The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. O acoplamento químico de proteínas a polímeros Grânulos <ol><li> Tiol-amina acoplamento direccional Nota: Este protocolo é adequada para o acoplamento de proteínas contendo cisteína a amina funcionalizada pérolas de polímero, usando sulfosuccinimidil 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulação (Figura 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Figura 1. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-amina das proteínas de pérolas de polímero. Amina-esferas de poliestireno modificadas são activados com Sulfo-SMPB. A maleimida reage com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de reagentes: <ol><li> Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li&gt; <li> Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS) de TCEP (Tris (2-carboxietil) fosfina) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Ativação Bead: <ol><li> Misture a suspensão de pérolas, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. </li><li> Adicionar 200 ml de 10 mM preparada de fresco Sulfo-SMPB, para dar um final de concentração de 2 mM. </li><li> Incubar a suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. </li></ol></li><li> Redução da proteína: <ol><li> Durante o período de incubação da etapa de activação, se preparar a proteína para o seguinte passo de acoplamento para que possa ser imediatamente adicionado às esferas activadas. Nota: Embora este passo de redução não é sempre necessária para GST (glutationa S-transferase) proteínas de fusão, recomenda-se a assegurar uma alta eficiência de acoplamento. <ol><li> Verifique a concentração de proteína, e ajustá-lo para a concentração final necessária para a reacção de acoplamento. Nota: proteína 6 mM em PBS, e um volume de 1 ml são normalmente utilizados. </li><li> Adicionar da TCEP para dar uma concentração final de 5 mM. Incubar a solução durante 30 min à TA. Nota: A mistura de reacção pode ser utilizado directamente para a seguinte reacção de acoplamento. </li><li> Reter uma pequena quantidade (alguns ml) da solução de proteína para determinar o pró<html> tein concentração e cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). </li></ol></li></ol></li><li> Proteína passo de acoplamento: <ol><li> Agregar as esferas activadas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga), e lava-se a pelota uma vez em 1 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Ressuspender o sedimento em solução de proteína preparada (por exemplo, 1 ml), para dar a concentração de proteína desejada. Nota: A concentração de proteína durante o passo de acoplamento vai depender da eficiência média de acoplamento (ver secção 2 para a determinação da eficiência de acoplamento) e densidade de acoplamento desejado (tal como calculados em 1.1.4.3). A eficácia é de cerca de 85% e a concentração final desejada em 5 mM de 10x a suspensão do grânulo, de modo que a concentração de proteína durante o passo de acoplamento deve ser de aproximadamente 6 mm. </li><li> Calcula-se a densidade de acoplamento utilizando a seguinte fórmula: jpg &quot;/&gt; onde ρ c densidade de acoplamento [número de moléculas de proteína / nm 2], proteína concentração de proteína conc [mg / ml], proteína M w peso molecular da proteína [Da], talão conc concentração talão [número de contas / L], diâmetro do grânulo d [nm 2] O número de Avogadro </li><li> Utilizar a densidade de acoplamento para o cálculo do espaçamento médio ligando: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Incubar a suspensão de proteína de grânulo durante 2 horas a 25 ° C numa roda rotativa. Nota: Algunsproteínas pode não ser estável à temperatura ambiente. Nestes casos, a reacção pode ser levada a cabo a 4 ° CO / N. </li><li> Desactivar restantes grupos activados sobre os grânulos por adição de estoque de cisteína até uma concentração final de 50 mM e incuba-se a suspensão durante 30 min a 25 ° C numa roda rotativa. Sedimentar as pérolas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga). </li><li> Manter o sobrenadante para a determinação da concentração de proteína e o cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com talão 1 ml de PBS e ressuspender em 1 ml de PBS fresco para dar o produto final. Nota: O protocolo acima irá tipicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a uma concentração final de proteína de 5 mm, o que pode ser usado como um estoque 10x para experiências subsequentes (ver secção 3). </li><li> Para prosseguir com a secção 3 do protocolo, trabalhar com 100 ml / ml de estoque de talão ou a uma concentração final de 500 nM de proteína. Nota: Um bom ponto de partida para este Procedure será de 2 × 10 12 contas / ml, resultando numa densidade média de acoplamento de 3 x 10 -4 proteínas / nm 2 ou um espaçamento médio de 57 nm sobre um grânulo de 2 mm de diâmetro. </li></ol></li></ol></li><li> Acoplamento direccional tiol-carboxi Nota: Este protocolo é adequado para o acoplamento de cisteína contendo proteínas para esferas de poliestireno funcionalizado-carboxilo. O radical carboxilo é primeiro activado usando 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxissuccinimida (NHS), e, em seguida, amina modificada reticulada usando Sulfo-SMPB (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Figura 2. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-carboxilo de proteínas com pérolas de polímero de poliestireno carboxilado. Grânulos são primeiro activado com EDC e modificadas com NHS para formar um semi-estável de NHS-éster. Subsequente amina-acoplamento de ethylenediResultados da amina num grupo amina livre, a qual reage com Sulfo-SMPB. Maleimida ativado grânulos podem então reagir com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de reagentes: <ol><li> Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li><li> Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS), de TCEP imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma 10x estoque (20 mM, ou 4 mg / ml em PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma 10x estoque (50 mM, ou 6 mg / ml em PBS) de NHS (N-hidroxissuccinimida) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente bntes de uso. </li></ol></li><li> Ativação Bead: <ol><li> Misture a suspensão do grânulo, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. </li><li> Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. </li><li> Adicionar 100 ml de 10x da EDC (2 mM de concentração final) e imediatamente 100 ml de solução de reserva 10x de NHS (5 mM de concentração final) para a suspensão do grânulo. </li><li> Incubar a suspensão de esferas durante 30 minutos a 25 ° C numa roda rotativa. </li><li> Lavar grânulos uma vez em 1 ml de PBS e ressuspender em 0,8 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Adicione 200 ml de etilenodiamina, e incUbate da suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. </li><li> Lavar grânulos uma vez com 1 ml de PBS e ressuspender as contas em 0,8 ml de PBS fresco. </li><li> Proceda da secção 1.1.2.4 (ativação talão com Sulfo-SMPB) conforme descrito no ponto 1.1.2 e siga o resto do protocolo descrito na secção 1.1 (acoplamento direcional Tiol-amina). Realizar a preparação de proteínas e acoplamento de proteínas passos de um modo idêntico ao descrito na secção 1.1. Nota: A eficiência de acoplamento típico usando este protocolo é ligeiramente inferior em comparação com a secção 1.1, portanto, ajustar a concentração de proteína inicial em conformidade para atingir a mesma densidade de acoplamento (75% aprox.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Determinação da eficiência de acoplamento Nota: Para determinar a concentração de proteína, utilizar Bradford Reagente 10 e ensaios colorimétricos como se segue: <ol><li> Inverta suavemente Reagente Bradford para e<html> Nsure homogeneidade do reagente. </li><li> Usando um ml de solução concentrada a 10 mg / BSA, preparar padrões de proteína cobrindo concentrações entre 0,1 e 1,5 mg / ml de BSA em tampão. </li><li> Adicionar 250 ml de reagente de Bradford para poços de uma placa de 96 poços. Prepare poços suficientes para todas as amostras, padrões de proteínas e controles negativos (apenas tampão). </li><li> Adicionar 5 ml de amostra de proteína (padrões proteicos ou tampão, para o controlo negativo) ao reagente na placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa num agitador orbital à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Medir a absorvância a 595 nm utilizando um leitor de placas. </li><li> Gerar uma curva padrão de concentração BSA contra A595 nm e usar isso para determinar concentrações de proteínas em amostras iniciais e sobrenadante. </li><li> Calcula-se a concentração de proteína acoplada como se segue: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Calcula-se a eficiência de acoplamento como: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Utilização de Bead-acoplado Adesinas em ensaios de competição <ol><li> Preparação: <ol><li> Semente de 1 ml por poço de células HeLa, a uma concentração de 150.000 células / ml numa placa de 24 poços um dia antes do ensaio de competição, para permitir que as células a atingir aproximadamente 80% de confluência, antes de se iniciar o experimento. </li><li> Configure cada condição experimental em triplicado. Incluir poços para controlos negativos (sem bactérias adicionados durante ensaios de competição), controlos positivos (esferas de controlo acoplados a fusão-tag só acrescentou durante ensaios de competição) e controles de lise (para experiências de citotoxicidade). </li><li> Inocular um LB (MLB) cultura de 5 ml marinho com uma nova colônia de V. parahaemolyticus e crescer O / N a 30 ° C, agitando. </li><li> Prepare suficiente MAM-coupled talão, como descrito na seção 1. (Coupling). Permitir para 100 ml de 10x estoque talão por poço. </li></ol></li><li> Ensaio de competição: <ol><li> No dia do competitexperimento de iões, medir a DO600 da cultura bacteriana. </li><li> Prepare meio de infecção por diluição de culturas bacterianas em meio DMEM incolor sem aditivos, pré-aquecido a 37 ° C, contendo 10% de suspensão v / v grânulo (ou pérolas ou grânulos de controlo acoplado a adesina), para se obter um MOI de 10. Preparar 1 mL / bem e 10-20% de excesso de volume por amostra. Nota: Para as condições acima mencionadas (placa de 24 poços, V. parahaemolyticus, MOI 10), o volume necessário de cultura D / N para ser adicionado por poço (ml / ml) é calculada como 3 / DO600 da cultura. Por exemplo, 1 ml de meio de infecção conterão tipicamente 100 ml de suspensão de esferas, com alguns ml de cultura bacteriana e ser formadas até 1 ml com incolor, DMEM sem suplementos. </li><li> Remover o meio velho dos poços e lavar as células HeLa em cultura através da adição de 1 ml de PBS estéril, pré-aquecido a 37 ° C a cada poço. </li><li> Remover PBS e adicionar 1 ml de meio de infecção por poço. Também configurar os controles, adicionando soluções containing esferas de controlo e bactérias (controlo positivo) ou grânulos de adesina e sem bactérias (controlos negativos), ou DMEM contendo 0,1% de Triton X-100 (controlo, só é necessária para as medições de citotoxicidade de lise). </li><li> Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante o período de tempo desejado (por exemplo, 4 horas para medições de citotoxicidade ou 1 h durante as medições de adesão). Nota: A aderência bacteriana e citotoxicidade em células hospedeiras podem ser utilizadas como limite de leitura para a eficácia da inibição. Se os pontos de tempo de citotoxicidade e de adesão medições coincidem, ambos os ensaios podem ser realizados utilizando amostras a partir do mesmo poço, uma vez que a citotoxicidade é determinada usando o sobrenadante da cultura e ensaios de ligação utilizar amostras derivadas a partir da camada de células remanescente. </li></ol></li><li> Medições Citotoxicidade: <ol><li> Nos pontos de tempo indicados (por exemplo, 4 horas após a infecção), remover três vezes 200 ml de cada um de 24 poços e a transferênciauma placa de 96 poços. </li><li> Rotação placas de 96 poços a 1500 xg, 5 min e de transferência de 100 ml de cada cavidade para uma nova placa de 96 poços. Adiciona-se 100 ml de meio utilizado durante as experiências de infecção para poços frescas da placa de 96 poços em triplicado (estes vão ser usados ​​como espaços em branco). </li><li> Levar a cabo o ensaio de desidrogenase (LDH), libertação de lactato, utilizando um kit de detecção da LDH citotoxicidade e seguindo as instruções do fabricante. <ol><li> Resumidamente, calcular a quantidade de reagente necessários em incrementos de 25 (por exemplo, se 62 amostras estão a ser medido, compõem mistura reagente suficiente para 75 etc.). </li><li> Por exemplo, por 100 amostras, misturar 11,25 ml de reagente A com 250 ul de reagente B. Inverter, não vortex para evitar a formação de espuma. </li><li> Coloque a mistura em um reservatório para ser capaz de pipetar com uma pipeta multi-canal. Adiciona-se 100 ul de mistura reagente a cada amostra. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente e ler a absorvância a 490 nm num leitor de placas a 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analisar o conjunto de dados para o qual a absorvância da amostra de controlo de lise é elevada, mas ainda dentro da gama linear do leitor de placas (geralmente, 2-3 unidades de absorvância). </li><li> Expresso de resultados como% de citotoxicidade, usando a seguinte fórmula de conversão: <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Medição de adesão bacteriana: <ol><li> Em pontos de tempo indicados (por exemplo, 1 hr de infecção pós), remova a mídia da camada de células. </li><li> Lave completamente a camada de células com estéril, PBS pré-aquecido (pelo menos 3-4 lavagens de 1 ml de PBS de cada) para remover quaisquer células un-ligado. </li><li> As células hospedeiras de Lise por adição de 1 ml de uma solução estéril a 1% v / v de Triton X-100 em PBS por poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar cada amostra cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 diluições em série de amostrasem PBS estéril (por exemplo, utilizar 100 ml de amostra e 900 ml de PBS). </li><li> Placa de 100 ml de cada amostra em agar MLB e espalhado utilizando um espalhador de célula. Otimizar que diluições ao prato dependendo das estirpes bacterianas e ponto de tempo. Nota: Para a montagem experimental descrita, 10 5 ou 10 6 diluições dar um número adequado de UFCs. </li><li> Incubar as placas a 37 ° CO / N e enumerar as bactérias por contagem de colónias. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descrevemos dois protocolos, que podem ser usados ​​para proteínas contendo tiol par de amine- ou esferas de poliestireno modificado por carboxilato de etilo, respectivamente. Devido à facilidade do processo, o acoplamento tiol-amina é preferível, mas dependendo da especificação grânulo desejado (diâmetro, propriedades de fluorescência), a utilização de grânulos funcionalizado com amina pode não ser possível e que têm, portanto, incluído um protocolo que vai converter o carboxilato - em um grupo amina para dar o pesquisador a maior flexibilidade possível na escolha de andaime. Embora ambos tiol-amina e tiol-carboxilo trabalho de acoplamento para qualquer cisteína contendo proteína, acoplamento direccional (por exemplo, a imobilização da proteína por seu N-terminal, que imita a exposição de superfície) requer uma proteína sem resíduos de cisteína, que é produzido como uma fusão de GST proteínas, ou que contém um resíduo de cisteína terminal único introduzido por mutagénese dirigida ao local. Se várias cisteínas reactivos estão contidosdentro da proteína, isto levará a imobilização aleatório que pode impedir a função da proteína. Muitos adesinas bacterianas não contêm cisteínas naturalmente. Para outros, estes podem ser removidos por mutagénese dirigida, embora isso exigiria ensaios extensivos para garantir que a estrutura e função nativa são retidos no mutante. Para as proteínas de fusão GST, GST-tag purificada acoplado a esferas pode ser utilizado como um controlo negativo adequado. Usando contas de desacoplados como um controle deve ser evitado, uma vez que estes muitas vezes têm uma maior tendência a se aglutinarem ou aderir a células não-especificamente. Uma versão simplificada do protocolo 1.2., Utilizando apenas EDC, pode ser utilizado para proteínas par de pérolas de polímero funcionalizado com carboxilo, no entanto, neste caso, o acoplamento ocorre através de aminas primárias na proteína e, portanto, não garante o acoplamento direccional. TCEP como um agente redutor não deve ser substituído por outros agentes de redução comercialmente disponíveis e vulgarmente utilizados, tais como dithiothreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol (BME), como os tióis contidos dentro delas irá competir com acoplamento de proteína no passo de acoplamento tiol-maleimida. PBS pode ser substituído com outros tampões, mas com as seguintes considerações: Os tampões não pode conter aminas primárias (SO-Tris contendo tampões não são adequados). O uso de tampões contendo concentrações de sal muito baixos (&lt;10 mm) leva a talão aglomeração e também devem ser evitados. A pureza da proteína é também um factor importante a considerar durante o procedimento, e para a obtenção de dados de elevada qualidade, as proteínas devem ser usados ​​puros. Rotineiramente purificar proteínas em vários passos, incluindo pelo menos um passo de purificação por afinidade e filtração em gel, mas em alguns casos, cromatografia de permuta iónica é realizada como um terceiro passo. Como resultado, a pureza das proteínas utilizadas para o acoplamento é geralmente de 90% ou superior, tal como avaliado por SDS-PAGE. Recomenda-se para determinar concentrações de proteína, tanto na mistura reaccional inicial, bem como de the sobrenadante após a conclusão da reacção. Isto irá ajudar a determinar a concentração de proteína acoplada aparente-grânulo, e assim a densidade de acoplamento. Determinação de ambos os valores também irá permitir o cálculo da eficiência de acoplamento. Esta pode ser tida em conta quando se prepara a solução de proteína inicial em reacções subsequentes, para obter a densidade e concentração de acoplamento final desejado. Bradford reagente é particularmente adequado para a determinação da concentração de proteína antes e após a reacção de acoplamento, uma vez que nenhuma das substâncias na reacção interfere com a formação de complexos de corante nas concentrações utilizadas. Se as concentrações de proteína inferiores são para ser usado, este método pode ter de ser substituído por um método de detecção mais sensível, porém, a atenção tem de ser pago para o facto de que tem que ser compatível com as substâncias contidas no interior da reacção de acoplamento. Também é recomendado usar reagentes recém-preparados e lidar com reagentes em pó com cuidado (por exemplo, lojasem um recipiente fechado e usá-grânulos de sílica, a fim de evitar os reagentes desenho humidade) desde a qualidade dos reagentes irão influenciar a eficiência de acoplamento. Se a eficiência de acoplamento é menor do que o esperado, possíveis soluções incluem o aumento da concentração inicial de contas e de proteína. Se estão a ser usadas concentrações mais elevadas, a concentração dos reagentes de acoplamento tem de ser aumentada proporcionalmente para garantir um excesso molar suficiente. Modificando concentrações talão / proteína é geralmente um melhor passo para a otimização em vez de aumentar os tempos de reação. Dado que os protocolos de acoplamento grânulo são longos, que vulgarmente se preparar um lote grande de material. Alíquotas da suspensão podem ser congeladas em azoto líquido e armazenado a -20 ° C durante vários meses. Descongeladas aliquotas não deve ser novamente congelada e deve ser mantida a 4 ° C e usadas dentro de 1-2 dias. No entanto, isto pode variar com a natureza e a estabilidade da proteína usada como deve ser testado em um pequeno lote inicialmente. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; adesinas Bead-acopladas podem ser usadas para muitas aplicações, tal como discutido abaixo. Este protocolo descrito um ensaio que é utilizada para medir a inibição da citotoxicidade mediada por ligação e agente patogénico em células hospedeiras. O ensaio é normalmente realizada para medir a capacidade de MAMs acoplado com pérolas para inibir competitivamente a infecção de células epiteliais HeLa com o marisco microrganismos patogénicos Vibrio parahaemolyticus, utilizando quer uma diminuição na fixação bacteriana às células hospedeiras ou reduzida citotoxicidade como uma leitura . Em ambos os casos, a preparação e ensaios de competição seguem o mesmo protocolo. Dependendo da leitura, diferentes estirpes de V. parahaemolyticus estão sendo usadas: a estirpe citotóxica POR1 é usado para as medições de citotoxicidade, ao passo que a estirpe não-citotóxica POR2 é usado para medir a adesão bacteriana, uma vez que a morte celular e destacamento celular compromete o procedimento para quantificar bactérias aderidas. Inicialmente, compeexperimentos foram concor- configurado como um protocolo de passo a passo, em que as células hospedeiras são primeiro pré-incubadas com os grânulos antes da adição de bactérias. Para V. parahaemolyticus e as especificações do talão (2 uM utilizados grânulos acoplados a MAM7), ambos os grânulos e as bactérias podem ser adicionados ao mesmo tempo, sem alterações na citotoxicidade resultante. Ou seja, neste sistema experimental, grânulos outcompete bactérias para a ligação da célula hospedeira. Dependendo da espécie bacteriana e talão geometria utilizada, pode haver boas razões para manter a adesão do grânulo e infecção bacteriana como dois passos separados. Por exemplo, para infectar as células com as bactérias não móveis, as placas são centrifugadas geralmente após a adição do meio de infecção. No entanto, a centrifugação das placas contendo suspensões talão deve ser evitado, uma vez que isto conduz a uma distribuição altamente irregular de pérolas sobre a camada de células. Se estão a ser utilizados tamanhos de partícula mais pequenos, grânulos levará mais tempo para resolver sobre a superfície da célula, no caso em que suficiente tempo deve ser permitida para fixação talão antes da infecção. Quando a aderência de bactérias é usado como um lido, as amostras devem ser tomadas em pontos de tempo em que as células hospedeiras não são significativamente danificados pela estirpe infectante, como descolamento celular e lise pode comprometer a quantificação de bactérias aderidas. Em vez de enumerar adesão bacteriana por diluição em placas, as amostras podem, alternativamente, ser processado para a imagem latente (Figura 5). Neste caso, as células de cultura de tecidos deve ser semeadas em lamelas de vidro, em vez de directamente em poços. Além disso, podem ser usadas pérolas fluorescentes e bactérias que expressam uma proteína fluorescente, juntamente com marcadores de células hospedeiras específicas da infecção. Por exemplo, experiências de competição são comumente fotografada usando vermelho fluorescente rodamina-faloidina para corar o citoesqueleto de actina das células hospedeiras e avaliar as alterações morfológicas resultantes de infecção, em conjunto com os grânulos azuis fluorescentes e fluorescenteverde (GFP expressando ou SYTO18 manchado) bactérias. Uma variedade de adesinas acoplado-grânulo, incluindo o Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 MID e Vibrio parahaemolyticus MAM, têm sido utilizados como materiais biomiméticos para estudar a adesão, a inibição da adesão e a contribuição de adesão ao mediada por patogénio citotoxicidade 1, 7, 8. Uma das vantagens da utilização desta abordagem é a facilidade de visualização de eventos de fixação, uma vez que as pérolas de polímero utilizadas como suportes estão disponíveis numa larga gama de cores (por exemplo, azul, vermelho fluorescente, azul, verde, laranja). Assim, a marcação directa de proteínas, a qual pode interferir com a função, pode ser evitada. Além disso, a superfície de acoplamento imita o visor multivalente de adesinas na superfície bacteriana, o que reflecte uma conformação mais fisiologicamente relevante em comparação com proteínas solúveis. Em comparação com estudos utilizando bactérias intactas ou bacterial mutantes, a abordagem grânulo contorna os problemas associados com o crescimento bacteriano. Por exemplo, a longo prazo (por exemplo, O / N) os estudos de adesão bacteriana às células hospedeiras utilizando bactérias intactas são frequentemente comprometida por fenómenos que acompanham o crescimento bacteriano - acidificação da depleção de meio de crescimento e nutrientes afectar negativamente células hospedeiras e replicação bacteriana, eventualmente, compromete qualidade de imagem. Mais recentemente, o uso de adesinas-coupled talão foi estendido para incluir o seu uso como ferramentas para purificações afinidade de acolhimento celular fatores envolvidos em processos a jusante de fixação bacteriana sinalização. V. parahaemolyticus MAM7, através da ligação a ácidos fosfatídicos na membrana da célula hospedeira, provoca a activação RhoA e actina rearranjos 1, 3. grânulos acoplado-MAM estão a ser usadas para purificar e identificar proteínas envolvidas nas plataformas de sinalização montados como uma consequência da célula MAM-hospedeiro obrigatório. Uma vez que os grânulos podefacilmente ser separados do sobrenadante por um passo de centrifugação curta, e a proteína de interesse é covalentemente acoplado, este é um bom método para conseguir a separação de proteínas contaminantes e enriquecer os complexos de proteína em causa, o qual pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a proteómica ou Western mata-borrão.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

O V. parahaemolyticus adesina MAM7 contém sete em tandem entrada de células de mamíferos (MCE) domínios envolvidos em reconhecimento de receptores de superfície de acolhimento. Utilizou-se esferas de poliestireno acoplado a recombinante, fragmentos purificados englobando tanto todos os domínios de sete em tandem (MCE MAM7) ou apenas o primeiro domínio de MCE (MAM1) para testar a capacidade destes materiais para competir com V. parahaemolyticus para ligação da célula hospedeira e a eficácia resultante destes materiais como inibidores da adesão. As células HeLa foram infectadas com V. parahaemolyticus estirpe POR1, e a citotoxicidade resultante da infecção in vitro foi avaliada após 4 horas (Figura 3). O tratamento de células HeLa com 0,1% de Triton X-100 (testemunha lise positiva) resultou em lise das células completas, células não infectadas apresentado níveis muito baixos de citotoxicidade. In vitro, a infecção de células não tratadas com POR1 resultou em níveis muito elevados de lise celular, e este foi inibida por co-MAM7upled grânulos mas não MAM1 acoplado ou grânulos de controlo acoplados à GST (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização de Vibrio parahaemolyticus citotoxicidade induzida em células epiteliais durante ensaios de competição. As células foram tratadas com V. parahaemolyticus (Vp), indicadas com (+), ou a presença de bactérias (-) na presença de diferentes entidades concorrentes (comp.), como indicado. Estes incluíram tanto no comp. (-), Grânulos (MAM7 MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST). Como controlos, as células foram tratadas com Triton X-100 (Triton, controlo de lise), ou para a esquerda não infectado (uninf). Liberação de LDH após 4 horas foi medida como descrito no capítulo 3, e os resultados normalizados para controles Triton (100%) e brancos (0%) como descrito acima. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Enumeração de V. parahaemolyticus ligado ou a células não tratadas ou células HeLa, incubadas com MAM7-, MAM1-, ou grânulos de controlo de GST, revelou que MAM7-grânulos, mas não MAM1- ou grânulos de controlo GST outcompete V. parahaemolyticus para ligação a receptores da superfície celular (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterização de fixação bacteriana durante experimentos de competição. Células Hela foram infectados com V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), na ausência (-) ou na presença de entidades competir como se segue: Grânulos MAM7 (MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST) (comp.). Adesão bacteriana foi medida após 1 hora, como<html> descrito na secção 3. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. Meios (FLTR em UFC / ml) são 2,3010 6, 5 1,5310, 2,0510 6, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Adesinas acoplados a gotas marcadas com fluoróforos resultar na geração de materiais que imitam a adesão bacteriana às células hospedeiras e são ferramentas poderosas para imagiologia celular (Figura 5). Usando contas azuis fluorescentes MAM7 acoplados, que caracterizou o processo de fixação MAM7 mediada para células epiteliais. A ligação de MAM7 a células hospedeiras que resultou na formação de actina e rearranjos de fibras de stress, que foram co-visualizada usando rodamina-faloidina para corar para F-actina (Figura 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Preparação e utilização de fluoróforo marcado grânulos biomiméticos para fins de imagem. (A) Suspensão de pérolas fluorescentes azuis biomiméticos (tubo direito, 10x estoque) e tampão de controlo (tubo de esquerda). (B) Penhora de contas de MAM7 acoplados a Hela células resulta em rearranjos de actina e formação de fibras de stress. Penhora de contas azuis fluorescentes e resultante de estresse actina fibras (vermelho, manchado com rodamina-faloidina) foram fotografadas por microscopia. Bar, a 10 uM. Imagens no painel B foram adaptados de Lim et al. 1 e reproduzida sob a licença Creative Commons Attribution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K visualizações.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Imunologia e Infecção

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...