Nosso protocolo utiliza uma análise de verificação de partículas únicas para monitorar a dinâmica do local e da orientação e caracteriza a difusão de nanorods dourados nas membranas celulares. Utilizando este método, tanto a dinâmica translacional quanto a rotacional dos nanorods dourados podem ser obtidas e a dinâmica pode ser analisada de forma abrangente e apresentada. Este protocolo tem potencial para ser utilizado para o estudo de outros tipos de sistemas biológicos complexos.
Comece queimando uma mancha de vidro mergulhada com etanol na chama e colocando o deslizamento de cobertura em um prato de cultura celular de 35 por 10 milímetros contendo dois mililitros de cultura celular sem fenol vermelho. Adicione 50 microliters da suspensão celular de interesse na tampa e agite suavemente o prato para frente e para trás e para a esquerda e para a direita para distribuir uniformemente as células. Coloque o prato na incubadora de cultura celular por aproximadamente 12 horas até que as células atinjam 20 a 40% de confluência antes de adicionar 20 microliters de nanorods de ouro revestidos de CTAB ao prato.
Depois de tremer suavemente para dispersar os nanorods uniformemente através do prato, coloque o prato em uma atmosfera umidificada por cinco minutos. No final da incubação, transfira lentamente 100 microlitros de supernadireção do prato para o sulco de um slide de vidro e coloque cuidadosamente o lado da célula de deslizamento para baixo na ranhura de slides, em seguida, selar a borda da tampa com esmalte e deixar o esmalte secar antes de colocar o slide no estágio do microscópio de campo escuro. Para um único rastreamento de partículas por microscopia de campo escuro, coloque uma gota de óleo no condensador de campo escuro e gire o botão até que o condensador entre em contato com a lâmina de vidro.
Coloque uma gota de óleo na parte superior do vidro de cobertura e gire o botão de foco até que o objetivo de imersão de óleo de 60X toque o óleo. Acenda a fonte de luz e gire ligeiramente o botão de foco para focar o plano de imagem. Em seguida, clique no ícone da câmera no software do microscópio para gravar uma série de tempo de imagem de dispersão de luz usando a câmera CMOS colorida e salvar a imagem em um formato TIFF.
Para extrair uma única trajetória de longo prazo, abra a imagem no ImageJ e clique em imagem, digite e 8 bits para converter a imagem do modo RGB para o modo de 8 bits. Para ajustar o contraste, clique na imagem, ajuste, contraste de brilho e defina os parâmetros. Selecione uma partícula de destino e use o Controle X para cortar o fundo da série temporal.
Clique em plugins, rastreador de partículas e rastreador de partículas para abrir a janela de detecção de partículas e partículas e definir o raio para seis, o corte para zero e o percentil para 0,01%Defina o intervalo de link para 10 e o deslocamento para 10 e clique em OK para abrir a janela de resultados do rastreador de partículas para ver os resultados. Clique em visualizar todas as trajetórias para inspecionar as trajetórias geradas. Se a trajetória gerada pelo software e a trajetória móvel dos nanorods de ouro forem combinadas, clique em salvar o relatório completo para salvar os resultados.
Se a trajetória gerada pelo software não corresponder à trajetória móvel dos nanorods de ouro, clique em relink partículas para revincular as partículas detectadas com diferentes intervalos de link e parâmetros percentil. Para encontrar a coordenada de pixel central do nanorod de ouro em cada quadro de acordo com a coordenada XY, use a xicoordinação. função m.
Para delimitar uma matriz de três por três pixels, extrair os nove valores de intensidade de dispersão dos canais vermelho ou verde e calcular um valor médio, use a rgextraction. função m. Então use o polarangle.
função m para calcular os ângulos polares usando o método diferencial de canal duplo. Para calcular parâmetros dinâmicos usando as fórmulas na tabela, execute os dois scripts de análise. Para análise visual da trajetória, defina a coordenada X como X, a coordenada Y como Y, e o tempo como Y, em seguida, clique em plot, dispersão e mapa de cores, defina os parâmetros gráficos e adicione a barra de cores.
Para gerar números médios de intervalo de deslocamento quadrado, defina o intervalo de tempo como X e o deslocamento quadrado médio como Y.Clique em plot, dispersão, análise, montagem, encaixe da curva não linear e diálogo aberto e defina os parâmetros gráficos. Para análise estatística de várias partículas, defina os parâmetros dinâmicos de interesse como Y e clique em plot e histograma. Clique duas vezes no histograma para definir o tamanho da divisão ou o número de divisões e clique em aplicar.
Em seguida, adicione uma coluna e defina os parâmetros do gráfico. Para uma análise de séries temporáticas, defina o tempo como X e os parâmetros da série temporal como Y.Click plot, multi-pane e stack. Na janela pop-up, selecione linha e OK. Em seguida, defina os parâmetros para o gráfico.
O máximo plasmônico longitudinal de 40 por 85 nanômetros CTAB revestido nanorods de ouro é de aproximadamente 650 nanômetros e a ressonância transversal é de 520 nanômetros. A intensidade de dispersão dos nanorods de ouro revestidos de CTAB em membranas celulares U87 demonstra uma distribuição típica gaussiana com uma largura estreita consistente com a de nanorods de ouro revestidos de CTAB em vidro indicando que os nanorods de ouro revestidos CTAB rastreados neste experimento são bem monodisperados. Como ilustrado, mais de 500 trajetórias de nanorod de ouro revestidas de CTAB podem ser rastreadas por microscopia de campo escuro e podem ser divididas em trajetórias de difusão de longo alcance e trajetórias de difusão confinadas.
O raio de giro de todas as 500 trajetórias nesta análise representativa mostrou uma distribuição de pequeno valor com um raio médio de giro de 0,5 micrômetros e o deslocamento máximo foi mais distribuído em pequenos valores. Como demonstrado neste conjunto média de tempo análise de deslocamento quadrado, o CTAB revestido nanorods de ouro normalmente difuso com um alfa de aproximadamente um. A distribuição de densidade do coeficiente de difusão e do alfa obtido de todas as trajetórias, no entanto, revela que a dinâmica dos nanorods de ouro exibe uma distribuição heterogênea com movimentos de superdiffusão, browniano e subdiffusão.
Além disso, a análise estatística de partículas únicas e a análise de parâmetros da série temporal podem ser utilizadas para caracterizar duas trajetórias representativas confinadas e móveis a longo prazo. É necessário resumir e extrair uma única interpretação nova dos dados da leitura da análise de rastreamento de partículas únicas, pois normalmente existem algumas trocas difíceis de fazer.
