Name: tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Nota: Este protocolo contém instruções sobre como usar uma coluna de PSF em um sistema de HPLC associada a múltiplos detectores para detecção multiplexada. O protocolo foi escrito assumindo que o leitor tenha conhecimentos básicos e experiência em cromatografia e vários métodos de detecção de HPLC. Atenção: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados). 1. Configuração de Instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com água ultrapura (por exemplo, 100% de água Milli-Q) para Line A e 100% de metanol para a linha B como fase móvel e limpar as bombas como por exigência fabricante. Se um dos detectores utilizados é o MS, como é aqui, adicionar ácido fórmico a 0,1% para ambas as fases móveis A e B. </li><li> Defina-se a HPLC componentes instrumentais e detectores, como ilustrado na Figura 2. Isto exige a colocação conveniente dos detectores em relação à coluna de modo a minimizar o volume morto entre o detector e a coluna. A flexibilidade na configuração do sistema de HPLC é desejável. </li></ol> 2. Configuração de UV-Vis e detectores MS <ol><li> Definir o detector de UV-Vis ao comprimento de onda desejado depende da amostra de interesse (por exemplo, 280 nm). </li><li> Defina o detector MS no modo positivo para Contagem Total Ion (TIC) a análise utilizando o método de detecção Full Scan. Também ajustar os seguintes parâmetros: temperatura MS consequentemente vaporizador 500 ° C, temperatura de capilar 350 ° C, gás bainha fixada a uma taxa de 60 unidades, o fluxo de gás auxiliar40 e varrer o fluxo de gás em 5 unidades, e tensão de 3,5 kV de pulverização. Essas configurações podem ser ajustadas mais tarde para os requisitos específicos de usuários dependentes da amostra a ser analisada. </li></ol> 3. Preparação de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil radical (DPPH •) Reagente de configuração de DPPH • Sistema Detector <ol><li> Pesar 25 mg de DPPH • e dissolve-se em 250 ml de metanol num balão volumétrico. </li><li> Adicionar 250 ul de ácido fórmico ao DPPH • reagente. Tapar o frasco em folha para evitar a exposição à luz. </li><li> Sonicar o balão contendo o DPPH • reagente durante 10 min. </li><li> Purga-se o DPPH • bomba com o preparado DPPH • reagente conforme a necessidade do fabricante. </li><li> Configurar o DPPH • sistema de acordo com a Figura 2, anexando a linha da bomba para a entrada de uma peça em T. </li><li> Anexar uma bobina de 100 ul reação ao the de saída da peça em T e prender a outra extremidade da bobina de reacção para o detector. </li><li> Envolvem o bobina de reacção em um aquecedor de coluna e definir a temperatura do aquecedor de coluna a 60 ° C. </li><li> Defina o DPPH • UV-Vis detector para 520 nm. </li></ol> 4. Configuração do PSF Coluna <ol><li> Ligue a entrada da coluna de PSF para o instrumento de HPLC. </li><li> Ligue a porta central para o detector de MS, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar um porta periférica para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar uma outra porta periférica para a peça em T do DPPH • sistema de detecção utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Bloquear a porta periférica livre utilizando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC de 1 ml min -1 a 100% da linha B - 100% de metanol (ácido fórmico a 0,1%). </li><li> Equilibrar a coluna com metanol a 100% móvel pHase por 20 min para uma coluna de comprimento x 250 mm 4,6 milímetros id. Desta vez é dimensionada de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol> 5. Ajustando o Coluna PSF para detecção multiplexada <ol><li> Medir a massa de, pelo menos, dois recipientes de recolha vazios (um para a porta ligada ao detector de UV-Vis e um para o detector de DPPH •) utilizando uma balança analítica. </li><li> Recolha fase móvel a partir do UV-Vis e os DPPH • Portas em dois recipientes separados, pré-pesados ​​de recolha (5.1). Grave o período de tempo para a coleção. Recolher pelo menos 500 mg de solvente em cada navio. </li><li> Pesar os vasos de recolha e determinar a massa da fase móvel. Dada a densidade de 0,791 g de metanol é mL -1, determinar o volume de fase móvel recolhidos a partir de cada porta. </li><li> Por diferença, isto é, taxa de fluxo conjunto bomba nominal menos a taxa de fluxo através do DPPH • e UV-Vis Detectoportas de fluxo r, determinação da velocidade de fluxo para o detector de MS. Expresse cada proporção de fluxo como uma percentagem do fluxo total. Nota: Idealmente, as percentagens de fluxo são: para a MS é de 18% do caudal total, ao UV-Vis 22%, para o DPPH • detector de 60%. </li><li> Se não, ajustar as percentagens de fluxo, alterando a pressão de retorno no detector de UV-Vis. Por exemplo, se o fluxo para o UV-Vis é demasiado alta, diminuir a proporção de adição de adicionar uma secção de 15 cm de tubagem de 0,13 mm id para a saída do detector de UV-Vis. Em seguida, repita os passos 5.1 a 5.5. </li></ol> 6. Condições configuração final <ol><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de DPPH • reagente para a mesma taxa de fluxo que sai da porta de saída ligada ao DPPH • detector. Nota: A coluna PSF multiplexado com UV-Vis, DPPH • e MS está pronto para análise. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este estudo envolve a caracterização e definição de perfis de café utilizando HPLC com detecção multiplexada empregando uma coluna paralela fluxo segmentado (PSF). Multiplexada HPLC utilizando colunas PSF permite a caracterização e identificação de entidades químicas chave reduzindo a complexidade de dados da amostra, enquanto a obtenção de um maior grau de informações específicas da molécula dentro de uma fracção do tempo que leva a utilização de processos de detecção de múltiplos convencionais...

Colunas Fluxo de Tecnologia ativos Tecnologia de fluxo Ativa (AFT) colunas de cromatografia foram recentemente desenvolvidas para superar a ineficiência nas separações associados a heterogeneidade de fluxo de 1-6 e também para permitir a detecção multiplexada. Nesse particular detalhe comunicação que o processo operacional do paralelo segmentado coluna de fluxo (PSF), com detecção multiplexada. As vantagens funcionais da coluna PSF são: (1) o fluxo a partir da região central radial do leito da coluna é isolado a partir da região periférica ou parede de fluxo, (2) o volume de fase móvel que devem ser processados ​​por uma detecção fonte é reduzida e as fontes (3) detecção podem ser multiplexados para expandir a informação da amostra sem atrasos de detecção de incutir em cada processo de detecção, ou posteriormente, necessitando a divisão de um fluxo de fluxo pós-coluna 7,8. A característica essencial no desenho da coluna PSF que permite que o umdvantage de detecção é a saída multiplexada acessório de montagem e frita de novo. A Figura 1 é uma fotografia da coluna AFT comparada com uma coluna convencional. É importante compreender que o processo de separação obtido utilizando colunas de fluxo paralelas segmentado não é o mesmo que o fluxo de fluxo pós-coluna de divisão. Em uma corrente de fluxo pós-coluna dividir toda a banda de amostra a partir da borda para as extremidades da cauda é igualmente incluídos na amostra (isto é, axialmente), desse modo, cada corrente de escoamento é igual no que respeita à eficiência e sensibilidade; a magnitude da sensibilidade, assim, ser divididos pelas divisões numéricas. Em PSF, no entanto, as amostras do processo de divisão da banda radialmente, não axialmente. Como tal, as amostras de portas centrais vértice do pico - a região mais concentrada do pico. Assim, a sensibilidade mais elevada aqui é como o pico não é diluída pela região da cauda difusa. A amostra eluindo a partir das portas periféricas não é tão eficiente como no CentraL zona, mas, uma vez que a banda é amostrado radialmente, ao invés de axial, a largura do pico é mais estreito do que seria o caso para um processo de amostragem que divide o pico na direcção axial, isto é, uma separação pós-coluna. Por conseguinte, a sensibilidade do detector com uma concentração dependente não é reduzida. Na coluna PSF, o acessório de saída compreende várias portas de saída e no interior desta extremidade encaixe ali está alojado um filtro poroso anelar. A porção interior de canais de frita anulares esta fluir para fora da coluna através da porta de saída central radial, enquanto que a porção radial exterior dos canais de tomada de frita de fluir para fora da coluna através das portas de fluxo de saída periférica ou zona da parede. As porções interior e exterior da frita de saída são separadas por uma barreira impermeável que impede o escoamento transversal entre estas regiões de fluxo 2. Como consequência desta concepção da corrente central de fluxo radial através do leito da coluna está separado do fluxo de parede ins regiãoide a coluna. A parte relativa de fluxo a partir destas duas regiões pode ser variado para se quase qualquer proporção desejada através de uma gestão de pressão, a fim de optimizar vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Em essência, este projeto estabelece de forma eficaz dentro da grande coluna de formato de uma coluna de &#39;virtual&#39;, com um diâmetro interno estreito, e, portanto, as funções de coluna como uma coluna na parede menos verdadeiro, superando coluna de leito heterogeneidade e os efeitos de parede 9,10. Os principais benefícios do colunas PSF são melhorias na eficiência da coluna, a minimização do solvente de processamento para a detecção de fonte (s) e permite a detecção multiplexado. No entanto, uma vantagem é que uma vez que a cauda e as regiões de frente de qualquer banda são removidos a partir do perfil de eluição geral na eluição do soluto ou detecção está presente em uma concentração mais elevada do que de outro modo seriam observados para os mesmos solute injecção e a concentração de carga em uma coluna convencional, dependendo da relação de segmentação empregue. Como consequência, é muitas vezes observado um ganho na intensidade do sinal para separações conduzidas em colunas 2 PSF. Na verdade, se o rácio de segmentação é ajustada de tal modo que 25% das saídas de fluxo de cada uma das quatro aberturas de saída, a intensidade do sinal que é observada usando violeta (UV) de detecção ultra mostra praticamente a mesma intensidade de sinal exacto como aparente, utilizando uma convencional coluna onde a totalidade (100%) da fase móvel é analisada 7. Além disso, o ajuste fino da relação de saída de fluxo entre as regiões central e parede permite que a eficiência da coluna para ser optimizado. Os ganhos de eficiência da coluna observada usando colunas AFT não pode ser indicado como um único valor, uma vez que estes ganhos de eficiência são uma função de três factores: (1) a taxa de fluxo, (2) a relação de segmentação, e (3) o factor de retenção de soluto . No entanto, os ganhos de eficiência em comparação com conventional colunas são quase sempre observada, e por vezes, esses ganhos são mais do que 100% do número de pratos teóricos 1,2. A capacidade de ajustar o rácio de segmentação permite que o analista para adaptar efectivamente o diâmetro da coluna &quot;virtual&quot;, e este é um factor importante no que diz respeito ao processo de detecção. Por exemplo, uma coluna virtual de 2.1 mm de diâmetro interno (ID) é estabelecida a partir de uma coluna ID de 4.6 mm quando a relação física segmentação é de 21% de fase móvel eluindo a partir do orifício de saída central radial. Sob estas condições, a coluna id Virtual 2.1 mm realiza com uma eficiência que podem ser mais do que 70% maior do que a coluna convencional ID de 2.1 mm, dependendo da taxa de fluxo, e factor de retenção de soluto 10. O design de coluna PSF corrente que é utilizado para a detecção multiplexado incorpora uma porta de saída de 4-montagem, mas a coluna pode ser equipado com uma porta 2-Também-encaixe final, no entanto, esta limita a detecção tO apenas dois detectores. A operação básica destas colunas é, no entanto, o mesmo, excepto que os quatro detectores podem ser acopladas simultaneamente à saída da coluna PSF 4-porta alargar o âmbito de detecção multiplexado. Além da coluna de tubos conjuntivo pré e pós, os únicos requisitos adicionais para operar uma coluna PSF é tubos que podem ser ligados às portas de saída periférica, e um meio pelo qual a quantidade de fase móvel passa através de cada tubo pode ser medido, costuma ser uma medição de massa ou uma medição volumétrica. Para facilidade de ajuste, o diâmetro interno de toda a tubagem de fluxo de saída deve ser o mesmo. A razão de fluxo entre as aberturas de saída centrais periféricas e radiais é então variado através da utilização de gestão de pressão, simplesmente por alteração do comprimento do tubo localizado na saída periférica encaixe, ou o comprimento de pós tubo detector do orifício de saída central radial. Detecção multiplexado Usando colunas do PSF </strong&gt; Uma vantagem importante das colunas PSF é que cada uma das aberturas de saída de saída pode ser ligado directamente a uma fonte de detecção, permitindo assim a detecção multiplexado. Em um sistema de detecção bem concebido com uma única análise de detecção multiplexada pode proporcionar informação substancial no que diz respeito à natureza dos componentes no interior da amostra. Importante, ensaios destrutivos e não destrutivos podem ser conduzidas exactamente ao mesmo tempo, sem atraso de detecção. Isto permite a atribuição absoluta de, por exemplo, anti-oxidantes, utilizando DPPH • reagente, com componentes para eluir observado com UV e / ou espectrometria de massa (MS) de detecção de respostas de 7,11. Portanto, quatro detectores independentes pode ser operado simultaneamente com porções adequadas de fluxo dirigido para cada detector através de qualquer uma das quatro portas de saída. Uma vez que o fluxo através destas portas pode ser facilmente ajustado a quantidade de soluto, atingindo qualquer dos detectores pode ser ajustado para se adequara sensibilidade do detector dada fonte. Deve notar-se, no entanto, que a migração de soluto mais eficiente é observado através da porta de saída central radial. Cada uma das portas periféricos oferecem eficiência de separação equivalente, o qual quando ajustado para 25% através de cada porta, é apenas ligeiramente menos eficaz do que uma coluna convencional. Como tal, é importante que o detector quantitativa ser configurado para analisar amostras a partir da porta de saída central radial. Ao definir-se uma coluna de PSF para a finalidade de detecção de multiplexação há uma série de considerações que necessitam ser feitas para alcançar resultados eficazes e de alta qualidade; que é dimensões de tubos para cada porta, escolha de qual porta para um tipo de detector e de regulação do fluxo. Dimensões do tubo para cada porta Na cromatografia a extensão de tubagem pós coluna desempenha um papel crucial na eficiência e o desempenho da separação. Dea Granded-volume como resultado da tubagem ID comprida ou larga de saída da coluna para detector irá resultar numa perda de eficiência, sensibilidade e resolução. Assim, as dimensões tubulação apropriada deve ser utilizado quando a configuração da coluna PSF para atingir o potencial máximo na prestação de separação eficiente e proporcionar os benefícios de multiplexação. Porto de Detector A Figura 2 é uma ilustração de uma configuração de detecção exemplo multiplexado (Ultra-Violeta Visível (L-VIS), espectrómetro de massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detecção). A ilustração mostra a porta central é ligado ao detector de MS, enquanto que o DPPH • e detectores de UV-vis estão ligados às portas periféricas. Uma vez que a MS é o detector mais sensível dos três, fluir para este detector foi dirigido a partir do orifício de saída central. Como DPPH • detecção é seletiva para o presence de antioxidantes, e a menos sensível e mais tolerante a banda de alargamento, fluir para este detector foi dirigida a partir de uma porta periférica. O UV-Vis era um detector secundário &quot;genérico&quot;, por isso fluir para este detector foi dirigida a partir de uma segunda porta periférica. Ajuste fluxo Uma vez que a tubagem adequada foi ligada a partir de uma porta de detector, o fluxo de saída de cada um dos detectores pode ser ajustado para a quantidade necessária. Uma maneira simples para medir a quantidade de fluxo de saída a partir de cada detector é para pesar a quantidade de fase móvel que elui através de cada porta ao longo de um determinado período de tempo. A percentagem de fluxo pode assim ser determinada, e as razões de fluxo pode ser ajustado por qualquer encurtar ou alongar o tubo ligado à linha de saída de detectores de acordo com os requisitos que se adequa dos detectores de escolha. Diferentes detectores têm diferentes requisitos de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo deum detector de fluorescência (FLD) não está caudal limitado, mas deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de pressurização da célula de fluxo. Por isso, o controlo de fluxo através do FCDP é normalmente alcançada ajustando a queda de pressão através dos outros detectores e o resto do fluxo, em seguida, passa através da FLD. Um detector que é sensível à quantidade de fluxo que é emitido é o MS. Geralmente, espectrómetros de massa de alta corrente finais podem processar facilmente a cerca de 1 a 1,5 ml / min de fase móvel aquosa moderadamente. Acima desta velocidade de fluxo, inundação da fonte pode fazer as MS inoperável. No entanto, a sensibilidade de detecção na maioria dos espectrômetros de massa é beneficiado usando taxas de fluxo inferiores; portanto, as capacidades de divisão de fluxo de PSF são extremamente úteis para aplicações que envolvem a detecção de MS. Caudais volumétricos alta coluna pode ser utilizada, mas com cargas baixas volume transportado para o detector de MS. Sintonização do fluxo para o detector de MS, contudo, deve ser feita ajustando a queda de pressão antes daDetector MS, em vez de pós-MS. Aqui, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm ID) é muito útil, como a pressão pode ser facilmente ajustado sem adicionar inadequado volume morto. Dependendo do tipo de detector de o ajustamento da relação de segmentação pode ser feito, quer detector de pré ou pós. Se um detector não destrutivo, tal como é utilizado de UV-Vis, da percentagem de fluxo seria medido e ajustado pós detector. Se um único detector destrutivo é utilizado no multiplex configurar a percentagem de fluxo é determinada pelo cálculo para trás em relação a outras percentagens de fluxo de porta. Se um detector baseado reagente é utilizado, como DPPH •, a percentagem de fluxo é medido detector de pós, sem a adição de reagente; e se dois ou mais destrutivas detectores são usados, então a relação de fluxo é medido pré-detector. Sistemas que podem exigir instrumentação adicional, tal DPPH • Detecção, terá a pressão do sistema extra que pode alterar o fluxopercentagem uma vez ligado ao sistema de detecção. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser dada a pressão do sistema de um detector destrutiva, ao ajustar percentual fluxo pré-detector. Independentemente da razão de fluxo que está definido através de qualquer uma das portas, informação quantitativa deve ser obtida por meio da padronização adequada. Uma vez que as razões de fluxo são configurados, no entanto, eles são robustos, e não mudam mesmo sob condições de eluição em gradiente 7, O protocolo de vídeo detalhado que acompanha este manuscrito se destina a mostrar como usar e ajustar o funcionamento da coluna PSF em um modo multiplexado de detecção.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td>Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, pump.</td></tr><tr><td>Parallel Segmented Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.</td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td>Any brand</td><td></td><td>For blocking unused peripheral ports.</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr></tbody></table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Uma análise por HPLC multiplexada foi realizada utilizando uma coluna de TFA no modo de PSF (Figura 1) e configurado como ilustrado na Figura 2. Este tipo de configuração permitiu uma amostra de café para ser analisada simultaneamente usando UV-Vis, de DPPH • e MS No total Contagem Ion modo (TIC). Os compostos da amostra de café que responderam ao DPPH • poderia, então, ser facilmente compensada aos UV-Vis e MS - respostas de TIC com base...

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Sintonizar um paralelo Coluna Segmentada fluxo e permitindo a detecção multiplexada

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K visualizações.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bioengenharia

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Química

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Citometria de Fluxo de Imagem Microfluídica por Microscopia Óptica de Tempo-estiramento com detecção assimétrica (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Engenharia

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

Uma tecnologia Microfluidic Modular para estudos sistemáticos de nanocristais semicondutores coloidal

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.