The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Para amostras de tecido que foram submetidos a coloração histológica convencional, a identificação e análise de nanopartículas de óxido de metal pode ser conseguida através de uma combinação de EDFM, mapeamento HSI, e técnicas de análise de imagem. Embora haja flexibilidade na preparação de amostras para histologia ou imuno-histoquímica (por exemplo, usando tecidos fixados ou congelados; tipo de mancha), é importante que as amostras são seccionados a uma espessura de 5-10 mm para melhor visualização. As amostras usadas aqui foram fixados em formalina e antes de seccionamento com um micrótomo rotativo a 6 mm de espessura embebido em parafina, montadas em lâminas de vidro para microscópio, coradas com hematoxilina e eosina e lamínulas. Tecidos da pele de suíno de um ex vivo colaboração penetração cutânea toxicologia foram usadas para este estudo. Os tecidos foram expostos a nanopartículas de óxido de metal (alumina, sílica, céria) em suspensões aquosas. Detecção da região (s) de interesse (eleme alto contrastents) com EDFM é um primeiro passo crítico que facilita a posterior mapeamento e análise HSI. Amostras de controlo positivas e negativas devem ser visualizados e analisados ​​em primeiro lugar, a fim de criar uma biblioteca espectral para referência. Os espectros coletados a partir do controlo positivo são exportados para uma biblioteca espectral controlo positivo. Em seguida, todos os espectros a partir das imagens de controlo negativo são subtraídos da biblioteca espectral do controlo positivo, a fim de melhorar a especificidade (reduzir os falsos positivos). A biblioteca espectral filtrado resultante é considerado o RSL que serve para a análise dos materiais de interesse. Todas as amostras de tecido são submetidos ao mesmo processo de imagem e são mapeados contra o LSR. A imagem resultante irá conter apenas áreas com elementos de interesse sobre um fundo preto. Esta imagem pode então ser analisado utilizando o ImageJ com as suas funções de limiar e de análise de partículas para se obter a área de partículas mapeados por campo de visão. Os dados numéricos obtidos a partir ImageJ pode ser exportaçãoed para uma planilha para análise posterior. É importante considerar que, como amostras biológicas são inerentemente diferentes um do outro, e métodos de coloração pode afetar a visualização através EDFM e HSI, as configurações de exposição deve ser determinado de acordo com o que produz a melhor imagem de alto contraste para um tipo específico de amostra. Embora a redução de falsos positivos pode ser conseguido através da filtragem de bibliotecas espectrais, é crucial para se obter controlos negativos fiáveis ​​que têm evitado a contaminação com o elemento de interesse, como o espectro correspondente a esta contaminação poderia potencialmente ser filtrados a partir da biblioteca espectral do controlo positivo , aumentando as taxas de falsos negativos. Além disso, a faixa de intensidade espectro que é detectável com o software de imagem hyperspectral não pode ultrapassar o limite do software particular (para este estudo, ou seja, 16.000 unidades): áreas com um elevado número de partículas acumuladas que produzem spintensidades ectral acima do limite de intensidade são deixados de fora da biblioteca espectral, devido ao risco de aumentar o número de falsos negativos. Enquanto o sistema HSI confere muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais, existem algumas desvantagens e limitações a considerar. Uma delas é que a grande quantidade de dados ópticos recebidos podem exigir poder de computação substancial. Outra é que HSI pode ser demorada, principalmente nos estágios iniciais, quando as bibliotecas de espectros de referência estão sendo criados. Além disso, o tempo de imagem pode levar vários minutos por captura de imagem, tornando-o mais lento do que simples imagem de campo escuro; No entanto, é ainda mais rápido do que a execução preparação das amostras e visualização por microscopia electrónica. Além disso, sistemas complexos pode resultar em vários espectros característicos, que exigem o desenvolvimento de controles altamente especializados e fazer o estabelecimento de, bibliotecas de referência universais padronizados difíceis 26. Finalmente, a tecnologianique resultados em resolução mais baixa do que as técnicas probe- ou elétron-microscopia, tais como microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de transmissão, que podem resolver átomos individuais. A resolução dessa técnica é limitada devido à sua natureza fotônico, que a impede de ser uma ferramenta de alta precisão para medir tamanhos de partículas no nível nanométrico ou para localizar precisamente materiais a um nível sub-micron. Enquanto que a técnica pode ser capaz de identificar partículas dentro de determinados compartimentos de tecidos ou organelas celulares superiores a 1 uM (tais como núcleos de células), ou organelos pequenos recursos são difíceis de visualizar com precisão com este método. Também digno de nota, dada a sua resolução espacial, este método não pode diferenciar entre as nanopartículas individuais e aglomerados 11. Outras considerações incluem: certos materiais (como metais nobres) têm muito mais elevada reflectância e perfis espectrais distintas, o que pode torná-los mais fáceis de Analyze e mapa espectral com esta ferramenta. Outros, tais como os óxidos metálicos semi-investigados neste estudo e nanomateriais à base de carbono 24, 27, pode ser mais difícil, devido à sua composição elementar, forma, e de acordo com a matriz. Em dois estudos de inalação de murino por Mercer et ai., Um sistema similar ao empregue no presente estudo foi utilizada a fim de localizar os nanotubos de carbono no pulmão e nos órgãos secundários com base na sua extraordinariamente elevado contraste com os tecidos circundantes. No entanto, o mapeamento hiperespectral não foi demonstrada em qualquer um dos estudos, provavelmente porque a forma única de fibras de carbono foi suficiente para uma característica de identificação. Outra consideração refere-se especificamente aos tecidos: desde depositando nanopartículas de interesse para órgãos específicos através de processos biofísicos normais é imprevisível (e muitas vezes ele próprio objecto de estudo), determinação de um controlo positivo aplicável pode ser difícil e requer a consideração de como a geração do controle mIGHT afetar o estado de um material de interesse. Por exemplo, se uma biblioteca espectral é criado a partir de nanopartículas cristalinas de interesse, pode ser difícil para mapear a biblioteca para as mesmas nanopartículas em tecidos ou células, devido a alterações nos espectros resultantes da alteração da partícula (por exemplo, devido a alterações nas pH, dissolução, aglomeração, a ligação às proteínas) e do microambiente global ou matriz. Finalmente, a técnica está limitada na sua natureza semi-quantitativa: ela só pode ser tão quantitativa como outras técnicas de microscopia bidimensional de resolução semelhante, o que significa que não pode ser facilmente usado para executar tarefas, tais como caracterização de carga órgão total de um material. No geral, EDFM e HSI fornecer várias vantagens em relação às técnicas convencionais de imagem e caracterização de nanomateriais, como TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permite a aquisição de imagens mais rápido e análise, o que economiza tempo e custo em comparação com mais conven intensivatécnicas adicionais. Além disso, a preparação da amostra para EDFM / HSI é tipicamente tanto mínima e não destrutiva, o que poupa tempo e também permite uma análise mais flexível de uma dada amostra, uma vez que pode, em seguida, ser utilizados para outras técnicas. Além disso, a HSI é versátil, permitindo a análise de materiais em nano-escala e de muitas composições numa grande variedade de matrizes. A equipe de pesquisa está trabalhando para aperfeiçoar o método descrito aqui para outros materiais e tipos de amostras, incluindo uma avaliação aprofundada da especificidade da tecnologia. A próxima etapa crítica sob investigação pela equipa de investigação é a validação dessas técnicas em relação aos padrões tradicionais de ouro (por exemplo, Raman, TEM, SEM) para os materiais e tipos de tecido de interesse.

Como nanomateriais são cada vez mais usados ​​em uma variedade de indústrias e aplicações, existe uma necessidade de métodos de imagem em nanoescala e caracterização que são mais rápido, acessível e conveniente do que as modalidades tradicionais, como a microscopia eletrônica. Para visualizar as interações de nanopartículas (NP) com as células, tecidos e sistemas vivos, têm sido empregadas muitas técnicas ópticas, incluindo contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia 1 e abordagens baseadas em campo evanescente, como a Total Internal Reflection (TIR) ​​ou quase microscopia de varrimento de campo óptico (NSOM) 2,3. No entanto, estas são abordagens analíticas de ponta, fora do alcance da maioria dos laboratórios não especializados 4. A microscopia electrónica, incluindo microscopia electrónica de transmissão (TEM), também tem sido utilizada para estudar a interacção com células 5,6,7,8 NP. Alto ângulo anular darkfield (HAADF) digitalização microscopia eletrônica de transmissão tem sido usado para estudar a interação de NPscom vírus 9. A microscopia confocal é uma outra técnica popular usada para estudar as interações célula-NP 10. Nos últimos anos, imagem hiperespectral (HSI) técnicas baseadas em campo escuro foram utilizados como uma ferramenta analítica promissora para estudar NPs de 11 em matrizes biológicas. Sistemas HSI gerar uma representação tridimensional de dados espaciais e espectrais, conhecido como um hipercubo ou datacube 12. O mapa espacial de variação espectral é usado para identificação do material. Perfis espectrais de materiais conhecidos pode ser gerado e utilizado como bibliotecas de referência para comparação com as amostras desconhecidas. Uma das vantagens principais com sistemas HSI é a sua capacidade de combinar imagiologia com espectroscopia, estabelecendo assim a localização e distribuição de NPs desconhecidos in vivo ou ex vivo, bem como ligando-os a uma outra partícula de referência conhecida, a composição semelhante. Há várias vantagens deutilização de sistemas de HSI sobre técnicas de imagem convencionais: a preparação da amostra mínima é necessária; preparação da amostra é tipicamente não-destrutiva na natureza; aquisição e análise de imagem é mais rápida; a técnica é de 13 rentável; ea distribuição espacial e análise de compostos de composição mista e / ou em matrizes complexas é mais facilmente conseguido 14. Para nanomateriais pesquisa envolvendo amostras preciosos, uma das considerações mais importantes é a disponibilidade de um método de imagem não destrutivo, que permite o potencial para examinar amostras repetidamente por um ou mais métodos. Repetida ou múltiplas análises pode ser desejado o desenvolvimento de conjuntos de dados globais, que não estariam disponíveis a partir de um único método. Para este respeito, estudando suas propriedades ópticas é a forma mais segura para analisar a amostra. Usando um microscópio de campo escuro reforçada (EDFM) e HSI sistema para estudar a resposta óptica da amostra - nomeadamente Reflectance, mas também absorvância e transmitância - identificação e caracterização recurso pode ser realizada 15. Endpoints potenciais caracterização incluirá uma avaliação do tamanho e forma de nanopartículas ou aglomerados e distribuição das nanopartículas dentro de uma amostra relativa. Neste artigo, descreve métodos de mapeamento especificamente para as nanopartículas de óxido de metal no tecido post-mortem usando um sistema HSI baseado em um algoritmo jogo pixel-espectral referido como um mapeador ângulo espectral (SAM). Nós escolhemos esta aplicação em particular porque ele tem o potencial para complementar atual e futura no domínio da investigação nanotoxicology vivo, em modelos animais são usados ​​para avaliar as implicações para a saúde da exposição a nanomateriais artificiais. A aplicação deste método pode também informar a investigação entrega da droga em nanoescala que utiliza modelos de tecido ou animais. Em particular, a absorção de nanopartículas, distribuição, metabolismo e excreção em todo organs e tecidos poderiam ser investigados com este sistema. Uma grande variedade de aplicações estão sendo investigados para uso em investigação biomédica 11. Este método poderia ser utilizado para a avaliação de amostras biológicas diferentes (tais como vários tecidos, tipos de amostras de lavagem bronco-alveolar, e esfregaços de sangue) que tenham sido expostos a nanopartículas de uma variedade de composições elementares 16-19. Além disso, este método é útil para o estudo de nanopartículas biodistribuição in vivo e in vitro, que é pertinente para os estudos de libertação de fármacos 11 nanoescala. Além amostras biológicas, EDFM e HSI pode ser utilizado para avaliar as nanopartículas em amostras ambientais, tais como esgotos 20. Avaliação da exposição ocupacional pode ser facilitada pela utilização desta técnica, bem como, uma vez que pode ser utilizado para avaliar a eficácia do equipamento de protecção individual na prevenção da penetração de nanopartículas. Além disso, a pesquisa de team está actualmente a desenvolver um EDFM semelhante e protocolo HSI para a avaliação de amostras de mídia de filtro de nanopartículas coletados a partir de avaliações de exposição ocupacional. Embora a preparação destes diferentes tipos de amostras para EDFM e HSI pode variar, é importante que eles são preparadas de tal forma que eles podem ser facilmente visualizados pelo sistema óptico. Tipicamente, a amostra deve ser preparado como se iria ser visualizado através de microscopia de campo claro tradicional. Existem vários sistemas de imagem hyperspectral comercialmente disponíveis 11.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Microscopia Hyperspectral é útil para a sua capacidade para identificar os materiais de uma maneira semelhante à espectrofotometria. Como indicado na Figura 1, cada material tem vários espectros característicos e uma forma geral da sua reflectância, que é único. Além disso, a Figura 1 ilustra a natureza dependente da matriz dos perfis espectrais: os perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em amostras de tecidos histológicos (painel superior) são diferentes dos perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em suspensão aquosa ( painel inferior). Ao mapear os perfis espectrais característicos para amostras desconhecidas na mesma matriz, a técnica é útil para determinar a presença ou ausência de um material, e pode também semi-quantitativamente comparar quantidades relativas de materiais em amostras. As bibliotecas de referência espectrais criados a partir de amostras de pele de controlo positivo são apropriados para mapeamento para experimentalamostras de pele. Como pode ser visto na Figura 2, as bibliotecas espectrais de referência bem mapeada para os controlos positivos correspondentes e não são mapeadas para os controlos negativos correspondentes. A vantagem mais significativa da técnica é a sua capacidade para detectar baixos níveis de materiais de interesse em amostras, bem como a diferenciá-los dos contaminantes. . Por exemplo, os nanotubos individuais pode ser observada nos pulmões durante a inalação de doses tão baixas como 40 ug num 20-30 g de rato de 25 A Figura 3 demonstra presente em amostras de pele histológicos: enquanto algumas partículas são prontamente evidente na imagem óptica de campo escuro (coluna 2), outros são detectados usando imagens hiperespectrais (coluna 3) que poderiam ter sido perdidas usando microscopia de campo claro (coluna 1) ou outros métodos. O uso de darkfield HSI também serve para melhorar a especificidade sobre microscopia de campo claro simples. Estas imagens podem então ser sujeitas a formas mais quantitativos de análise, nanálise de partículas otably via ImageJ. A microscopia de campo escuro reforçada tem várias aplicações diferentes, mesmo na ausência de imagem hiperespectral. O primeiro é a sua capacidade para gerar alta qualidade, imagens de alto contraste. Isto é melhor demonstrado na Figura 3, no qual as partículas de interesse são facilmente identificáveis, em comparação com os seus homólogos de campo claro. Estas imagens podem também ser objecto de análise quantitativa de partículas, embora na ausência de mapeamento hyperspectral, cautela é necessária para evitar confundir uma partícula contaminante de uma partícula de interesse. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Figura 1. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) em comparação com bibliotecas espectrais (nanopartículas em suspensão). Esta figura demonstra a importância de gerar uma biblioteca de referência espectral de nanomaterials de interesse na mesma matriz como amostras experimentais. A primeira linha mostra a biblioteca espectral de referência (RSL) para cada material neste estudo (alumina, sílica e óxido de cério). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Este RSL foi criado pelo método descrito neste protocolo, onde amostras de tecido de controlo positivo foram filtrados contra amostras de tecido de controlo negativo. A segunda linha mostra bibliotecas espectrais (SL) criadas a partir das nanopartículas de interesse na suspensão líquida sobre uma lâmina de vidro. Para alumina, uma pico bimodal em comprimentos de onda de 500 e 650 foi encontrado no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada em suspensão a alumina NP SL em cerca de 600. Para sílica, um pico a um comprimento de onda de cerca de 650 foi presente no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada na suspensão de sílica em NP SL arouND 600. Para céria, um pico bimodal foi encontrada em comprimentos de onda de 520 e 620 no LSR, ao passo que um pico menos distinta foi observada na céria NP SL suspensão em cerca de 560. Isto sugere que a matriz na qual estão incorporados os PN cria uma mudança de espectros que podem ser consideráveis ​​quando seleccionar os controlos para criar o SL como para a experiência específica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Figura 2. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) mapeado no controle positivo e controle negativo o tecido da pele porcina. Este valor serve como uma confirmação da ENO conforme apropriado para mapeamento para amostras experimentais, em que cada RSL (coluna da esquerda) bem mapeado no seu correspondente controlo positivo (coluna do meio) e não mapeia no seu correspondente controlo negativo (coluna da direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique h</a>ere para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Figura 3. Hyperspectral mapeamento de tecido porcino experimental pele exposta a nanopartículas de óxido de metal. Fileiras de cima para baixo correspondem a diferentes camadas da pele, de superficial a camada mais profunda: epiderme, derme e tecido subcutâneo, respectivamente. A primeira linha mostra o estrato córneo da epiderme, a partir de uma amostra de pele que foi exposta à NPs de alumina em suspensão; a segunda linha foi expostos à sílica NPs em suspensão; a terceira fileira de Ceria NPs em suspensão. Cada coluna representa a mesma área da pele trabalhada com técnicas diferentes. A primeira coluna corresponde à microscopia de campo claro (40X mag .; barra de escala = 50 mm), onde a área inscrita num quadrado vermelho foi ampliado (100X mag; barra de escala = 10 mm) com a microscopia de campo escuro reforçada (EDFM) na segunda coluna, onde setas brancas estão apontando para o alto contraste NPS. A terceira coluna foi obtida com uma câmera hyperspectral (HSI), mostrando as mesmas NPs alto contraste (setas brancas). EDFM e HSI imagens foram tiradas com uma ampliação de 100X; barra de escala = 10 mm. A quarta coluna mostra a imagem HSI mapeado contra o respectivo RSL para cada grupo de exposição, onde NPs de alumina são mostrados em verde, o NPS de sílica em vermelho, e céria NPs em amarelo, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K visualizações.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengenharia

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Fabricação de um dipolo-assistida Fase Sólida Extração Microchip para análise de metais traço em amostras de água

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.