This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Nota: Este protocolo contém instruções sobre como usar uma coluna de PSF em um sistema de HPLC associada a múltiplos detectores para detecção multiplexada. O protocolo foi escrito assumindo que o leitor tenha conhecimentos básicos e experiência em cromatografia e vários métodos de detecção de HPLC. Atenção: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados). 1. Configuração de Instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com água ultrapura (por exemplo, 100% de água Milli-Q) para Line A e 100% de metanol para a linha B como fase móvel e limpar as bombas como por exigência fabricante. Se um dos detectores utilizados é o MS, como é aqui, adicionar ácido fórmico a 0,1% para ambas as fases móveis A e B. </li><li> Defina-se a HPLC componentes instrumentais e detectores, como ilustrado na Figura 2. Isto exige a colocação conveniente dos detectores em relação à coluna de modo a minimizar o volume morto entre o detector e a coluna. A flexibilidade na configuração do sistema de HPLC é desejável. </li></ol> 2. Configuração de UV-Vis e detectores MS <ol><li> Definir o detector de UV-Vis ao comprimento de onda desejado depende da amostra de interesse (por exemplo, 280 nm). </li><li> Defina o detector MS no modo positivo para Contagem Total Ion (TIC) a análise utilizando o método de detecção Full Scan. Também ajustar os seguintes parâmetros: temperatura MS consequentemente vaporizador 500 ° C, temperatura de capilar 350 ° C, gás bainha fixada a uma taxa de 60 unidades, o fluxo de gás auxiliar40 e varrer o fluxo de gás em 5 unidades, e tensão de 3,5 kV de pulverização. Essas configurações podem ser ajustadas mais tarde para os requisitos específicos de usuários dependentes da amostra a ser analisada. </li></ol> 3. Preparação de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil radical (DPPH •) Reagente de configuração de DPPH • Sistema Detector <ol><li> Pesar 25 mg de DPPH • e dissolve-se em 250 ml de metanol num balão volumétrico. </li><li> Adicionar 250 ul de ácido fórmico ao DPPH • reagente. Tapar o frasco em folha para evitar a exposição à luz. </li><li> Sonicar o balão contendo o DPPH • reagente durante 10 min. </li><li> Purga-se o DPPH • bomba com o preparado DPPH • reagente conforme a necessidade do fabricante. </li><li> Configurar o DPPH • sistema de acordo com a Figura 2, anexando a linha da bomba para a entrada de uma peça em T. </li><li> Anexar uma bobina de 100 ul reação ao the de saída da peça em T e prender a outra extremidade da bobina de reacção para o detector. </li><li> Envolvem o bobina de reacção em um aquecedor de coluna e definir a temperatura do aquecedor de coluna a 60 ° C. </li><li> Defina o DPPH • UV-Vis detector para 520 nm. </li></ol> 4. Configuração do PSF Coluna <ol><li> Ligue a entrada da coluna de PSF para o instrumento de HPLC. </li><li> Ligue a porta central para o detector de MS, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar um porta periférica para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar uma outra porta periférica para a peça em T do DPPH • sistema de detecção utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID. </li><li> Bloquear a porta periférica livre utilizando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC de 1 ml min -1 a 100% da linha B - 100% de metanol (ácido fórmico a 0,1%). </li><li> Equilibrar a coluna com metanol a 100% móvel pHase por 20 min para uma coluna de comprimento x 250 mm 4,6 milímetros id. Desta vez é dimensionada de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol> 5. Ajustando o Coluna PSF para detecção multiplexada <ol><li> Medir a massa de, pelo menos, dois recipientes de recolha vazios (um para a porta ligada ao detector de UV-Vis e um para o detector de DPPH •) utilizando uma balança analítica. </li><li> Recolha fase móvel a partir do UV-Vis e os DPPH • Portas em dois recipientes separados, pré-pesados ​​de recolha (5.1). Grave o período de tempo para a coleção. Recolher pelo menos 500 mg de solvente em cada navio. </li><li> Pesar os vasos de recolha e determinar a massa da fase móvel. Dada a densidade de 0,791 g de metanol é mL -1, determinar o volume de fase móvel recolhidos a partir de cada porta. </li><li> Por diferença, isto é, taxa de fluxo conjunto bomba nominal menos a taxa de fluxo através do DPPH • e UV-Vis Detectoportas de fluxo r, determinação da velocidade de fluxo para o detector de MS. Expresse cada proporção de fluxo como uma percentagem do fluxo total. Nota: Idealmente, as percentagens de fluxo são: para a MS é de 18% do caudal total, ao UV-Vis 22%, para o DPPH • detector de 60%. </li><li> Se não, ajustar as percentagens de fluxo, alterando a pressão de retorno no detector de UV-Vis. Por exemplo, se o fluxo para o UV-Vis é demasiado alta, diminuir a proporção de adição de adicionar uma secção de 15 cm de tubagem de 0,13 mm id para a saída do detector de UV-Vis. Em seguida, repita os passos 5.1 a 5.5. </li></ol> 6. Condições configuração final <ol><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de DPPH • reagente para a mesma taxa de fluxo que sai da porta de saída ligada ao DPPH • detector. Nota: A coluna PSF multiplexado com UV-Vis, DPPH • e MS está pronto para análise. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este estudo envolve a caracterização e definição de perfis de café utilizando HPLC com detecção multiplexada empregando uma coluna paralela fluxo segmentado (PSF). Multiplexada HPLC utilizando colunas PSF permite a caracterização e identificação de entidades químicas chave reduzindo a complexidade de dados da amostra, enquanto a obtenção de um maior grau de informações específicas da molécula dentro de uma fracção do tempo que leva a utilização de processos de detecção de múltiplos convencionais...

Colunas Fluxo de Tecnologia ativos Tecnologia de fluxo Ativa (AFT) colunas de cromatografia foram recentemente desenvolvidas para superar a ineficiência nas separações associados a heterogeneidade de fluxo de 1-6 e também para permitir a detecção multiplexada. Nesse particular detalhe comunicação que o processo operacional do paralelo segmentado coluna de fluxo (PSF), com detecção multiplexada. As vantagens funcionais da coluna PSF são: (1) o fluxo a partir da região central radial do leito da coluna é isolado a partir da região periférica ou parede de fluxo, (2) o volume de fase móvel que devem ser processados ​​por uma detecção fonte é reduzida e as fontes (3) detecção podem ser multiplexados para expandir a informação da amostra sem atrasos de detecção de incutir em cada processo de detecção, ou posteriormente, necessitando a divisão de um fluxo de fluxo pós-coluna 7,8. A característica essencial no desenho da coluna PSF que permite que o umdvantage de detecção é a saída multiplexada acessório de montagem e frita de novo. A Figura 1 é uma fotografia da coluna AFT comparada com uma coluna convencional. É importante compreender que o processo de separação obtido utilizando colunas de fluxo paralelas segmentado não é o mesmo que o fluxo de fluxo pós-coluna de divisão. Em uma corrente de fluxo pós-coluna dividir toda a banda de amostra a partir da borda para as extremidades da cauda é igualmente incluídos na amostra (isto é, axialmente), desse modo, cada corrente de escoamento é igual no que respeita à eficiência e sensibilidade; a magnitude da sensibilidade, assim, ser divididos pelas divisões numéricas. Em PSF, no entanto, as amostras do processo de divisão da banda radialmente, não axialmente. Como tal, as amostras de portas centrais vértice do pico - a região mais concentrada do pico. Assim, a sensibilidade mais elevada aqui é como o pico não é diluída pela região da cauda difusa. A amostra eluindo a partir das portas periféricas não é tão eficiente como no CentraL zona, mas, uma vez que a banda é amostrado radialmente, ao invés de axial, a largura do pico é mais estreito do que seria o caso para um processo de amostragem que divide o pico na direcção axial, isto é, uma separação pós-coluna. Por conseguinte, a sensibilidade do detector com uma concentração dependente não é reduzida. Na coluna PSF, o acessório de saída compreende várias portas de saída e no interior desta extremidade encaixe ali está alojado um filtro poroso anelar. A porção interior de canais de frita anulares esta fluir para fora da coluna através da porta de saída central radial, enquanto que a porção radial exterior dos canais de tomada de frita de fluir para fora da coluna através das portas de fluxo de saída periférica ou zona da parede. As porções interior e exterior da frita de saída são separadas por uma barreira impermeável que impede o escoamento transversal entre estas regiões de fluxo 2. Como consequência desta concepção da corrente central de fluxo radial através do leito da coluna está separado do fluxo de parede ins regiãoide a coluna. A parte relativa de fluxo a partir destas duas regiões pode ser variado para se quase qualquer proporção desejada através de uma gestão de pressão, a fim de optimizar vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Em essência, este projeto estabelece de forma eficaz dentro da grande coluna de formato de uma coluna de &#39;virtual&#39;, com um diâmetro interno estreito, e, portanto, as funções de coluna como uma coluna na parede menos verdadeiro, superando coluna de leito heterogeneidade e os efeitos de parede 9,10. Os principais benefícios do colunas PSF são melhorias na eficiência da coluna, a minimização do solvente de processamento para a detecção de fonte (s) e permite a detecção multiplexado. No entanto, uma vantagem é que uma vez que a cauda e as regiões de frente de qualquer banda são removidos a partir do perfil de eluição geral na eluição do soluto ou detecção está presente em uma concentração mais elevada do que de outro modo seriam observados para os mesmos solute injecção e a concentração de carga em uma coluna convencional, dependendo da relação de segmentação empregue. Como consequência, é muitas vezes observado um ganho na intensidade do sinal para separações conduzidas em colunas 2 PSF. Na verdade, se o rácio de segmentação é ajustada de tal modo que 25% das saídas de fluxo de cada uma das quatro aberturas de saída, a intensidade do sinal que é observada usando violeta (UV) de detecção ultra mostra praticamente a mesma intensidade de sinal exacto como aparente, utilizando uma convencional coluna onde a totalidade (100%) da fase móvel é analisada 7. Além disso, o ajuste fino da relação de saída de fluxo entre as regiões central e parede permite que a eficiência da coluna para ser optimizado. Os ganhos de eficiência da coluna observada usando colunas AFT não pode ser indicado como um único valor, uma vez que estes ganhos de eficiência são uma função de três factores: (1) a taxa de fluxo, (2) a relação de segmentação, e (3) o factor de retenção de soluto . No entanto, os ganhos de eficiência em comparação com conventional colunas são quase sempre observada, e por vezes, esses ganhos são mais do que 100% do número de pratos teóricos 1,2. A capacidade de ajustar o rácio de segmentação permite que o analista para adaptar efectivamente o diâmetro da coluna &quot;virtual&quot;, e este é um factor importante no que diz respeito ao processo de detecção. Por exemplo, uma coluna virtual de 2.1 mm de diâmetro interno (ID) é estabelecida a partir de uma coluna ID de 4.6 mm quando a relação física segmentação é de 21% de fase móvel eluindo a partir do orifício de saída central radial. Sob estas condições, a coluna id Virtual 2.1 mm realiza com uma eficiência que podem ser mais do que 70% maior do que a coluna convencional ID de 2.1 mm, dependendo da taxa de fluxo, e factor de retenção de soluto 10. O design de coluna PSF corrente que é utilizado para a detecção multiplexado incorpora uma porta de saída de 4-montagem, mas a coluna pode ser equipado com uma porta 2-Também-encaixe final, no entanto, esta limita a detecção tO apenas dois detectores. A operação básica destas colunas é, no entanto, o mesmo, excepto que os quatro detectores podem ser acopladas simultaneamente à saída da coluna PSF 4-porta alargar o âmbito de detecção multiplexado. Além da coluna de tubos conjuntivo pré e pós, os únicos requisitos adicionais para operar uma coluna PSF é tubos que podem ser ligados às portas de saída periférica, e um meio pelo qual a quantidade de fase móvel passa através de cada tubo pode ser medido, costuma ser uma medição de massa ou uma medição volumétrica. Para facilidade de ajuste, o diâmetro interno de toda a tubagem de fluxo de saída deve ser o mesmo. A razão de fluxo entre as aberturas de saída centrais periféricas e radiais é então variado através da utilização de gestão de pressão, simplesmente por alteração do comprimento do tubo localizado na saída periférica encaixe, ou o comprimento de pós tubo detector do orifício de saída central radial. Detecção multiplexado Usando colunas do PSF </strong&gt; Uma vantagem importante das colunas PSF é que cada uma das aberturas de saída de saída pode ser ligado directamente a uma fonte de detecção, permitindo assim a detecção multiplexado. Em um sistema de detecção bem concebido com uma única análise de detecção multiplexada pode proporcionar informação substancial no que diz respeito à natureza dos componentes no interior da amostra. Importante, ensaios destrutivos e não destrutivos podem ser conduzidas exactamente ao mesmo tempo, sem atraso de detecção. Isto permite a atribuição absoluta de, por exemplo, anti-oxidantes, utilizando DPPH • reagente, com componentes para eluir observado com UV e / ou espectrometria de massa (MS) de detecção de respostas de 7,11. Portanto, quatro detectores independentes pode ser operado simultaneamente com porções adequadas de fluxo dirigido para cada detector através de qualquer uma das quatro portas de saída. Uma vez que o fluxo através destas portas pode ser facilmente ajustado a quantidade de soluto, atingindo qualquer dos detectores pode ser ajustado para se adequara sensibilidade do detector dada fonte. Deve notar-se, no entanto, que a migração de soluto mais eficiente é observado através da porta de saída central radial. Cada uma das portas periféricos oferecem eficiência de separação equivalente, o qual quando ajustado para 25% através de cada porta, é apenas ligeiramente menos eficaz do que uma coluna convencional. Como tal, é importante que o detector quantitativa ser configurado para analisar amostras a partir da porta de saída central radial. Ao definir-se uma coluna de PSF para a finalidade de detecção de multiplexação há uma série de considerações que necessitam ser feitas para alcançar resultados eficazes e de alta qualidade; que é dimensões de tubos para cada porta, escolha de qual porta para um tipo de detector e de regulação do fluxo. Dimensões do tubo para cada porta Na cromatografia a extensão de tubagem pós coluna desempenha um papel crucial na eficiência e o desempenho da separação. Dea Granded-volume como resultado da tubagem ID comprida ou larga de saída da coluna para detector irá resultar numa perda de eficiência, sensibilidade e resolução. Assim, as dimensões tubulação apropriada deve ser utilizado quando a configuração da coluna PSF para atingir o potencial máximo na prestação de separação eficiente e proporcionar os benefícios de multiplexação. Porto de Detector A Figura 2 é uma ilustração de uma configuração de detecção exemplo multiplexado (Ultra-Violeta Visível (L-VIS), espectrómetro de massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detecção). A ilustração mostra a porta central é ligado ao detector de MS, enquanto que o DPPH • e detectores de UV-vis estão ligados às portas periféricas. Uma vez que a MS é o detector mais sensível dos três, fluir para este detector foi dirigido a partir do orifício de saída central. Como DPPH • detecção é seletiva para o presence de antioxidantes, e a menos sensível e mais tolerante a banda de alargamento, fluir para este detector foi dirigida a partir de uma porta periférica. O UV-Vis era um detector secundário &quot;genérico&quot;, por isso fluir para este detector foi dirigida a partir de uma segunda porta periférica. Ajuste fluxo Uma vez que a tubagem adequada foi ligada a partir de uma porta de detector, o fluxo de saída de cada um dos detectores pode ser ajustado para a quantidade necessária. Uma maneira simples para medir a quantidade de fluxo de saída a partir de cada detector é para pesar a quantidade de fase móvel que elui através de cada porta ao longo de um determinado período de tempo. A percentagem de fluxo pode assim ser determinada, e as razões de fluxo pode ser ajustado por qualquer encurtar ou alongar o tubo ligado à linha de saída de detectores de acordo com os requisitos que se adequa dos detectores de escolha. Diferentes detectores têm diferentes requisitos de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo deum detector de fluorescência (FLD) não está caudal limitado, mas deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de pressurização da célula de fluxo. Por isso, o controlo de fluxo através do FCDP é normalmente alcançada ajustando a queda de pressão através dos outros detectores e o resto do fluxo, em seguida, passa através da FLD. Um detector que é sensível à quantidade de fluxo que é emitido é o MS. Geralmente, espectrómetros de massa de alta corrente finais podem processar facilmente a cerca de 1 a 1,5 ml / min de fase móvel aquosa moderadamente. Acima desta velocidade de fluxo, inundação da fonte pode fazer as MS inoperável. No entanto, a sensibilidade de detecção na maioria dos espectrômetros de massa é beneficiado usando taxas de fluxo inferiores; portanto, as capacidades de divisão de fluxo de PSF são extremamente úteis para aplicações que envolvem a detecção de MS. Caudais volumétricos alta coluna pode ser utilizada, mas com cargas baixas volume transportado para o detector de MS. Sintonização do fluxo para o detector de MS, contudo, deve ser feita ajustando a queda de pressão antes daDetector MS, em vez de pós-MS. Aqui, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm ID) é muito útil, como a pressão pode ser facilmente ajustado sem adicionar inadequado volume morto. Dependendo do tipo de detector de o ajustamento da relação de segmentação pode ser feito, quer detector de pré ou pós. Se um detector não destrutivo, tal como é utilizado de UV-Vis, da percentagem de fluxo seria medido e ajustado pós detector. Se um único detector destrutivo é utilizado no multiplex configurar a percentagem de fluxo é determinada pelo cálculo para trás em relação a outras percentagens de fluxo de porta. Se um detector baseado reagente é utilizado, como DPPH •, a percentagem de fluxo é medido detector de pós, sem a adição de reagente; e se dois ou mais destrutivas detectores são usados, então a relação de fluxo é medido pré-detector. Sistemas que podem exigir instrumentação adicional, tal DPPH • Detecção, terá a pressão do sistema extra que pode alterar o fluxopercentagem uma vez ligado ao sistema de detecção. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser dada a pressão do sistema de um detector destrutiva, ao ajustar percentual fluxo pré-detector. Independentemente da razão de fluxo que está definido através de qualquer uma das portas, informação quantitativa deve ser obtida por meio da padronização adequada. Uma vez que as razões de fluxo são configurados, no entanto, eles são robustos, e não mudam mesmo sob condições de eluição em gradiente 7, O protocolo de vídeo detalhado que acompanha este manuscrito se destina a mostrar como usar e ajustar o funcionamento da coluna PSF em um modo multiplexado de detecção.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC instrument</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:185px;">Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parallel Segmented Flow HPLC column</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Not Defined</td>
			<td>Soon to be commercialised</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEEK tubing</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Various lengths and i.d.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Column stoppers</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blocking unused peripheral ports.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEEK tube cutter</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analytical Scale Balance</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stop watch</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eluent collection vessels</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Uma análise por HPLC multiplexada foi realizada utilizando uma coluna de TFA no modo de PSF (Figura 1) e configurado como ilustrado na Figura 2. Este tipo de configuração permitiu uma amostra de café para ser analisada simultaneamente usando UV-Vis, de DPPH • e MS No total Contagem Ion modo (TIC). Os compostos da amostra de café que responderam ao DPPH • poderia, então, ser facilmente compensada aos UV-Vis e MS - respostas de TIC com base...

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Sintonizar um paralelo Coluna Segmentada fluxo e permitindo a detecção multiplexada

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K visualizações.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

Vídeo: Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Química

Exploring the Radical Nature of a Carbon Surface by Electron Paramagnetic Resonance and a Calibrated Gas Flow

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date back to the early 1980s the focus of these early papers primarily characterized the changes to the structures under extremely harsh conditions (pH or temperature)1-3. It is also known that paramagnetic molecular oxygen undergoes a Heisenberg spin exchange interaction with stable radicals that extremely broadens the EPR signal4-6. Recently, we reported interesting results where this interaction of molecular oxygen with a certain part of the existing stable radical structure can be reversibly affected simply by flowing a diamagnetic gas through the carbon samples at STP7. As flows of He, CO2, and N2 had a similar effect these interactions occur at the surface area of the macropore system.
This manuscript highlights the experimental techniques, work-up, and analysis towards affecting the existing stable radical nature in the carbon structures. It is hoped that it will help towards further development and understanding of these interactions in the community at large.

Stable radicals that are present in carbon substrates interact with paramagnetic oxygen through a Heisenberg spin exchange. This interaction can be significantly reduced under STP conditions by flowing a diamagnetic gas over the carbon system. This manuscript describes a simple method to characterize the nature of those radicals.

Explorando a Natureza Radical de uma superfície de carbono por ressonância paramagnética eletrônica e um fluxo de gás Calibrado

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date ...

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Transporte de nanotubos de carbono de superfície modificada através de uma coluna de solo

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Polimerizações etileno utilizando reatores de pressão paralelas e uma análise cinética da cadeia de transferência de Polimerização

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Síntese altamente Stereoselective de 1,6-cetoésteres Mediada por líquidos iônicos: A reacção de três componente permitindo o rápido acesso a uma nova classe de baixo peso molecular Gelators Peso

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Protocol for Electrochemical Evaluations and State of Charge Diagnostics of a Symmetric Organic Redox Flow Battery

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid and deployment of renewable energy technologies. Among the many flow battery chemistries, non-aqueous flow batteries have the potential to achieve high energy density because of the broad voltage windows of non-aqueous electrolytes. However, significant technical hurdles exist currently limiting non-aqueous flow batteries to demonstrate their full potential, such as low redox concentrations, low operating currents, under-explored battery status monitoring, etc. In an attempt to address these limitations, we recently reported a non-aqueous flow battery based on a highly soluble, redox-active organic nitronyl nitroxide radical compound, 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (PTIO). This redox material exhibits an ambipolar electrochemical property, and therefore can serve as both anolyte and catholyte redox materials to form a symmetric flow battery chemistry. Moreover, we demonstrated that Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy could measure the PTIO concentrations during the PTIO flow battery cycling and offer reasonably accurate detection of the battery state of charge (SOC), as cross-validated by electron spin resonance (ESR) measurements. Herein we present a video protocol for the electrochemical evaluation and SOC diagnosis of the PTIO symmetric flow battery. With a detailed description, we experimentally demonstrated the route to achieve such purposes. This protocol aims to spark more interests and insights on the safety and reliability in the field of non-aqueous redox flow batteries.

We present the protocols for electrochemically evaluating a symmetric non-aqueous organic redox flow battery and for diagnosing its state of charge using FTIR.

Um protocolo para eletroquímicos Avaliações e estado de carga Diagnostics de um fluxo Redox Battery Symmetric Organic

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid ...

A Continuous-flow Photocatalytic Reactor for the Precisely Controlled Deposition of Metallic Nanoparticles

In this work, a novel photocatalytic reactor for the pulsed and controlled excitation of the photocatalyst and the precise deposition of metallic nanoparticles is developed. Guidelines for the replication of the reactor and its operation are provided in detail. Three different composite systems (Pt/graphene, Pt/TiO2, and Au/TiO2) with monodisperse and uniformly distributed particles are produced by this reactor, and the photodeposition mechanism, as well as the synthesis optimization strategy, are discussed. The synthesis methods and their technical aspects are described comprehensively. The role of the ultraviolet (UV) dose (in each excitation pulse) on the photodeposition process is investigated and the optimum values for each composite system are provided.

For a continuous and scalable synthesis of noble-metal-based nanocomposites, a novel photocatalytic reactor is developed and its structure, operation principles, and product quality optimization strategies are described.

Um reator de fluxo contínuo fotocatalítico para a deposição controlada precisamente de nanopartículas metálicas

In this work, a novel photocatalytic reactor for the pulsed and controlled excitation of the photocatalyst and the precise deposition of metallic ...

Tuning the Acidity of Pt/ CNTs Catalysts for Hydrodeoxygenation of Diphenyl Ether

We herein present a method for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs. By varying the weight of various solid acid nanosheets, a series of Pt/xHMNO6/CNTs with different solid acid compositions (x = 5, 20 wt%; M = Nb, Ta; N = Mo, W) have been prepared by carbon nanotube pretreatment, protonic exchange, solid acid exfoliation, aggregation and finally Pt particles impregnation. The Pt/xHMNO6/CNTs are characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and NH3-temperature programmed desorption. The study revealed that HNbWO6 nanosheets were attached on CNTs, with some edges of the nanosheets being bent in shape. The acid strength of the supported Pt catalysts increases in the following order: Pt/CNTs &#60; Pt/5HNbWO6/CNTs &#60; Pt/20HNbMoO6/CNTs &#60; Pt/20HNbWO6/CNTs &#60; Pt/20HTaWO6/CNTs. In addition, the catalytic hydroconversion of lignin-derived model compound: diphenyl ether using the synthesized Pt/20HNbWO6 catalyst has been investigated.

A protocol for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs is presented.

Ajustando a acidez dos catalisadores pt/CNTs para Hidrodesoxigenação de éter difenílico

We herein present a method for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs. By varying the weight of various solid acid ...