Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento do Institut Pasteur e por doações da Ligue nationale contre le Cancer (subvenções R05/75-129 e RS07/75-75), a Association pour la Recherche sur le Cancer (subvenções ARC A09 / 1/5031 e 4867), e da Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e 026 01 ANR09 MIEN). MM era beneficiário de uma bolsa MENRT.

1. Levedura Screenings dois híbridos <ol><li> Faça as seguintes soluções necessárias: <ol><li> Completa Fora gota sintético (SD): Dissolver 26,7 g de base de DP mínimo com glucose em 1 L de água. Adicionam-se 2 g de uma mistura de aminoácidos preparada como se segue: 2 g de hemi-sulfato de adenina, 2 g de arginina HCl, 2 g de histidina HCl, 2 g de isoleucina, leucina 4 g, 2 g de Lisina, 2 g de Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptofano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina. </li><li> Gota seletiva Out SD-L/-W/-H: SD contendo todos os aminoácidos essenciais, exceto os especificados (-L:-Leucina;-W:-Triptofano;-H:-histidina). </li><li> YPGLU: para 1 L, em peso, 10 g de extracto de levedura, 10 g de Bacto-peptona e 20 g de glicose. Completo com 25 g Bacto ágar para meio sólido. </li><li> YCM: Igual ao YPGLU, mas o pH ajustado para 4,5. </li></ol></li><li> Acasalamento e espalhando <ol><li> Use aliquotas congeladas de pré-transformed estirpe de levedura Y187 (tipo acasalamento α), contendo uma biblioteca de cDNA clonado em pACT2. Verificar a viabilidade celular por plaqueamento de diluições em série em placas de SD-G. </li><li> Clonar o ORF patógeno em pGBKT7 vetor, e transformar o plasmídeo recombinante usando um procedimento padrão em AH109 cepa de levedura (um tipo de acasalamento). </li><li> Espalhe pGBKT7 transformada AH109 fermento em placas SD-W. Incubar pelo menos dois dias de 30 ° C num incubador humidificado. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C até que o rastreio de dois híbridos. </li><li> Utilização de 3-aminotriazole (3-AT), um inibidor competitivo da enzima HIS3, para contrariar o potencial de auto-transactivação do gene repórter HIS3 de proteínas dos agentes patogénicos. Realizar um teste de auto-activação através da determinação da concentração de 3-AT, que impede o crescimento de levedura pGBKT7-transformado em placas SD-W/-H. </li><li> Semente 30 ml de SD-W com poucas colônias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C com rotação. </li><li> Sementes 200 ml de SD-W com o 30 mlAH109 das culturas. Incubar, com rotação a cerca de 20 horas a 30 ° C. </li><li> Incubar descongeladas biblioteca de cDNA-Y187 transformada em 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C com rotação. </li><li> Centrifugar um volume de pGBKT7-AH109 cultura transformada correspondente a uma quantidade equivalente de células de levedura Y187 viáveis ​​durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de YPGLU. </li><li> Misture o sedimento de levedura AH109 com Y187 contendo biblioteca. Transferir num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 3500 rpm a 20 ° C, o sobrenadante cuidadosamente retirada (pelete frágil). </li><li> Ressuspender o sedimento em YPGLU para obter um total de 1,5 ml. </li><li> Espalhe fermento para 3 YCM-Agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C. </li><li> Recolha de levedura acoplado YCM de placas por raspagem com um rodo de vidro em 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar as placas duas vezes com 5 ml de meio e SD-L/-W/-H piscina. </li><li> Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de levedura em 5 ml de meio SD-L/-W/-H. </li><li> Espalhe levedura acoplado em placas de 10 (0,5 ml / placa) de SD-L/-W/-H Agar suplementado com a concentração apropriada de 3-aminotriazole (3-AT), determinada no teste de auto-activação. Incubar a 30 ° C numa atmosfera húmida durante 6-10 dias. </li><li> Determinar a taxa diplóide (2n), a fim de avaliar a eficiência de acoplamento por difusão 250 ul de diluições em série (10 -4 a 10 -6) da suspensão de levedura acoplado em placas SD-L/-W. Incubar as placas a 30 ° C durante dois dias. Contagem das colónias cultivadas em SD-L/-W, e deduzir o número total diplóide presente no volume inicial de levedura acoplado. Denunciar este número diplóide para viável número levedura biblioteca contendo para calcular a taxa diplóide. Ele deve variar de cerca de 10-25%. </li><li> 6-10 dias após incubação a 30 ° C, escolher colônias de leveduras acasaladas em SD-L/-W/-H fresco + 3-AT placas. [Dica: para o fermento em um esquema de 8pistas de 12 cavidades que reproduzem uma placa de 96 poços de modo que será mais fácil depois para sequenciação]. Deixe colónias de levedura crescer durante 4-5 dias a 30 ° C numa atmosfera húmida. </li></ol></li><li> Triagem de His3 clones positivos por PCR e seqüenciamento O objectivo é o de amplificar por PCR a ORF contida nos vectores pACT2 de colónias de leveduras cultivadas em placas SD-L/-H/-W selectivos. <ol><li> Colocar uma placa de 96 poços de PCR em gelo. </li><li> Para lisar as células de levedura, adicionar 50 ul por poço de uma solução Zymolase 20T (2,5 mg / ml em 10 mM de Hepes pH 7,7). </li><li> Delicadamente ressuspender uma colônia por poço. </li><li> Incubar 15 min a 37 ° C e 15 min a 95 ° C. </li><li> Colocar a placa de volta em gelo. Adicionar 50 ul de água destilada por poço. Misture bem por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3.500 rpm e 4 ° C. </li><li> Amplificar por PCR de 10 jil para detectar uma inserção utilizando iniciadores de recozimento ambos os lados da ORF derivados de ADNc em vectores de pACT2. O protocolo é gada para a amplificação de 96 colónias de leveduras lisadas com a polimerase de ExTaq. Preparar a seguinte mistura: 525 ul de tampão 10X ExTaq, 420 ul da mistura de dNTPs (2,5 mM), 10,5 ul de iniciador directo (1 ug / ul), 10,5 ul de iniciador reverso (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) e 3202,5 ​​ul de H 2 0. Distribuir 40 ul da mistura por poço numa placa de PCR de 96. Adicionar 10 ul de levedura lisada por poço. Realizar a amplificação como se segue: 94 ° C durante 3 min, depois 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, e no final com 72 ° C durante 7 min. Executar 3 ul dos produtos de PCR num gel de agarose a 1,2% para detectar clones de PCR-positivas. Note que a utilização de pré-molde de 96 cavidades de géis de agarose é recomendada. [Dica: placa pode ser armazenada a -20 ° C durante alguns meses e reutilizada para nova PCR] </li><li> Sequência os fragmentos amplificados de PCR a partir de isolados HIS3 clones positivos. Faça uma análise BLAST para identificar celular ORF. Alinhamentos de baixa confiança (E &amp; valorgt, 10 -10, identidade &lt;80%, o comprimento de péptidos &lt;20 aminoácidos) são eliminados, bem como frameshifted e codão de paragem prematuro contendo sequências. </li></ol></li></ol> 2. Edifício Matriz para HT-GPCA HT-GPCA é um ensaio à base de células de mamífero em que ambas as proteínas de agentes patogénicos e de acolhimento são transitoriamente expressa fundida com fragmentos complementares da divisão Gaussia princeps luciferase. Após a interacção dos parceiros, esta enzima é reconstituído permitindo a medida da sua actividade enzimática. A intensidade da interacção é assim deduzido a partir de uma Proporção Normalizada luminescência (ver abaixo e na Figura 1) <ol start="4"><li> Selecção de parceiros celulares hospedeiras <ol><li> Escolha proteínas que são identificados mais de três vezes nos rastreios Y2H para validação adicional em células de mamíferos para aumentar a confiança do conjunto de dados 9. </li><li> Adicionar conhecidos parceiros que interagem com as proteínas do patógeno como positive controlos. </li></ol></li><li> Transferência em vetores compatíveis HT-GPCA <ol><li> Clone cada proteína patógeno ORF num vector pSPICA-N2 para gerar proteínas de agentes patogénicos com aminoácidos 110-185 dos princeps Gaussia humanizados luciferase fundidos os seus N-terminus (fusões de proteínas GL2-agente patogénico). </li><li> PCR amplificar o ORF da proteína celular directamente a partir dos clones positivos Y2H ou de outros recursos ORF (ORFeome Humano <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) e transferi-los em vectores pSPICA-N1 para gerar proteínas fundidas no terminal N com os aminoácidos 18-109 da humanizado Gaussia princeps luciferase (fusões de proteínas GL1-anfitrião). [Dica: Para a clonagem em larga escala, o sistema de clonagem Gateway é recomendado. Nesse caso, para a amplificação por PCR, utilizar iniciadores concebidos para conter locais compatíveis gateway]. </li><li> Sequência de todos os vetores de expressão. Seqüências do pSPICA-N1 e N2-pSPICApode ser encontrado na referência 8. </li></ol></li></ol> Note-se que construções de plasmídeos pode ser invertida, ou seja, proteínas patógenos em pSPICA-N1 e proteína do hospedeiro em pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps luciferase à base de proteínas Ensaio de Complementação (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Transfecção celular <ol><li> Semente células 293T de 350.000 células / mL de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem nenhum antibiótico. Distribuir 100 ^ l / poço em placas de cultura estéreis branco. Não exceder 10 placas em um único experimento. Deixe as células crescer durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. [Dica:. PSPICA Uma vez que os plasmídeos contêm uma origem de SV40, o uso de células 293T permite a sua replicação em células transfectadas e, portanto, conduz a sobre-expressão de dois fragmentos de luciferase] </li><li> No dia seguinte, as células transfecção usando qualquer protocolo de transfecção adequado. Note-se que para certos reagentes de transfecção, o number de células semeadas pode ter de ser adaptado. Utilização de 100 ng por poço de ambas hospedeiro do agente patogénico e ORF construções de plasmídeos. A co-transfecção de 10 ng por poço de um de CMV-luciferase do pirilampo plasmídeo para normalizar para a eficiência de transfecção. Cada ponto é testado em triplicata. [Dica:. Misturas de ADN pode ser realizada um dia antes da transfecção e armazenadas a -20 ° C, com vedantes adesivas] </li><li> Transferir a mistura de transfecção das placas de cultura de células 293T. Ter cuidado para depositar suavemente a mistura de ADN para as células, como 293T não são fortemente aderente e facilmente separar a partir do fundo do poço. Incubar numa incubadora de cultura de células 24-30 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> A lise celular e Gaussia luciferase dosagem <ol><li> Lavar as células com PBS (100 ul / poço). Adicionar 40 de tampão de lise 1X Renilla ul. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, sob agitação. </li><li> Economize 10 ml de lisados ​​celulares em outra plataforma brancoe para posterior dosagem da atividade da luciferase Firefly. Armazenar a 4 ° C ou, alternativamente, à temperatura de -20 ° C, com vedação. </li><li> Medir a actividade Gaussia nos restantes 30 ul de lisados ​​de células por adição de 100 ul de reagente de ensaio de luciferase de Renilla e contando luminescência durante 10 segundos com um luminómetro. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. Realizar medição com extratos de células frescas desde estocagem ou a longo prazo pode afetar a atividade Gaussia interação mediada. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Mensuração da atividade Firefly <ol><li> Medir a actividade Firefly no salvo 10 ul de lisados ​​de células por adição de 50 uL de reagente de ensaio de luciferase do vaga-lume e contando luminescência durante 10 seg. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. [Dica: A dosagem de luciferase de pirilampo podem ser realizadas no dia seguinte em lisados ​​congelados.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> Cálculos NLR <ol><li&gt; Para cada interacção, calcular a relação entre Gaussia actividade de luciferase e a actividade da luciferase do vaga-lume para obter um valor normalizado luminescência Gaussia tendo em conta a eficiência de transfecção e da viabilidade celular. Calcule a média dos triplicados. </li><li> Para monitorar a interação, estimar uma relação de luminescência Normalizada (NLR) para cada par patógeno-hospedeiro. Para isso, divide a actividade normalizada Gaussia luminescência detectada na presença de ambos, do patógeno e proteínas do hospedeiro pela soma das actividades medidas nos poços de controlo (Figura 1 adaptada de referência 8). O NLR valor de corte para interações positivas foi estimado em cerca de 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> A análise dos dados <ol><li> Realizar agrupamento hierárquico utilizando o pacote estatístico R. Em primeiro lugar, agrupar os dados em categorias NLR, em seguida, calcular um dendrograma interação utilizando o método de ligação completa. Visualize estedendrograma com JavaTreeView 10. Calcular a distância entre dendrograma interação e árvore filogenética usando um coeficiente de correlação de Pearson. </li><li> Para gerar redes de interação, selecione as interações positivas do conjunto de dados HT-GPCA e usar o software Cytoscape 1. Extraia os graus das proteínas do hospedeiro e traçar a sua distribuição para acessar as dinâmicas locais de rede. Redes Host-patógenos pode ser sobreposto ao interactome host para fornecer uma avaliação do impacto global das proteínas do patógeno na rede de celular do hospedeiro. </li><li> Extraia o GO (Gene Ontology) termos associados aos fatores celulares específicos com o banco de dados DAVID bioinformática 12 para avaliar o enriquecimento funcional do conjunto de dados. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Independentemente, o fermento e dois ensaios de interação híbridos e mamíferos, como GST pull-down, lumier ou MAPPIT, provaram ser ferramentas eficazes para detectar interações proteína-proteína, mas são limitados pela alta taxa de falso-positivos e falso-negativos interacções associadas com estas técnicas 15. Além disso, a evidência crescente de que a combinação de métodos ortogonais aumenta a confiabilidade do conjunto de dados de interação obtidas 7. O desenvolvimento recente ...

O aumento da quantidade de dados coletados para gerar mapas de interação proteína-proteína abre perspectivas para entender melhor as infecções do patógeno. A compreensão global das infecções de agentes patogénicos começa a surgir, proporciona acesso à gama de perturbações induzidas por proteínas de agentes patogénicos ao ligar o proteoma humano 1. É, assim, oferece uma maneira de compreender como patógenos manipular a maquinaria da célula hospedeira. Em particular, o mapeamento de várias redes de interacção hospedeiro-viral revelou que as proteínas virais como alvo proteínas do hospedeiro, preferencialmente, que são altamente ligados em rede celular (cubos), ou que são o centro de muitos caminhos na rede (proteínas estrangulamentos) 2-4. Essas interações permitem que os vírus para manipular processos celulares importantes, o que é fundamental para reproduzir e produzir descendência infeccioso. Comparada interações mapeamento foram recentemente realizados sobre vírus relacionados com o objetivo de extrair informações relativas àpatogénese 4. Além disso, estudos do host patógenos interações paisagem foram estendidos para muitos patógenos 5. A identificação de fatores de célula alvo fornece insights sobre as estratégias utilizadas pelos patógenos para infectar as células e permite a detecção de marcadores potenciais patogênicos. O sistema de dois híbridos de levedura é o método mais popular para identificar interacções binários desde rastreio genético é uma ferramenta eficiente e sensível para o mapeamento de alto rendimento de interacções proteína-proteína. A abordagem aqui proposta melhora ainda mais a exames Y2H individuais, avaliando uma proteína de patógenos múltiplas variantes de tensão, proporcionando assim o acesso a uma visão comparativa das interações proteína-proteína patógeno-hospedeiro. Além disso, a maior limitação do rastreio de levedura de dois híbridos reside numa elevada taxa de falsos negativos, uma vez que se recupera cerca de 20% do total das interacções 6. Isto implica que as interacções detectados com apenas um subconjunto dos agentes patogénicosgens variantes podem ter escapado à detecção com os outros. Portanto, parceiros individuais emergentes de todos os exames de dois híbridos são mais desafiados para a interação com a gama completa de cepas estudadas, fornecendo conjuntos de dados de interação comparativos. Uma vez que foi demonstrado que a combinação de diferentes metodologias aumenta fortemente a robustez da interacção proteína-proteína conjuntos de dados 7, esta validação é realizada em células de mamíferos por um ensaio de complementação da proteína-fragmento recentemente desenvolvido chamado HT-GPCA 8. Este sistema baseado em células permite a detecção de interacções proteicas por complementação da Gaussia princeps dividir luciferase e foi concebido para ser compatível com um formato de alto rendimento. Graças à sua tecnologia baseada em luminescência e seu baixo ruído de fundo em comparação com outro ensaio baseado em fluorescência, HT-GPCA mostra uma impressionante alta sensibilidade. No geral, esta abordagem constitui uma eficienteferramenta para gerar um mapeamento abrangente de interplays patógeno-hospedeiro, o que representa o primeiro passo em direção a uma compreensão global da célula hospedeira seqüestro.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Esforços significativos foram reunidos para gerar mapas de rede de interação grande escala global proteína-proteína. Isso é fundamental para compreender as relações patógeno-hospedeiro e foi essencialmente realizado por exames genéticos em leveduras sistemas de dois híbridos. A recente melhoria da detecção de interação proteína-proteína por um ensaio de complementação fragmento baseado luciferase Gaussia agora oferece a oportunidade de desenvolver abordagens integradoras interactomic comparativas necessárias para comparar rigorosamente perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de deformação do patógeno contra um conjunto comum de fatores celulares. Este trabalho concentra-se especificamente sobre a utilidade de combinar dois métodos ortogonais para gerar conjuntos de dados de interação proteína-proteína: levedura de dois híbridos (Y2H) e um novo ensaio, Gaussia princeps ensaio complementação proteína de alto rendimento (HT-GPCA), realizado em células de mamíferos. nt &quot;&gt; A identificação em larga escala de parceiros celulares de uma proteína patógeno é realizada por meio de cruzamentos de levedura baseado em rastreios de dois híbridos de bibliotecas de cDNA, utilizando múltiplas variantes de deformação do patógeno. Um subconjunto de parceiros que interagem seleccionados numa pontuação maior confiança estatística é maior validado em células de mamíferos para interações de pares com todo o conjunto de proteínas variantes do patógeno usando HT-GPCA. Esta combinação de dois métodos complementares melhora a robustez do conjunto de dados de interação, e permite a realização de uma análise comparativa interação rigoroso. Tais interactomics comparativos constituem uma estratégia confiável e poderoso para decifrar qualquer interplays patógeno-hospedeiro.

Uma grande força de HT-GPCA reside na sua elevada sensibilidade, tal como ilustrado pela avaliação das taxas de falsos positivos e falsos negativos para a proteína E2 de HPV na Figura 2 (adaptado da referência 13). Para determinar a taxa de falsos negativos, interacções conhecidas de E2 de HPV16 foram avaliadas por HT-GPCA (Figura 2A). Quatro dos 18 interacções não foram recuperados (correspondente a uma taxa de falsos negativos de 22%). As interacções de falsos positivos fo...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K visualizações.  Institut Pasteur. Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Imunologia e Infecção

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...