Name: electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
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The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children&#8217;s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

Este método necessária a utilização de matérias de origem animal, permitidas pelo Comitê de Laval University animal Ética (protocolo nº 2012-170). 1. Configuração e Preparação <ol><li> Soluções <ol><li> Preparar soluções stock aCSF de acordo com as seguintes receitas 7,17. Outras receitas com variações de concentração estão disponíveis na literatura. Soluções de armazenar a 4 ° C durante até um mês. <ol><li> Solução de sal: adicionar 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Dissolver em 800 ml de água destilada, em seguida, enche-se a 1 L com água destilada. </li><li> Solução de bicarbonato de: adicionar 17,65 g de NaHCO3 (21 mM final). Dissolver em 900 ml de água destilada, em seguida, enche-se a 1 L com água destilada. Variações da concentração de bicarbonato irá resultar em variações do pH. </li><li> Solução de glicose: adicionar 54,06g de glucose (30 mM final). Dissolver em 400 ml de água destilada, em seguida, preencher a 500 ml com água destilada. </li></ol></li><li> Prepare aCSF, diluindo 100 ml de solução salina, 100 ml de solução de bicarbonato, e 50 ml de solução de glucose em 1 L de água destilada. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Prepare um eletrodo de vidro por aquecimento e alongamento um tubo de vidro até que quebre. Areia para baixo a ponta antes de usar. O eléctrodo pode ser reutilizado muitas tempo, desde que ele permaneça limpo. </li></ol></li><li> Setup Experimental Nota: Os detalhes de configuração são apresentados na Figura 2. <ol><li> Ligue o amplificador, averager, sistema de aquisição de dados, controlador de temperatura e bomba em movimento. Verifique a amplificação do sinal (ganho = 10.000), a filtração (baixo limiar, 10 Hz; limiar alto, 5 kHz), e a taxa de amostragem da conversão de analógico para digital do sinal bruto (2,5 kHz). </li><li> Encha uma garrafa com aCSF e bolha com carbogênio (95% O 2 </sub&gt;, 5% de CO 2). Induzir uma bubbled- e aqueceu-aCSF fluxo na câmara de gravação (volume de 5 ml) a 4 ml / min. Manter a temperatura na câmara de gravação em 26 (± 1) ° C. O pH deve ser 7,4 nestas condições padrão. </li><li> Mantenha 50 ml de RT e borbulhou-carbogénio aCSF em uma seringa de 50 ml, perto da câmara de dissecção. </li><li> Ligue o computador e iniciar o software de gravação. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção <ol><li> Pesar e visualmente determinar o sexo do animal (machos têm um ano genital distância mais longa, enquanto as fêmeas têm uma distância ano-genital curto; machos genitais são muitas vezes escuro, enquanto órgãos genitais femininos são cor de rosa). </li><li> Anestesiar os roedores recém-nascidos por uma das seguintes opções: Crioanestesia (imergir completamente o animal em gelo durante 4 - 5 min 18), a injecção (equitensine a 4 ml / kg) 19 ou inalação de anestésicos voláteis (isoflurano 20 ou éter 21). Confirm um plano adequado de anestesia pela ausência de um reflexo de retirada da pata. </li><li> Colocar o animal no banco, cara ventral para baixo. Secção da parte da cabeça rostral coronalmente com um bisturi ao nível da bregma (visíveis através da pele e do crânio). Execute esta etapa imediatamente após o animal é anestesiado. </li><li> Seção do corpo coronalmente com um bisturi sob os membros anteriores. </li><li> Retire a pele, músculos, tecidos adiposos e víscera com tesouras cirúrgicas e finas e um alicate. Como os ossos são moles nesta idade, ser cauteloso para não danificar o sistema nervoso. Execute esta etapa no banco. </li><li> Coloque a preparação na câmara de dissecção. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação. A partir deste ponto para o fim da gravação, usar um microscópio. </li><li> Na face dorsal da preparação, cortar o crânio e vértebras do rostral à parte caudal ao longo do eixo médio com tesouras cirúrgicas finas e e um alicate. Abra o crânio cortee vértebras de modo a expor o tecido nervoso. Use a aCSF strored na seringa para oxigenar a preparação. </li><li> Com os alicates, remover a membrana aracnoideia, um tecido fino que cobre a superfície do tecido nervoso. Manter a pia-máter e vasos sanguíneos contra o tecido nervoso. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação. </li><li> Coloque a preparação com o dorsal viradas para baixo, e cuidadosamente derrubar o tronco cerebral ea medula espinhal, cortando os nervos e tecido conjuntivo com a tesoura, segurando a preparação no local. Uma abordagem dorsal também é possível. Manter as raízes dos nervos e o maior tempo possível. Remover os ossos para isolar o tronco cerebral e da medula espinhal. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação. </li><li> Remover o cerebelo e restantes estruturas rostral seccionando-los com o bisturi. Utilizar a aCSF armazenado no interior da agulha para oxigenar a preparação. </li><li> Opcionalmente, dependendo experimenprojeto tal, remova a ponte com o bisturi por uma seção coronal anterior à artéria cerebelar inferior 22. Note-se que manter os pons inteiras vai abrandar o ritmo em ratos e totalmente inibi-la em camundongos. Preparações que incluem apenas a parte caudal da ponte exibir uma atividade respiratória, como com uma frequência estável na raiz C4. </li></ol> 3. A gravação <ol><li> Coloque a preparação na câmara de gravação, ventral face para cima. Corrigir a preparação com os pinos na parte mais baixa da medula espinhal e rostral mais-parte do tronco cerebral. </li><li> Usando uma seringa ligada ao eléctrodo por sua agulha, induzir uma depressão no eléctrodo (diâmetro da ponta de vidro: 150 - 225 uM), puxando o êmbolo da seringa, a fim de preencher parcialmente o eléctrodo com aCSF. </li><li> Utilizando um micromanipulador, colocar cuidadosamente o eléctrodo próximo de uma das quarta raízes ventrais. Outras raízes ventrais também poderia apresentar um respiratório-like atividade (e.g., nervo craniano XII, C1 raiz ventral). </li><li> Induzir uma depressão no reservatório de eléctrodo através da seringa puxando o êmbolo para fora, a fim de aspirar suavemente a radícula nervo. Em seguida, mova cuidadosamente o eléctrodo de aplicá-la contra a medula espinhal. Nota: Idealmente, o tamanho das radículas corresponde ao tamanho da abertura do eléctrodo e, portanto, cria uma vedação entre os compartimentos internos e externos do eléctrodo. Desde amplificadores diferenciais são normalmente utilizados para tais gravações, qualquer abertura entre o interior do eléctrodo e a câmara de registo reduz a qualidade do sinal e faz com que seja difícil de eliminar o ruído de fundo. </li><li> Comece a gravação. </li><li> Grave o ritmo produzido pela preparação sob condições de normóxia (isto é, borbulhada com carbogénio aCSF: 95% de O2 e 5% de CO 2) durante pelo menos 20 minutos para determinar os parâmetros de linha de base de preparação. </li><li> Alterne a perfusão de borbulhou-carbogénio aCSF paraaCSF estímulo (isto é, feito borbulhar com 95% de N2 e 5% de CO 2 por estímulo hipoxia) durante 15 min. Alterar a duração da exposição, dependendo do protocolo experimental. Grave a duração da exposição sobre a gravação e animal folha de dados. Utilize tubos de aço inoxidável entre a garrafa e a câmara de aCSF sempre que possível para evitar a difusão de gás para o exterior do tubo. </li><li> Alterne a perfusão de volta para aCSF borbulhou-carbogénio padrão para, pelo menos, 15 min para uma gravação de recuperação. Grave este na gravação e animal folha de dados. </li><li> Fim da gravação. </li></ol> 4. Análise estatística <ol><li> A partir do sinal integrado, calcular a frequência como o número de rajadas por minuto (expressa em rajadas / min), a amplitude como a diferença entre a linha de base e o pico do sinal de sincronismo (expressa em mV), a duração do sincronismo como a duração de o início até ao fim do sinal de sincronismo (expresso em segundos), a área de explosão como a área sob a curve da explosão sobre o sinal integrado (expressa em mV · s) (Figura 3). </li><li> Calcular a frequência, amplitude, duração e área de estourar estourar sob normóxica (baseline), hipóxia (estímulo) e pós-condições de hipóxia (pós-estímulo) de recuperação como a média da última 5 min das gravações para cada condição. Não analisam a primeira porção de cada condição, porque existe um atraso entre a ligação da perfusão e aCSF homogeneização na câmara de gravação. </li><li> Expresse então estímulo (ou seja, a hipóxia) e pós-estímulo (ou seja, pós-hipóxia) valores de recuperação como uma percentagem dos valores de referência para a gravação correspondente. Exprimir os resultados em média ± SD </li></ol>

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The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

Quantificação exata da atividade respiratória pode ser um desafio. Na verdade, a respiração é uma função que pode ser tanto automática e voluntária, e que é modulada de acordo com o ambiente, as necessidades do corpo, o estado emocional eo comportamento. A vantagem desta técnica é o isolamento de elementos neurais responsáveis ​​por produzir o comando respiratória. Assim, as gravações electrofisiológicas de preparações da medula espinal e do tronco cerebral-pletismografia são técnicas complementares para estudar toda a rede neuronal respiratórias in vitro e in vivo, respectivamente. Gravações de patch-clamp na preparação cabo de encéfalo-espinais (por ex., Que se aproximam da superfície ventral) também são concebíveis e permitir o estudo de um neurónio particular numa rede respiratória preservada 24. Este protocolo inclui algumas etapas críticas, principalmente na dissecção. A fim de evitar danos no tecido nervoso,todas as etapas de dissecção deve ser executado com rapidez e precisão. O tecido nervoso não deve ser danificado e ser cuidadosamente conservada por imersão constante em aCSF. Como mencionado anteriormente, a qualidade da conexão entre o radículas do nervo e o eléctrodo é um segundo passo crítico. A aspiração da radícula podem trazer o eléctrodo mais perto da preparação. Enquanto o contacto entre o eléctrodo e o tronco cerebral pode melhorar a qualidade da vedação, tem de se evitar que uma depressão ou danificar fisicamente a preparação. O sinal integrado deve sempre ser utilizado para análise, mas sinais brutos pode ser útil para diferenciar rajadas adequadas de ruído de fundo. Além disso, um alto-falante pode ser adicionada à configuração para ouvir o ritmo e determinar a qualidade do sinal e ruído de fundo presente pela audição. De facto, algumas variações na linha de base de fundo podia estar presente devido à interferência eléctrica e causa a uma linha de base instável. Tal interfrências devem ser impedidos, verificando as conexões de cabo e sucção raiz pelo eletrodo. Além disso, porque a amplitude de ruptura é dependente tanto do ruído de fundo e a conexão entre a raiz e o eléctrodo, a frequência é uma grande parte de um parâmetro fiável. Assim, a amplitude explosão deve sempre ser expressas em percentagem dos valores de referência para evitar as variações inter-individuais devido à configuração. As limitações da técnica são determinados pela idade do animal a partir do qual a preparação pode ser realizada. Isso permite que um estudo preciso da criação do comando central da respiração no momento do nascimento, o que é muito interessante e clinicamente relevante, mas centra-se nestas idades precoces e não pode ser estendido para as idades posteriores. Idades mais velhas pode ser utilizado em preparações de trabalho arterialmente perfundidos coração-tronco cerebral 25, mas com modificações substanciais de protocolo (ver abaixo). Um tronco encefálico-espinal preparação isolada cabo de cobaias adultas tem sido desenvolvered por Morin-Surun et al. 26, em que o tronco cerebral é perfundido através da artéria basilar eo ritmo é gravado no nervo craniano XII. Outra limitação é a duração da experiência. A preparação não pode ser mantido por mais de 7 horas nas condições descritas anteriormente 6. Portanto, esta técnica não é apropriada para as experiências de longo prazo, mesmo se as preparações de girinos (ver abaixo) foram mantidas 24 horas em laboratório. Várias modificações podem ser aplicados a esta técnica. Aqui, provocação hipóxica foi realizado, mas também outras variações de gás são concebíveis (por ex., Hipercapnia 27, bem como variações de pH 28). Da mesma forma, a preparação pode ser perfundido com aCSF em que as drogas foram dissolvidas e aplicada sobre o tronco cerebral como um pré-tratamento de 29 ou 30 durante a gravação. Neste caso, o ritmo pode ser acelerado ou retardado 29 Down 30 de acordo com a droga experimental. Além disso, com uma câmara de registo compartimentado, diferente aCSF pode ser aplicado em partes selectivos das preparações 6 e 9, as variações de temperatura podem ser empregues. Esta compartimentação permite o estudo da implicação de partes seleccionadas do tronco cerebral nos efeitos induzidos por estímulos. Embora a técnica apresentada utiliza ratos recém-nascidos, é também aplicável em outros modelos animais. Utilizando um protocolo semelhante ao utilizado para os ratos, os murganhos podem ser usados ​​a partir do dia 16 de gestação (E16) até P4 12. A principal diferença é a necessidade de aquecer e carbogénio-bubble a aCSF durante a dissecção. Turtles, girinos e rãs adultas também pode ser usado; no entanto, estas espécies exigem técnicas de dissecação diferentes, bem como ajustes na composição da aCSF. Esta técnica também pode ser acoplado com gravações de patch-clamp na face rostral da preparação 31, permitindovisualização simultânea do sinal de saída da rede e a actividade de uma célula em particular da rede. Voltagem corante sensível de imagem pode também ser aplicada em ratos recém-nascidos preparações medula encéfalo-espinais de localizar as áreas activadas na face ventral do tronco cerebral 32. análise de c-fos nos preparações também podem ser realizados a fim de identificar as populações neurais envolvidos em respostas respiratórias específicas. Finalmente, a preparação pode ser modificada para manter outros órgãos tais como o coração 25, nervuras 6, ou a perfusão da artéria fisiológico com outros ritmos fisiológicos 33. No entanto, essas modificações muito importantes exigiria outros protocolos de dissecação.

A respiração é uma actividade fundamental complexo e controlado pelo cérebro, permitindo dioxigénio (O2) e a absorção de dióxido de carbono (CO 2) eliminação. O comando central da respiração é gerado por uma complexa rede localizado no tronco cerebral em ambos os mamíferos 1, 2 anfíbios, répteis, pássaros 3 4 5 e peixes. Mesmo se o estudo de respiração pode ser processada in vivo, investigações mecanicistas precisos requerem acesso directo à rede de controlo respiratório. Para este fim, Adrian e Buytendijk desenvolveu uma preparação peixinho reduzida, no qual os eletrodos posicionados na superfície do tronco cerebral registro do ritmo gerado associada a ventilação branquial 5. Esta abordagem foi subsequentemente adaptado por Suzue em 1984 6 para utilização em roedores recém-nascidos. O advento desta preparação tem levado a avanços significativos na neurobiologia respiratória. Uma vez que é relativamente simples, a técnica apresentada here é passível de uma ampla gama de investigações básicas de comportamentos motores rítmicas e as suas origens em roedores recém-nascidos. O objetivo geral deste método consiste em gravar o correlato neural da atividade inspiratória, um ritmo respiratório, chamado respiração fictício, produzido pela rede respiratória. Este método pode ser utilizado em uma ampla gama de objetivos de pesquisa, visando respostas inspiratória a variações respiratórias ou farmacologia em ambos os selvagens tipo 7 e 8 animais transgênicos. Dado que as experiências são realizadas a uma temperatura baixa, sem aferentes sensoriais, e sob condições nas quais as concentrações de glicose e O 2 no interior da aCSF são elevados, foram levantadas questões sobre a relevância fisiológica do sinal gravado. Embora existam diferenças claras entre in vivo e in vitro condições (por exemplo., A freqüência de rajadas inspiratória) permanece o fato de que a presença deos principais elementos da rede respiratória 6 torná-lo possível estudar um ritmo robusto associado a uma função homeostática vital 9,10. A lógica por trás do desenvolvimento e da utilização dessa técnica é facilitar o acesso direto aos elementos do tronco cerebral da rede respiratória, que são de difícil acesso in vivo, especialmente em recém-nascidos. O tronco cerebral é colocado sob condições estritamente controladas: o ritmo gravada não é modulada por entradas aferentes periféricas dos pulmões ou dos órgãos carótidas, permitindo o estudo para se concentrar no comando central da respiração em si 11. Assim, este acesso é utilizada para aplicar estímulos e gravar o sinal de saída. Em contraste com pletismografia gravações, o ritmo respiratório é modulada por todos os seus componentes ao longo do corpo (por ex., A distensão do pulmão, sensores químicos periféricas), tornando-o difícil de aplicar estímulos precisos. Numarato ewborn, o protocolo consiste em gravar o quarto sinal ventral raiz em um tronco cerebral isolado e uma medula espinhal truncado, mantida no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF). O ritmo gerada pelos preparativos da medula do tronco cerebral-espinhal é composta de explosões lentas individuais que estão ligadas ao sinal inspiratória 9. Isolado preparações da medula do tronco cerebral-espinhal são facilmente graváveis ​​em ratos de pós-natal dia 0-4 (P0 - P4) 7. Esta abordagem é vulgarmente usado para avaliar a resposta hipóxica da rede respiratória, e também a resposta a hipercapnia, acidose ou drogas. Um protocolo de hipóxia aguda é apresentado aqui. Esta estimulação é obtido por retirada de O 2 no aCSF; esta abordagem é utilizada para avaliar a tolerância e a capacidade de resposta a insultos hipóxicos. O protocolo induz uma depressão do ritmo a partir do primeiro minuto até ao final da exposição a hipoxia (Figura 1) 12. Esta depressão é invertidadurante a pós-hipóxica 12 recuperação. No que respeita ao delineamento experimental, é importante notar que a ponte, localizada na parte rostral do tronco cerebral, tem uma ação inibitória sobre o gerador de ritmo 8. Assim, as preparações de tronco cerebral e da medula espinal integral rostral exibir um ritmo inferior. Inclusão da ponte na amostra isolada para a gravação é determinado de acordo com o objetivo do experimento 13; o estudo da influência pontina na rede medula oblongata exigiria gravações com e sem a ponte para comparar os resultados 14. Além disso, uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de estender a porção rostral do preparado para incluir mesencefálico e / ou regiões diencefálica 15,16, tornando-se possível avaliar o efeito destas regiões na rede ponto-medular respiratória.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Use under hood</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Suction electrode</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 573000</td><td></td></tr><tr><td>Differential AC amplifier</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Moving averager</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>model MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>model DI-720</td><td></td></tr><tr><td>LabChart software</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism sofware</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection chamber</td><td>Plastic box (e.g. petri box) will do</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Como mencionado na introdução, uma das vantagens mais importantes desta técnica é o acesso directo ao tronco cerebral para aplicar vários estímulos. Como um exemplo, a hipoxia foi aplicado aqui. Figura 1. AB exibe uma gravação protocolo completo, com ambas as condições de normóxia e de hipóxia. A Figura 1.CE exibe o ritmo registada em condições de normóxia (isto é, aCSF borbulhar com 95% de O2 e 5% CO2 a 26 ° C). Como anteriormente demonstrado nesta preparação exacta 11, a frequência é de cerca de 8 rajadas / min, e a amplitude é de cerca de 0,800 mV. Observe que a amplitude é apenas indicativa por causa de seus importantes variações inter-preparação. O traço superior representa o sinal integrado enquanto que o traço inferior representa o sinal bruto. A Figura 1.DF exibe o ritmo registada em condições de hipóxia (isto é., ACSF borbulhar com 95% de N2 e 5% de CO &lt;sub&gt; 2 a 26 ° C). Como previamente caracterizado 23, a frequência diminuiu drasticamente durante a hipóxia. Figura 1.GH exibe uma única sequência que mostra padrões típicos em situações de normóxia e hipóxia. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplos de registros obtidos desde Preparações Cord Brainstem-espinhal. Saída respiratório gravado a partir da raiz ventral C4 de preparações de ratos P4 sob normóxica, hipóxico e condições de recuperação pós-hipóxia ((a) de sinal integrado e (B) sinal bruto) . Para cada condição, gravações alargada ((C) integrado sinal normóxica; (D) sinal hipóxico integrada; (E) sinal normóxica bruto; (F) sinal hipóxico-primas) e estouro único ((G) estouro normóxicae (H) de ruptura hipóxico) são mostrados. Como mencionado no texto, por favor, note que amplitude tem de ser interpretada com cuidado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53071/53071fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig2.jpg" /> Figura 2. Recapitulativa esquema do programa de configuração. O aCSF borbulhar é aquecido e enviado por uma bomba na câmara de gravação. aCSF excesso na câmara de gravação é aspirada por uma bomba e eliminados. A câmara de registo está ligado à terra e o controlador de temperatura. A saída do eléctrodo é directamente transmitido para o amplificador, em seguida, ao calculador de média movendo-se e o sistema de aquisição de dados, e, finalmente, o computador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53071/53071fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui t</a>o visualizar uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig3.jpg" /> Figura 3. Analisada parâmetros de rajada. A frequência é calculada como o número de rajadas por minuto (expressa em rajadas / min), a amplitude como a diferença entre a linha de base e o pico do sinal de sincronismo (expressa em mV), como a duração do sincronismo a duração desde o início até ao fim do sinal de sincronismo (expresso em segundos), a área de explosão como a área sob a curva da @ burst @ de sinal integrado (expressa em mV · s). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53071/53071fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da presente figura.</a>

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Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Eletrofisiologia no isolado do tronco encefálico-espinal Preparações do cordão umbilical de recém-nascidos Roedores permite a gravação de saída Neural Rede Respiratory

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K visualizações.  Laval University. The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

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Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Neurociência

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologia

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

Aquisição e análise de dados na audiometria de resposta evocada de tronco encefálico em camundongos

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological characteristics in the intact spinal network and holds significant advantages relative to classical in vitro or extracellular recording techniques. An advantage of in vivo intracellular recordings is that this method can be performed on adult animals with a fully mature nervous system, and therefore many observed physiological mechanisms can be translated to practical applications. In this methodological paper, we describe this procedure combined with externally applied constant current stimulation, which mimics polarization processes occurring within spinal neuronal networks. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) is an innovative method increasingly used as a neuromodulatory intervention in rehabilitation after various neurological injuries as well as in sports. The influence of tsDCS on the nervous system remains poorly understood and the physiological mechanisms behind its actions are largely unknown. The application of the tsDCS simultaneously with intracellular recordings enables us to directly observe changes of motoneuron membrane properties and characteristics of rhythmic firing in response to the polarization of the spinal neuronal network, which is crucial for the understanding of tsDCS actions. Moreover, when the presented protocol includes the identification of the motoneuron with respect to an innervated muscle and its function (flexor versus extensor) as well as the physiological type (fast versus slow) it provides an opportunity to selectively investigate the influence of tsDCS on identified components of spinal circuitry, which seem to be differently affected by polarization. The presented procedure focuses on surgical preparation for intracellular recordings and stimulation with an emphasis on the steps which are necessary to achieve preparation stability and reproducibility of results. The details of the methodology of the anodal or cathodal tsDCS application are discussed while paying attention to practical and safety issues.

This protocol describes in vivo intracellular recording of rat lumbar motoneurons with simultaneous trans-spinal direct current stimulation. The method enables us to measure membrane properties and to record rhythmic firing of motoneurons before, during and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Gravações de multieletrodos de silício angulares para estruturas profundas do tronco encefálico em camundongos

Acute Single-Unit Multi-Electrode Recordings from the Brainstem of Head-Fixed Mice

Silicon multielectrode-based recordings are increasingly popular for studying neuronal activity at the temporal resolution of action potentials in many brain regions. However, recording neuronal activity from deep caudal structures like the brainstem using multi-channel probes remains challenging. A significant concern is finding a trajectory for probe insertion that avoids large blood vessels, such as the superior sagittal venous sinus and the transverse venous sinus. Injuring these large veins can cause extensive bleeding, damage to the underlying brain tissue, and potentially death. This approach describes targeting brainstem structures by coupling anterior coordinates with an angled approach, allowing the recording probe to penetrate the brain below high-risk vascular structures. Compared to a strictly vertical approach, the angled approach maximizes the number of brain regions that can be targeted. Using this strategy, the ventrolateral periaqueductal gray (vlPAG), a brainstem region associated with REM sleep, can be reproducibly and reliably accessed to obtain single-unit, multi-electrode recordings in head-fixed mice before and during sevoflurane anesthesia. The ability to record neuronal activity in the vlPAG and surrounding nuclei with high temporal resolution is a step forward in advancing the understanding of the relationship between REM sleep and anesthesia.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Investigando as vias do sono induzidas por anestesia e a excitabilidade neuronal em camundongos

This protocol describes a method to obtain in vivo, high-density single-neuron recordings from the brainstem of head-fixed mice. This approach is deployed to measure the action potential firing of neurons in the ventrolateral periaqueductal gray - a brainstem region inactive during Rapid Eye Movement (REM) sleep - before and during general anesthesia.

Gravações agudas de vários eletrodos de unidade única do tronco encefálico de camundongos com cabeça fixa

Silicon multielectrode-based recordings are increasingly popular for studying neuronal activity at the temporal resolution of action potentials in many ...

Eletrofisiologia no isolado do tronco encefálico-espinal Preparações do cordão umbilical de recém-nascidos Roedores permite a gravação de saída Neural Rede Respiratory

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