This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

1. Ajuste do Triaxial Bobinas NOTA: A Figura 1 mostra as bobinas triaxiais utilizados para inverter a GMF. <ol><li> Ligue o magnetômetro de três eixos, cuja sonda é inserida nas bobinas triaxiais. </li><li> Ligue o computador e iniciar o software magnetómetro que permite que dados sejam coletados de magnetômetro de três eixos. </li><li> Use os valores dos componentes relatados pela magnetómetro para calcular a magnitude da GMF. Por exemplo, com os valores magnetômetro: Bx = 6.39 microTesla, por = 36,08 microTesla, Bz = 20,40 microTesla calcular uma força de campo de 41,94 microTesla usando a seguinte equação: B = B GMF + B adicional, onde B adicional = (Bx 2 + por 2 + Bz 2) e meio (isto é, 41,9 mT no exemplo). </li><li> Ligue as três fontes de alimentação DC (dual range: 0-8V / 5A e 0-20V / 2.5A, 50W) cada um ligado a três couplES de bobinas de Helmholtz e ligado a um computador através de uma ligação GPIB (Figura 1B). </li><li> Conjunto de tensões das fontes de alimentação para gerar o campo magnético desejado com um vector de campo magnético invertida. Por exemplo, com B GMF como no passo 1.3 e com o tamanho da bobina da instrumentação descrita aqui, definir as voltagens para V x = 0,00 V, V Y = 30,52 V, V z = 0,00 V, a fim de gerar um novo resultante B = B + B GMF bobinas triaxiais = (6,38, -36,08, 20,39) microTesla. ie, um novo campo com a mesma magnitude B GMF, mas apontando para uma direção diferente. </li><li> Verificar o novo campo com o software magnetómetro usando o procedimento descrito em 1.3. </li><li> Expor plantas a normal e revertida condições GMF usando placas de Petri como descrito na seção 2. </li><li> Realizar experiências de exposição sham, mantendo a magnitude do campo igual a | B GMF | e manutençãoo componente vertical do campo igual ao da GMF, mas alterando a direcção (ou seja, &quot;do Norte, Este ou Oeste&quot;) da componente horizontal do campo com correntes iguais nas bobinas triaxiais, em comparação com a condição de inversão de campo. Para fazer isso, alterando a tensão dos rolos conforme descrito em 1.5. Nota: Esta exposição sham exclui potencial de aquecimento sutil ou efeitos vibracionais de ambos os rolos próprios ou dos equipamentos eletrônicos usados ​​para controlar as bobinas. </li><li> Executar experimentos duplo-cegos, aplicando condições de campo cego desde o pessoal que executa o restante dos experimentos e / ou interpretação dos dados. </li></ol> 2. Preparação de plantas Materiais e condições para o crescimento de plantas <ol><li> Use sementes de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (Col 0), em seguida, colocar num tubo de 1,5 ml e esterilizar por tratamento da superfície com um 5% (w / v) de solução de hipoclorito de cálcio e 0,02% (v / v) de Triton X-100 em 80% de etanol (EtOH), para 10-12 min a 25-28 ° C, com agitação contínua. Em seguida, lavar duas vezes com 80% de EtOH, lavar com EtOH a 100% e, finalmente, enxaguar com água destilada estéril. </li><li> Prepare 1 L de Murashige e Skoog 22 (MS) modificado por adição de meio: 2,297 g de MS (0,5 x MS basal Mistura de sal), 10 g de sacarose, água desionizada até 1 litro, pH 5,8-6,0 ajustado com KOH. Adicionar 16 g de ágar e autoclave durante 20 min, 120 ° C. </li><li> Antes da solidificação, verter 80 mL de meio em cada um (120 x 120 mm 2) placas de Petri quadradas. Semeie trinta sementes estéreis na placa, em seguida, selar as placas com um filme ceroso. </li><li> Vernalize horizontalmente as placas no escuro a 4 ° C durante 2 dias para potenciar e sincronizar a germinação, e, em seguida, expor placas de Petri para normal ou invertida GMF. </li><li> Expor sementes num ambiente de clima controlado a 22 ° C numa posição vertical em experiências paralelas tanto no interior das bobinas triaxiais e fora das bobinas triaxiaissob uma programação fotoperíodo de 8 h escuridão e 16 horas de luz, utilizando lâmpadas de vapor de sódio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Use um filme de gelatina azul para holofotes para reduzir o componente vermelho de lâmpadas. </li><li> Expor as plantas por 10 dias antes da extração de RNA para ambos normal (controle) e inversão (tratamento) as condições GMF. </li><li> Após a exposição, tirar fotos de placas de Petri. </li><li> Use o software ImageJ para calcular áreas comprimento da raiz e da folha. <ol><li> Resumidamente, medir o lado da placa de Petri, em seguida, abra a imagem da placa de Petri e usando a opção de linha &quot;reta&quot; para desenhar uma linha que atravessa exatamente o lado da placa. </li><li> No menu &quot;analisar&quot;, selecione &quot;escala set&quot; e insira a distância real na caixa &quot;distância conhecida&quot; (por exemplo, 120 mm), em seguida, insira a unidade de comprimento (mm); finalmente, clique na opção &quot;global&quot; para fazer as configurações disponíveis para todas as medições. </li><li> Para roocomprimento t, siga atentamente a forma da raiz, usando a ferramenta à mão livre. Meça o comprimento usando a opção &quot;medida&quot; no menu &quot;analisar&quot;. Continue a medir todas as raízes na imagem e salve o arquivo para mais análises estatísticas. </li><li> Para a área foliar, a partir do menu &quot;Imagem&quot; usar a opção e, em seguida, &quot;limite de cor&quot; ajustar. Selecione a folha individual e no menu &quot;analisar&quot;, selecione &quot;analisar partículas&quot;. Salve as medições individuais para análises estatísticas. </li></ol></li></ol> 3. Extracção de RNA total de Arabidopsis, Quantitative PCR em Tempo Real (qPCR) As condições de reacção e os iniciadores para Arabidopsis <ol><li> Recolha separadamente 30 brotos e raízes 30 e congelar imediatamente em nitrogênio líquido. Então moer em nitrogênio líquido com almofariz e pilão. </li><li> Isolar o ARN total utilizando um kit de purificação e kit de tratamento de DNase isenta de RNase usando FABRICAÇÃOinstruções de pronto-socorro. </li><li> Verificação da qualidade e quantidade da amostra, utilizando um kit de ARN a electroforese capilar em gel nano e de acordo com as instruções do fabricante. Confirme a quantificação do RNA por espectrofotometria. </li><li> Use 2 ug de ARN total e iniciadores aleatórios, utilizando um kit de transcrição reversa para ADNc obter ADNc de primeira cadeia de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Executar todas as experiências em um Real-Time System usando SYBR I verde com ROX como um padrão de carga interno. </li><li> Realizar a reacção com 25 ul de mistura que consiste em 12,5 ul de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 ul de ADNc e os iniciadores 100 nm. Use os iniciadores listados na Tabela 1. Inclua na controlos controlos não-RT usando RNA total (sem transcrição reversa para monitorizar a contaminação de ADN genómico) e controlos sem molde (molde em vez de água). </li><li> Calcular iniciador eficiência para todos os pares de iniciadores que utilizam a normamétodo da curva 23. </li><li> Use as seguintes condições de PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 seg a 58 ° C, e 30 seg a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 20 seg a 57 ° C, e 30 seg a 72 ° C. </li><li> Leia fluorescência após cada fase de hibridação e extensão. Para todas as corridas, executar uma análise de curva de fusão a partir de 55 até 95 ° C, incluindo o segmento de dissociação no perfil térmico. Use a tela curva de dissociação, acessado através da aba resultados para exibir o perfil de dissociação (enredo da fluorescência em função da temperatura). Certifique-se que o conjunto de dados recolhidos durante o segmento de dissociação do experimento é selecionado para análise utilizando o ecrã Análise / Setup. </li><li> Determinar a linear gama de concentração modelo de ciclo de valor limiar (valor Ct) através da realização de uma série de diluições de dez vezes (de 1 a 10 3 fold) utilizando cDNA de três extrações de RNA independentes analisadas em três repetições técnicas 24,25. </li><li> Analisar todas as parcelas de amplificação com o Real-Time PCR software instrumento para se obter valores Ct. Calibrar e normalizar os níveis de ARN em relação com o nível dos melhores genes de manutenção da seguinte forma: 3.11.1) Acesse a tela Amplification Plots através da guia Resultados, selecione a rampa ou planalto para o qual os dados devem ser analisados ​​por meio de tela / Configuração da Análise Seleção, e, em seguida, selecione o dRn (com correção de linha de base de fluorescência normalizada) a partir do menu de fluorescência no painel de comando. Acesse a placa da tela Valores de exemplo através da guia Resultados para exibir valores Ct para os poços amostrados. </li><li> Use quatro genes de referência diferentes [por exemplo, citoplasmática gliceraldeído-3-fosfato, (GAPC2), especi ubiquitinaIC protease 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) e o factor de elongação 1B subunidade alfa-2 (eEF1Balpha2)] para normalizar os resultados da PCR em tempo real. Selecione o topo do ranking gene usando um software de análise de 26; e utilizar o gene mais estável para normalização. <ol><li> Resumidamente, organizar os dados de entrada em uma folha de Excel com a primeira coluna que contém os nomes de genes e primeira linha contendo os nomes de amostra. Em seguida, selecione o software de análise a partir do menu-bar. Use a caixa de diálogo para selecionar os dados introduzidos. </li><li> Em seguida, verifique os campos de nomes de exemplo, nomes de genes e saída simples apenas. Clique no botão Ir para realizar a análise. Escolha do topo gene classificados (que tem o valor menor estabilidade) como gene candidato mais estavelmente expressas. </li></ol></li><li> Os dados do gráfico, mostrando a expressão mudança vezes diferencial em ambos os brotos e raízes. </li></ol> 4. Análise estatística <ol><li> Expresse dados como valores médios ± erro padrão. Compare o control e os grupos de tratamento através da realização de análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey com Bonferroni e Dunn-Sidak teste Probabilidade Ajustado (0,95% de confiança). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nós recentemente mostrou que existe uma correlação surpreendente entre reversões GMF eo momento em que o desvio da maior parte das linhagens familiares Angiospermas ocorreu 2. No entanto, apesar das hipóteses estimulante e a pletora de estudos sobre o efeito de intensidades variadas GMF, a hipótese de que a inversão GMF pode-se induzir mudanças significativas na expressão de genes de plantas e morfologia nunca foi demonstrada. Aqui mostramos pela primeira vez, um método que utiliza uma bobina de Helmholtz octogonal triaxial para inverter GMF no nosso laboratório, e que a reversão do campo magnético ambiente pode causar mudanças fenotípicas e modulação da expressão génica em plantas. A fim de obter reversão GMF (ou modificação) ao longo de um volume suficiente para as experiências de crescimento de plantas (2 x 2 x 2 m 3), foi construído um sistema de bobinas de Helmholtz octogonal. Este sistema não está disponível comercialmente (bobinas de Helmholtz são geralmente em forma de anel e menor)e os custos de construção foram consideráveis. É importante ressaltar que este sistema oferece robusta modificação campo, com excepcional tempo estabilidade e homogeneidade nos campos magnéticos modificados. O sistema é concebido e construído para reduzir o valor da GMF a um milésimo de as condições normais ou para reverter qualquer das três dimensões do campo magnético. No entanto, o desenho das bobinas não permite gerar uma força de campo magnético de alta. Portanto, este instrumento, na presente forma não é adequado para experiências concebidas para avaliar os efeitos de alta intensidade de campo magnético sobre as plantas ou outros organismos. No laboratório, a alteração da GMF semelhantes aos descritos neste método foi obtido por métodos diferentes, incluindo blindagem por em torno da zona experimental por meio de placas metálicas ferromagnéticas com elevada permeabilidade magnética, que se desviem campos magnéticos e concentrá-las dentro do próprio metal. ºe vantagem do uso de bobinas de Helmholtz é que o sistema permite que as plantas a ser exposto a condições mais naturais (luz, a circulação do ar, etc), tornando-o ideal não só para os estudos in vitro (tal como com a utilização de pratos de Petri) mas também in vivo para o crescimento das plantas e as experiências de desenvolvimento. As dimensões do nosso sistema de criar um espaço que permite uma supressão até &lt;1/1000 da GMF natural, ao longo de um 25 x 25 x 25 cm 3 de volume esférico (ver Figura 1A), permitindo assim a realização de vários placas de Petri ou algum pequeno potes para o crescimento das plantas. O método aqui apresentado foi aplicada ao estudo da biologia das plantas; No entanto, o sistema permite que uma vasta gama de experimentação, incluindo microbiologia e virologia, bem como estudos sobre nematóides (por exemplo, Caenorhabditis elegans), artrópodes e pequenos animais (incluindo ratinhos e ratos). Por conseguinte, os testes de hipótese de que a inversão da GMF é capazpara induzir alterações morfológicas e de transcrição também poderia ser estendida a muitos outros sistemas vivos, em última análise, talvez até mesmo para as células humanas. A GMF está mudando constantemente e flutuante. Portanto, nas nossas experiências é um desafio importante para proporcionar uma compensação constante da GMF, a fim de obter os novos valores GMF desejados. Isso só pode ser alcançado por um controle contínuo de valores de campos magnéticos através da leitura de valores magnetômetro e compensação de tensão. Portanto, o sistema pode compensar a parte de variação lenta do GMF, mas ele não faz nada para flutuações de frequência mais elevada. Em conclusão, a utilização de bobinas triaxial para inverter o vector GMF foi fundamental para demonstrar que esta inversão do vector GMF é capaz de induzir modificações morfológicas das plantas e expressão diferencial de genes. Os resultados obtidos com o método apresentado proporcionar uma evidência convincente em suporte da hipótese de que a re GMFversals poderia ter sido uma das forças motrizes para a evolução das plantas em escalas de tempo geológicas 2.

O campo magnético da Terra (ou equivalente, o campo geomagnético, GMF) é um fator ambiental inescapável para todos os organismos vivos no planeta, incluindo plantas. A GMF sempre foi uma característica natural da Terra, assim que durante a evolução, todos os organismos vivos teve a sua ação. Um crescente corpo de evidências mostra que o GMF é capaz de influenciar muitos processos biológicos 1. A GMF não é uniforme e existem diferenças locais significativas na sua magnitude e direcção à superfície da Terra. A GMF na superfície da Terra mostra uma ampla gama de amplitudes, que vão desde menos de 30 a cerca de 70 mT mT. A GMF protege a Terra e sua biosfera dos efeitos letais do vento solar, desviando a maioria de suas partículas carregadas através da magnetosfera 2. As plantas respondem aos estímulos do ambiente; e as respostas clássicas a fatores abióticos, como luz e gravidade ter sido thoroughly descrito, definindo as ditas respostas fototrópicos e gravitrópico. Muito pouco, ou nada, se sabe sobre os mecanismos de percepção e de respostas de plantas a campos magnéticos, apesar do grande número de trabalhos publicados sobre este tema e recentemente revisados ​​1. Ao contrário do campo gravitacional, a GMF mudou de forma consistente durante a evolução de plantas representando, assim, um importante fator de estresse abiótico que tem sido considerado recentemente um potencial força motriz, eventualmente, contribuir para a diversificação plantar e especiação 2. Inversões geomagnéticas (ou excursões) são alterações na polaridade da GMF. Durante a história da vida da Terra, reversões GMF ocorreu várias vezes. Estes exposto do planeta para períodos de redução da força GMF durante cada transição de polaridade. Alguns autores levantaram a hipótese de que essas transições períodos de baixa resistência GMF poderiam ter permitido radiação ionizante do vento solar para atingir a superfície da Terra, induzindo assim umestresse consistente para os organismos vivos, o que poderia ter sido forte o suficiente para induzir alterações genéticas acabou levando a plantar evolução 2. Uma análise detalhada das experiências que descrevem os efeitos dos campos magnéticos sobre plantas mostra um grande número de relatos conflitantes, caracterizados por uma escassez de mecanismos de interação biofísicos plausíveis. Muitas experiências são simplesmente irrealista, enquanto outros carecem de uma hipótese testável e, em última análise, não são convincentes 3. Nos últimos anos, a evolução eo estado da investigação sobre o efeito de campos magnéticos na planta foi revisto 2,4-11. Recentemente, o efeito de ambos campo magnético de baixa e alta tem sido exaustivamente discutido 1, com um foco particular sobre o envolvimento de eventos de reversão GMF sobre evolução das plantas 2. O meio mais direto para fundamentar a hipótese de que a inversão GMF afetar a evolução das plantas é sintetizar um GMFreversão no laboratório testando a resposta das plantas à condições do campo magnético normais e inversas. Para testar a hipótese, que, por conseguinte, construída uma bobina de Helmholtz octogonal pares de campo magnético do sistema de compensação (triaxial triaxiais bobinas), que é capaz de reverter com precisão as condições GMF normais. Utilizou-se de Arabidopsis thaliana como planta modelo e testou-se o efeito de revertida GMF na expressão do gene de alguns genes importantes: cruciferina 3 (CRU3), que codifica uma proteína de armazenagem 12S semente que é tirosina-fosforilada e o seu estado de fosforilação é modulado em resposta a ABA em sementes de Arabidopsis thaliana 12,13; Transportes protein1 Copper (COTP1), que codifica uma proteína superfamília transporte heavy metal / desintoxicação com a função predominante na aquisição Cu do solo e desenvolvimento do pólen 14; e Redox Responsive Factor1 Transcrição (RRTF1),que codifica um membro do FER (fator de resposta de etileno) da subfamília B-3 do FER / AP2 família fator de transcrição que contém um domínio AP2 que facilitar a co-activação sinérgica da expressão gênica vias e conferem tolerância cruzada para abióticos e bióticos salienta 15. Além disso, também analisadas cinco genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo: Fe superóxido dismutase1, (FSD1), que codifica uma enzima citoplasmática que enzimaticamente e rapidamente converte o anião superóxido (O2 -) e água (H2O) de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) e o oxigénio molecular (O2) 16; Catalase3 (CAT3), que codifica e que a enzima que catalisa a decomposição de H 2 O 2 em água e oxigénio 17,18; Thylakoidal ascorbato peroxidase (TAPX), que codifica para uma peroxidase thylakoid cloroplasmático que elimina H2O2 19; Ascorbato Peroxidase1 (APX1), que codifica uma peroxidase citosólica que elimina H 2 O 2 e representa um dos alvos potenciais de modificações pós-translacionais mediadas por moléculas de derivados NO-20; e NADPH-oxidase explosão respiratória proteína D (RbohD) que codifica uma enzima que gera O2 - e desempenha um papel central na regulação do crescimento, desenvolvimento e respostas de stress em Arabidopsis 21. Nossa metodologia de reversão de campo fornece a primeira evidência de que a reversão GMF pode induzir uma mudança significativa na expressão gênica de morfologia e A. raízes e parte aérea thaliana. Este protocolo proporciona um meio inovador para avaliar o efeito de inversão GMF na morfologia da planta e a expressão de genes e pode ser usado para avaliar o efeito potencial de reversão GMF em outros aspectos do comportamento das plantas, e, assim, conduzir a discussão do role de reversão GMF sobre evolução das plantas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

Uma das observações mais estimulantes em evolução das plantas é uma correlação entre a ocorrência de campo geomagnético (GMF) reversões (ou excursões) eo momento da radiação de Angiospermas. Isto levou à hipótese de que as alterações no GMF polaridade pode desempenhar um papel importante na evolução da planta. Aqui, descrevemos um método para testar esta hipótese, expondo Arabidopsis thaliana para revertida artificialmente condições GMF. Foi utilizado um magnetómetro de três eixos e os dados obtidos foram utilizados para calcular a magnitude da GMF. Três fontes de alimentação DC foram conectados a três pares de bobinas de Helmholtz e foi controlada por um computador para alterar as condições GMF. As plantas cultivadas em placas de Petri foram expostas a ambos normal e invertida condições GMF. Experiências de exposição Sham também foram realizadas. Plantas expostas foram fotografados durante a experiência e as imagens foram analisadas para calcular o comprimento das raízes e área foliar. ARN total foi extraído de Arabidopsis e quantitativaTime-PCR real (qPCR) foram realizadas análises sobre a expressão gênica de cruciferina 3 (CRU3), protein1 transporte de cobre (COTP1), Redox Responsive Transcrição Factor1 (RRTF1), Fe superóxido dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal ascorbato peroxidase (TAPX), um ascorbato cytosolic Peroxidase1 (APX1) e NADPH / respiratória proteína explosão oxidase D (RbohD). Quatro genes de referência diferentes foram analisadas para normalizar os resultados da qPCR. O melhor dos quatro genes foi seleccionado e o gene mais estável para a normalização foi usada. Os nossos dados demonstram, pela primeira vez que a inversão da polaridade GMF utilizando bobinas triaxiais tem efeitos significativos sobre o crescimento da planta e a expressão do gene. Isso apóia a hipótese de que a reversão GMF contribui para induzir mudanças no desenvolvimento das plantas que possam justificar uma maior pressão seletiva, levando à plant evolução.

O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um método para avaliar se a inversão do campo geomagnético (GMF) pode afectar o desenvolvimento da planta e a expressão de genes de Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobinas triaxiais, como mostrado na Figura 1A são usados ​​para reverter a GMF quando conjunto com as tensões de accionamento apropriados (Figura 1B), obtido como descrito no passo 1.5 do protocolo. As dimensões das bobinas são triaxiais ~ 2 x 2 x 2 m 3, o que permitiu que o espaço suficiente com condições GMF invertidas para acolher várias placas de Petri. Os controlos foram cultivadas nas mesmas condições ambientais e em valores GMF normais. Após 10 dias de exposição ao normal e invertida condições GMF, o fenótipo de plantas apresentaram alterações morfológicas evidentes. Como mostrado na Figura 2, as plantas de controlo (isto é, cultivadas em condições normais GMF) mostrou significativamente com comprimentos de raiz (Dunn-Bonferroni Sidak e ajustado Prob &lt;0,001;T de Student = 10,68, df = 31) os valores mais elevados (29,41 mm; EPM = 1,04; N = 32) no que diz respeito às plantas expostas à invertida GMF (17,53 mm; EPM = 0,58; N = 36). Em plantas GMF-invertidas, a morfologia dos rebentos também foi alterada, mostrando um desenvolvimento reduzido de expansão folheto. Plantas expostas a condições normais mostrou uma área foliar média de 4,95 mm2 (SEM 0,025, N = 54), enquanto as plantas expostas a condições GMF invertidas mostraram significativamente (Dunn-Sidak e Bonferroni ajustado Prob = &lt;0,001; t de Student = 31,32, df = 53) inferior da folha valores de área (3,71 milímetros 2; SEM = 0,032; N = 54). Portanto, a exposição de Arabidopsis a condições GMF invertidas induziu uma redução no comprimento de raiz e área foliar. Expansão foliar e crescimento da raiz são dependentes ambos da divisão eo alongamento das células 27. Portanto, o desenvolvimento da planta, produtividade e condicionamento físico geral são dependentes de uma shoot- e sistema radicular arquitetura ideal &lt;sup&gt; 28. O tamanho reduzido comprimento das raízes e folhas das plantas expostos a condições GMF invertidas indicar a presença de um sistema de detecção capaz de não só perceber variações na intensidade de campo magnético, mas também para responder a alterações do campo magnético &quot;sentido&quot; em comparação com a gravidade. A hipótese de que a reversão GMF pode afetar o crescimento da planta encontra provas convincentes em nossos experimentos, que demonstram que as condições de reversão GMF pode afetar significativamente o desenvolvimento da planta. As alterações morfológicas foram também acompanhada por alterações na expressão de genes. Entre os genes de manutenção, o gene mais estável foi o factor de alongamento 1B subunidade alfa-2. O primeiro grupo de genes (CRU3, COTP1, RRTF1) mostrou uma alteração dramática na expressão do gene (Figura 3). Disparar expressão de todas as três genes foi significativamente aumentada (P &lt;0,05) por cerca de 2.5 vezes, em plantas expostas a reservad condições GMF. Raiz de expressão CRU3 foi regulada positivamente nas raízes em plantas expostas a condições GMF normais, mas foi significativamente (P &lt;0,05) regulada negativamente em condições GMF invertidas. O oposto foi encontrado para COTP1 e RRTF1, que foram regulados negativamente em condições normais e regulada positivamente na presença de reversão GMF (Figura 3). Cruciferina (uma globulina 12 S) é a proteína mais abundante no armazenamento das sementes de A. thaliana e outras crucíferas e é sintetizada como um precursor no retículo endoplasmático rugoso. Em seguida, é transportada para os vacúolos de armazenamento 13 proteína. Germinação de plântulas requer a ruptura da cruciferina, que é utilizado como uma primeira fonte de azoto. Down-regulação da cruciferina degradação reduz o desenvolvimento de embriões, ao alterar as estruturas celulares ou componentes celulares de desenvolvimento 29,30. Nossos resultados mostram que a regulação alta de CRU3 correlaciona-se comuma folha inferior de expansão e um comprimento de raiz reduzida, indicando, assim, que este gene é sensível à reversão GMF e que a sua sobreexpressão pode contribuir para a redução do desenvolvimento da planta. Além disso, a reversão GMF induz uma regulação negativa significativa de CRU3 em raízes, o que se correlaciona com um comprimento de raiz reduzida. O cobre é um co-fator essencial para os processos-chave em plantas, mas exerce efeitos prejudiciais quando em excesso; assim, superexpressão de transporte cobre compromete o crescimento da planta. O efeito da reversão GMF era uma superexpressão significativa de COTP1 em ambos os brotos e raízes, o que explica o baixo crescimento da planta. Ion estresse prejudica o metabolismo dos cloroplastos, que está firmemente ligada ao estado redox da célula. Na Arabidopsis o factor de transcrição RRTF1 é importante para a expressão de genes associados à capacidade para se adaptarem às alterações redox 31. Por isso, quando as plantas são expostas aos estímulos externos capazes de alterar o seu desenvolvimento fisiológico eprogramas de al uma superexpressão deste fator de transcrição importante é esperado. Reversão da GMF induziu uma superexpressão significativa de RRTF1 em ambos os brotos e raízes, indicando, assim, maiores respostas ao estresse oxidativo de plantas a condições GMF invertidas. Resultados interessantes são obtidos através da análise dos cinco genes envolvidos no stress oxidativo. Em geral, todos os genes extraídos e analisados ​​na parte aérea não apresentou diferenças significativas (P&gt; 0,05) quando as plantas foram cultivadas em condições normais ou revertidas GMF (Figura 4 e Figura 5). No entanto, uma regulação negativa significativa foi sempre observada em raízes de plantas expostas a condições GMF invertidas. Em particular, mostrou CAT3 a regulação negativa mais elevada (Figura 5), seguido em ordem de regulação negativa por APX1, FSD1, RBOHD e TAPX (Figura 4). Tolerância cruzada a umstress biótico e biótico é fornecido pela activação de diferentes genes envolvidos em várias vias bioquímicas. factor de transcrição RRTF1 facilita a co-activação sinérgica da expressão de genes destas vias de 15,31, e pode ser potencialmente envolvidos no stress oxidativo 32. Portanto, a regulação positiva de RRTF1 é esperado quando a eliminação de oxigénio é reduzida. Regulação negativa de enzimas eliminadoras de raiz correlaciona-se com a regulação positiva de RRTF1, que age em resposta ao aumento do estresse oxidativo. A regulação baixa dramática da raiz CAT3, APX1 e TAPX indica a capacidade reduzida de células das raízes para limpar H 2 O 2, que é acompanhado pela redução da capacidade para dismutar o ânion superóxido por regulação negativa da FSD1. As respostas ao estresse oxidativo é maior nas raízes, que parecem ser o principal sítio de percepção GMF revertida. Figura 1. Geomagnetic sistema de campo de Compensação. (A) (triaxiais bobinas que compreendem um par de bobinas para cada octogonais de três eixos perpendiculares) usado para inverter o vector de campo geomagnético. (B) Uma fonte de alimentação controlado por computador é ligado a cada par de bobinas de Helmholtz. (As tensões estes números são arbitrários) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Figura 2. Efeito da inversão geomagnética em Arabidopsis campo morfologia. Após dez dias de exposição, as plantas de controlo (ou seja, aqueles expostos a condições normais GMF) mostram uma significativamente maior comprimento de raiz e mais expanfolhetos ded em comparação com as plantas que foram expostos a condições GMF invertidas. Bar Metric = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Figura 3. Efeitos da reversão campo geomagnético na expressão do gene Arabidopsis. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas foi extraído e analisado por PCR em Tempo Real para análise de expressão. O efeito da reversão da GMF era induzir uma mudança drástica na expressão gênica de todos os genes que foram testados CRU3, cruciferina 3;. COTP1, Cobre Transportes protein1; RRTF1, Redox Responsive Factor1 Transcrição. As barras indicam o erro padrão; asteriscos indica (P &lt;0,05) diferenças significativas entre plformigas expostas a condições GMF revertida e normais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Figura 4. Efeito da reversão campo geomagnético sobre a expressão gênica relacionados com antioxidante Arabidopsis. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas são isolados e utilizados para análise de expressão de genes utilizando PCR em tempo real. O efeito da reversão da GMF era induzir alterações significativas na expressão gênica filmagem; no entanto, uma regulação baixa drástica foi observada na expressão gênica radicular das plantas cultivadas sob condições GMF invertidas TAPX, Thylakoidal peroxidase do ascorbato;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxide dismutase1; RbohD, NA. DPH / Respiratory explosão oxidase proteína D barras indicam o erro padrão; asteriscos indica (P &lt;0,05) diferenças significativas entre as plantas expostas a condições GMF invertidas e normais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Figura 5. Efeitos da inversão geomagnética em Arabidopsis campo catalase 3 (CAT3) a expressão do gene. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas são isolados e utilizados para análise de expressão de genes utilizando PCR em tempo real. O efeito da reversão da GMF era induzir alterações significativas na expressão gênica filmagem; No entanto, uma regulação negativa drástica foi observada na expressão do gene da raiz de plantas crescidas sob condições GMF invertidas. As barras indicam Erro padrãor; asteriscos indica (P &lt;0,05) diferenças significativas entre as plantas expostas a condições GMF invertidas e normais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Geomagnética Field (Gmf) and Plant Evolution: investigação dos efeitos dos Gmf Reversão sobre<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desenvolvimento e Expressão Gênica

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K visualizações.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Vídeo: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Biologia do Desenvolvimento

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

Avaliação dos efeitos endócrinos compostos no desenvolvimento da função de vertebrados Rede Neural utilizando eletrodos multi matrizes

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...