Este método de detecção baseado em nanoporos demonstrou o potencial de caracterizar fisicamente e identificar moléculas individuais. Trabalhar com metallo-nanopartículas, que é o propósito deste vídeo, está desafiando nossa compreensão do que limita a precisão e precisão da medição. A principal vantagem dessa técnica é que este aparelho tem maior largura de banda do que a configuração tradicional de memória bicamada lipídica, o que nos permite ver resultados mais rápidos e mais reações em nanoporos.
Essa técnica foi possível porque no início da década de 1990 foi demonstrado que o gating em nanoporos proteicos, ou seja, alternando entre diferentes estados, pode ser controlado e moléculas podem se ligar à parede dos poros. Esta técnica está sendo desenvolvida para aplicações comerciais de sequenciamento de DNA porque usa amostras mínimas. Ele não requer rótulos fluorescentes e usa comprimentos de leitura muito mais longos do que os métodos convencionais.
Esta técnica também foi desenvolvida para discriminar polímeros com base em seu tamanho com maior precisão e velocidade do que eletroforese gel e cromatografia. Primeiro, prepare 500 mililitros de uma solução de cloreto de sódio de um molar e fosfato monossódico de 10 mililitros em água ultrapura como o eletrólito. É melhor usar soluções e amostras frescas com esta configuração em particular.
Além disso, descobrimos que a água desionizada de alta qualidade é muito importante para formar membranas com sucesso. Em seguida, combine um miligrama de pó monoméico de hemolise monomérica de lyophilized com um mililitro de água ultrapura. Não se esqueça que trabalhar com a proteína da toxina staph aureus alfa hemolysin pode ser perigoso.
Siga as precauções no MSDS ao realizar este procedimento. Em seguida, prepare quatro mililitros de cinco miligramas por mililitro DPhyPC em endecaine em um frasco de cintilação de vidro. Tampe o frasco com uma tampa revestida de politetrafluoroetileno e armazene-o a quatro graus Celsius por até um mês.
Depois disso, dissolva 57,6 miligramas de 12-phosphotungstic acid hydrate em 10 mililitros do eletrólito para fazer uma solução de polioxometato de dois milimilimais. Divida a solução POM em duas porções de cinco mililitros. Use hidróxido de sódio de três molares para ajustar o pH de uma solução POM para 5,5.
Para começar a se preparar para o teste, monte a célula de teste de um aparelho de eletrofisiologia lipídica planar. Primeiro, abrade um fio de prata com lixa de 600 grãos e mergulhe-o em alvejante à base de hipoclorito de sódio comercialmente disponível por 10 minutos para fazer o eletrodo de fio de cloreto de prata-prata. Enxágüe e seque o eletrodo do fio antes de inseri-lo no capilar de quartzo do aparelho.
Mantenha o eletrodo dentro da membrana quartzo-nanopora, ou QNM, separando o capilar e o reservatório. Em seguida, coloque um eletrodo cilíndrico de cloreto de prata-prata montado em um fio de prata no reservatório. Conecte os dois eletrodos à placa do circuito do amplificador.
Em seguida, abra o programa de aquisição de dados e inicie a fonte de alimentação a zero milvolts. Confirme que nenhuma corrente DC é detectada entre os eletrodos na célula vazia. Durante esta demonstração é importante observar como a pressão transcapilária pode afetar a formação de membrana e a subsequente formação de nanoporos.
Sem fazer esses dois passos corretamente, os experimentos não funcionarão. Carregue cerca de um mililitro de eletrólito em uma seringa e conecte-o à linha de fluidos conectada ao reservatório. Adicione eletrólito ao reservatório até que a face do QNM esteja submersa, como indicado pela corrente iônica entre os eletrodos que saturam o amplificador.
Se o amplificador não saturar, despreze o QNM aplicando uma tensão pop de mais ou menos um volt ou aumentando a pressão capilar em cerca de 300 milímetros de mercúrio. Use ambas as técnicas, se necessário. Uma vez que o amplificador satura, retire o eletrólito do reservatório até que os níveis da solução caiam abaixo do QNM, como indicado pela corrente voltando a zero.
Para iniciar o processo de formação de bicamadas lipídicas, eleve o nível de solução de eletrólitos bem acima da face do QNM e note quanta solução foi a solução. Em seguida, mergulhe uma ponta de pipeta de 10 microliter na solução DPHyPC e desenhe todos os lipídios visíveis na ponta. Toque na ponta da pipeta até a superfície da solução de eletrólitos e deixe o lipídio fluir da pipeta através da interface ar-água.
Espere de dois a cinco minutos para o lipídio se espalhar uniformemente pela solução. Em seguida, retire lentamente o eletrólito até que a superfície da solução esteja abaixo do QNM e, em seguida, adicione lentamente eletrólito suficiente para levantar a solução acima do QNM para formar a membrana de bicamadas lipídicas isolantes. Se o bicamado não se formar após três tentativas, aplique outra porção de lipídio como descrito anteriormente e repita o processo.
Uma vez que o bicamado parece ter se formado, aumente a pressão para o capilar para estourar a bicamada e, em seguida, reformá-la, baixando-a lentamente e elevando o nível da solução da mesma forma que antes. Repita este processo várias vezes para garantir que o QNM não esteja entupido e que uma bicamada tenha se formado. Em seguida, descongele uma alíquota de proteína de hemolise alfa no gelo ou à temperatura ambiente.
Encha o reservatório com 250 nanogramas de proteína monomérica de hemolise alfa e cerca de 250 microliters de água ultrauso. Em seguida, aplique um viés de 200 a 400 milívolos para induzir a formação de poros. Para facilitar a formação de poros, aumente a pressão capilar em 40 a 200 milímetros de mercúrio para expandir a bicamadas do QNM.
Uma vez que um nanoporo se forme, reduza o viés aplicado à tensão de medição e reduza a pressão para cerca de metade da pressão de inserção. Para iniciar o teste, reajuste a tensão de compensação dc para garantir que não haja corrente medida quando o potencial aplicado for definido como zero. Em seguida, adquira um traço de corrente iônica para um potencial aplicado de 120 a 120 milvolts negativos em relação ao reservatório.
Confirme que não há contaminantes, o que seria indicado por bloqueios de corrente espontânea. Adicione um a seis microliters de pH 5,5 solução de cluster POM de dois mililitros ao reservatório. Aplique medições de série temporal de corrente iônica a uma tensão aplicada de 120 milvolts negativos.
O movimento de moléculas de ácido fosfotungstic aniônico individual através do canal de hemolise alfa produziu bloqueios transitórios que diminuíram a corrente iônica média de poros abertos em cerca de 80%A duração e a corrente de bloqueio estão diretamente relacionadas com a interação partícula-porosa, permitindo que as espécies iônicas sejam diferenciadas em histogramas das relações de profundidade de bloqueio relativo. No pH 5,5, foram observados dois picos com índices de profundidade de cerca de 0,06 e 0,16. Com base na RMFfosphorosa, o pico menor foi a espécie fosfotungstate de seis menos e o pico principal foi a espécie de sete menos.
No pH 7.5, as concentrações relativas mudaram para uma proporção maior das espécies de 6-menos para as espécies de sete menos. A redução de 20 vezes nos eventos de bloqueio em relação ao pH 5.5 foi atribuída à degradação ao fosfato livre e aos íons tungestados. A montagem das distribuições de tempo de residência exigia múltiplas funções exponenciais, indicando vários tipos de interações partícula-poros dentro de cada espécie iônica.
Os tempos de residência mais curtos no pH 7.5 sugeriram interações partícula-poros mais fracas do que pH 5.5, consistentes com estudos anteriores mostrando alterações dependentes de pH no número relativo de cargas fixas dentro ou perto do lúmen do canal de hemolise alfa. A água deionizada de alta pureza é fundamental para esta configuração em particular. Um cartucho de filtro orgânico gasto foi a causa provável de nosso laboratório ser incapaz de formar membranas nos QNMs por meses.
Indivíduos novos nesta versão particular do método também podem lutar porque as membranas são tão pequenas e há um truque para obter nanoporos para formar. Este método, iniciado há várias décadas, tem se mostrado útil para analisar íons, ácidos nucleicos e polímeros sintéticos, bem como sequenciamento de DNA. Também poderia encontrar aplicações em biofísica e biologia celular básica.
Por exemplo, esse procedimento pode ser usado para estudar as propriedades físicas de polímeros sintéticos e biopolímeros para investigar seu tamanho, interações com outras moléculas e outras questões importantes.
