 ± 1 minuto para a incubadora umidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). </li><li> Após a 35 ± 1 minuto de incubação a 37 ° C remover todas as placas da incubadora. Coloque as placas na capa estéril e esperar até que um período de 60 minutos de exposição química é preenchido para o primeiro tecido dosado. </li><li> Depois iniciar o procedimento de lavagem usando a inserir um intervalo de tempo por minuto (para um seguroe que o tempo total de exposição para cada inserção é de 60 minutos). </li><li> Use um frasco de lavagem para lavar os tecidos com DPBS estéril. Preencha o tecido inserir 15 vezes usando um fluxo constante de DPBS e esvaziá-lo (Nota:. Para os tecidos com uma malha de nylon, lavar a superfície do tecido 5 vezes e remover a malha cuidadosamente com o apontado, pinças afiadas Depois, continue com os restantes 10 lavagens). </li><li> Após o 15 enxaguar utilizando o frasco de lavagem, submergir completamente a inserção 3 vezes em 150 DPBS ml e agitar para remover o restante do material de teste. </li><li> Finalmente, lave a inserção do tecido uma vez a partir do interior e uma vez do lado de fora com DPBS estéril. </li><li> Remova qualquer excesso de DPBS a partir do tecido agitando a inserir e blotting-lo no papel estéril blotting. </li><li> Transferir as inserções de tecidos riscados para o novo prato 6-bem anteriormente pré-cheia com o meio de ensaio. Todas essas etapas (14-18) deve ser feito dentro de 1 min para cada inserção. </li><li> Após a última tecido é enxaguado, seco cuidadosamente a superfície de cada tecido com algodão estéril ponta cotonete. </li><li> Incubar os tecidos na incubadora para o próximo 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). Nota: Cada técnico do ensaio não deve testar mais de 6 substâncias, incluindo os controles positivos e negativos em uma corrida de teste único (set), para poder seguir o protocolo, conforme descrito abaixo </li></ol> III. Meio de troca - Dia 2 <ol><li> Após a 24 ± 2 horas pós-incubação, transferir o insere na parte inferior da placa de 6 poços, pré-cheia com 0,9 ml de mídia. Meios de comunicação de linhas superior pode ser recolhida para análise dos pontos finais adicionais (citocinas, quimiocinas, etc.) Análise dos desfechos secundários é opcional. </li><li> Continuar com a pós-incubação (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por mais 18 ± 3 horas. </li></ol> IV. MTT Assay Viabilidade - Dia 3 <ol><li> Etiqueta de duas placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos. Uma placa servirá para a incubação do tecido com MTT e outro para a etapa de extração. </li><li> Preparar a solução de MTT por descongelamento concentrado MTT (5 mg / ml) e diluir com o diluente MTT. Concentração final da solução de MTT é de 1 mg / ml. </li><li> Pipetar 300 mL da solução de MTT em cada poço da placa de 24 poços. </li><li> Retirar as placas de 6 poços de incubadora, blot o fundo das inserções em um mata-borrão, e transferi-los para a placa de 24 poços de pré-preenchido com MTT. </li><li> Coloque a placa de 24 poços na incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% RH) e incubar por 3 horas ± 5 min. Estritamente as 3 horas o tempo de incubação ± 5 min para evitar o desvio entre as leituras MTT diferentes. </li><li> Quando a incubação MTT está completa, use uma bomba de sucção para aspirar cuidadosamente o meio MTT de todos os poços. </li><li> Recarga dos poços com DPBS e aspirar novamente. Repita esta lavagem mais duas vezes e certifique-se que os tecidos estão secos após a aspiração passado. </li><li> Após a transferência lava as pastilhas a uma placa de 24 poços novos. Mergulhe as pastilhas com cuidado pipetando 2 mL de solução extrator (Isopropanol) em cada inserção. O nível vai subir acima das bordas superiores da inserção, assim, completamente submergindo os tecidos. </li><li> Selar a placa de 24 poços (por exemplo, com Parafilm ou usando saco de vedação) para inibir a evaporação extrator. Extraia o MTT dos tecidos, pelo menos, duas horas à temperatura ambiente com agitação suave em um shaker placa (~ rpm 120). Extração sem agitação durante a noite também pode ser usado. </li><li> Após o período de extração é completa, furar as inserções com uma agulha de injeção ou o bulbo de contas pipeta Pasteur e permitir que o extrato a correr para o bem de que a inserção foi tirada. </li><li> Descartar a inserir perfurado e pipetar a solução no poço de cima para baixo três vezes até que esteja homogêneo. </li><li> Para cada tecido, de transferência de duas alíquotas 200 mL da solução de formazan púrpura em uma placa de 96 poços de fundo plano de microtitulação. Transferir as duplicatas de acordo com o projeto placa fixa dada na planilha que acompanha este protocolo de vídeo. Para espaços em branco, use isopropanol. </li><li> Ler a densidade óptica (DO) dos extratos em espectrofotômetro MTT placa de 96 poços usando um comprimento de onda de 570 nm (540-580), sem um filtro de referência. </li><li> Inserir os resultados na planilha para cálculo automático dos resultados (Figura 1). </li><li> A substância em estudo é rotulado «irritante» (R38 ou GHS categoria 2) se a viabilidade dos tecidos por cento determinado pelo ensaio de MTT é &lt;50% em relação ao controle negativo. Nota: MTT é tóxico, portanto não se esqueça de usar luvas ao manusear. MTT e proteger a sua tãoluções da luz, já que MTT é sensível à luz. Use solução de MTT dentro de algumas horas após o preparo porque degrada com o tempo. </li></ol> V. Qualidade Assay Controles <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT Critérios de aceitação kit: Modelos in vitro RHE deve fornecer dados consistentes e de alta qualidade ao longo do tempo, não apenas durante o processo de validação (8). Diretrizes recomendadas para garantir a longo prazo reprodutibilidade do ensaio e do desempenho incluem &quot;a caracterização completa de células ou tecidos, amostras de cada lote ... para o desempenho, e uso regular de controles e produtos químicos de referência para fornecer uma garantia de consistência de desempenho do ensaio&quot; (9) . Além de critérios de aceitação do ensaio descrito a seguir, cada lote de produção de EpiDerm é o controle de qualidade testada pelo fabricante contra um produto químico de referência adicional (1% Triton X-100). O tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade do tecido a 50% (ET-50) de Triton X-100 é determinado. Para EpiDerm, média anual ET-50 valores têm variado de 5,9 horas para 7,5 horas. O lote a lote para tecidos CV controle negativo (ou seja, a variabilidade da viabilidade de base) foi em média menos de 7,5% por cada ano desde 1996. O valor de ET50 cada lote de produção deve cair dentro de 2 desvios padrão da média histórica Triton X-100 ET50 criada em 1996 (ou seja, ET-50 = 6,7 horas; Limite mínimo de aceitação = 4.8h; limite de aceitação superior = 8.7h), a fim para ser liberado para uso pelo fabricante. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 1: Controle Negativo: O OD absoluta do controlo negativo (NC) tecidos (tratados com DPBS estéril) na MTT-teste é um indicador da viabilidade dos tecidos obtidos no laboratório de testes após o envio e armazenamento de procedimentos e sob condições específicas de utilização. O ensaio atende ao critério de aceitação se o OD significa 570 dos tecidos NC é ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 2: Controle Positivo A solução a 5% SDS (em H 2 O) é usado como controle positivo (PC) e testado em simultâneo com os produtos químicos de teste. Significa simultâneos que o PC tem que ser testada em cada ensaio, mas não mais do que um PC é necessário por testes dia. Viabilidade do controlo positivo deve ser dentro do intervalo de confiança de 95% dos dados históricos. O ensaio satisfaz o critério da aceitação se a viabilidade média de tecidos PC expressos como% dos tecidos controle negativo é de 20%. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 3: Desvio Padrão (SD) A irritação cutânea é previsto a partir da viabilidade média determinada em 3 tecidos único e, portanto, a variabilidade de tecido réplicas deve ser aceitavelmente baixo. O ensaio atende ao critério de aceitação se o SD calculado a partir de viabilidades% cada tecido do 3 identicamente tratados replica é &lt;18%. </li></ul> Resultados representante <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3" /> </div> Figura 1 Resultados obtidos para seis artigos de teste, NC e controle PC -. Parte da planilha para o cálculo automático dos resultados. Produtos químicos teste que reduziu a viabilidade do tecido abaixo de 50% referenciados NC são classificados como irritantes. O teste foi otimizado para fornecer resultados que são suficientemente longe da classificação de corte (50% de viabilidade), aumentando assim a robustez do ensaio. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiais </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Lista de Materiais" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

Neste vídeo, temos demonstrado a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para testes in vitro irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. Ao executar este método, é importante trabalhar em condições assépticas e seguir estritamente o protocolo validado, uma vez que desvio do protocolo podem causar resultados diferentes. Algumas modificações do ensaio são possíveis, no entanto, alterações ao protocolo deve ser discutido diretamente com os autores. A única limitação deste método é uma possível interferência da substância de ensaio com a extremidade MTT. Uma substância de cor ou uma que reduz diretamente MTT (e, assim, imita atividade desidrogenase da mitocôndria celular) pode interferir com o endpoint MTT. No entanto, essas substância são um problema somente se no momento do teste MTT (ou seja, 42 horas após a exposição à substância de teste) uma quantidade suficiente da substância de ensaio ainda estão presentes no (ou dentro) dos tecidos. No caso deste evento improvável, o (verdadeiro) redução MTT metabólica e da contribuição por um material de teste colorido ou (false) redução MTT direta pelo material de teste pode ser quantificado através de um procedimento descrito em detalhes no Procedimento de Operação Padrão fornecido pelo ensaio Mattek Corp

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

O teste EpiDerm Irritação da pele (EpiDerm SIT) foi desenvolvido<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E validados<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. O SIT EpiDerm utiliza o 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruída epidérmico humano (RHE) EpiDerm modelo. O procedimento descrito neste protocolo permite a discriminação entre os irritantes da categoria GHS 2 e não-irritantes<sup&gt; (6)</sup&gt;. O teste é realizado ao longo de um período de tempo 4 dias, consistindo de pré-incubação, 60 minutos de exposição, 42 horas pós-incubação eo ensaio de viabilidade MTT. Após o recebimento dos tecidos e pré-incubação durante a noite (Dia 0), os tecidos são topicamente expostos aos produtos químicos de teste (dia 1), que pode ser líquido, semi-sólidos, sólidos ou cera. Três tecidos são utilizados para cada substância em estudo, bem como para o controle positivo (5% aq. Solução SDS), e um controle negativo (DPBS). Exposição a produtos químicos tem a duração de 60 minutos, 35 min do que os tecidos são mantidos em uma incubadora a 37 ° C. As substâncias de ensaio são então removidos da superfície do tecido por um procedimento de lavagem extensiva. As inserções de tecidos são apagados e transferidos para meio fresco. Após um período de incubação 24 h (dia 2), o meio é trocado. O meio pode ser guardado para posterior análise de citocinas ou outros parâmetros de interesse. Após a troca de médio, os tecidos são incubados por um período adicional de 18 horas. No final da 42h inteira de pós-incubação (dia 3), os tecidos são transferidos para solução de MTT amarelo e incubadas por 3 horas. A resultante azul-púrpura sal formazan, formada principalmente pelo metabolismo mitocondrial, é extraído por 2 horas usando isopropanol. A densidade óptica do formazan extraído é determinado usando um espectrofotômetro. Um produto químico é classificado como um irritante se a viabilidade dos tecidos em relação ao controle negativo tecidos tratados é reduzida abaixo de 50%. Este procedimento pode ser usado como substituto completo do teste in vivo irritação de pele de coelho para identificação de perigos e rotulagem de produtos químicos, de acordo com os regulamentos da UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Neste vídeo, demonstramos a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica.

Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Vídeo: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

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Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

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Biologia

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...