Os autores gostariam de agradecer a Joe Owen no instrumento Biomédica e Machine Shop por seus esforços incansáveis ​​em usinagem e montagem das peças fluxo de câmara e Matt Maudsley da Leica Microsystems para auxiliar nas técnicas de imagem para as células através de câmaras de fluxo. Somos gratos a Kevin Collins dos Serviços de Perfusão Duke e Dr. Steve Wallace no Departamento de Engenharia Biomédica para sugestões úteis sobre projeto de circuito de fluxo. Gostaríamos também de agradecer à National Science Foundation Graduate Fellowship Program Research para apoiar Alexandra Jantzen e os NIH por seu apoio através de Grant &quot;forro autólogo EPC para melhorar a biocompatibilidade de dispositivos de assistência circulatória&quot; RC1HL099863-01.

<ol>
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Produção e acesso gratuito deste vídeo-artigo é patrocinado pela Co. Instrumento Cole-Parmer

O nosso circuito de fluxo e câmara de fluxo nos permitem assunto células aderentes, EPCs por exemplo, para tensões de cisalhamento definida fluido. Desde o compartimento superior e inferior são de adesão, transparente e morfologia celular pode ser avaliado tanto em tempo real, através da câmara em si, ou depois de uma experiência de fluxo e desmontagem da câmara de fluxo. Nesse ponto, as células podem ser colhidas em condições estéreis e ou re-banhado, ou usado para coletar seu DNA ou RNA, etc, para posterior análise. Para conseguir um fluxo laminar, o desenho da câmara deve ser tal que várias condições sejam cumpridas. Primeiro, o fluxo deve ser laminar, que pode ser verificado através do cálculo o número de Reynolds (Re), que é a razão entre forças inerciais às forças viscosas. (Se as forças viscosas predominam, Re é pequeno eo fluxo é laminar ou &#39;plenamente desenvolvido&#39; - geralmente para Re &lt;2300.Se as forças de inércia predominam, o fluxo se torna mais e mais aleatória até que seja turbulento, como é o caso para Re&gt; 4000). Podemos calcular Re acordo com a equação 3 8, <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Onde ρ é a densidade do fluido, Q é a vazão, μ é a viscosidade, w e h são a largura ea altura da câmara, respectivamente, e D h é o diâmetro hidráulico, definido de acordo com a equação 4 8, <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> O número de Reynolds do nosso fluxo de câmaras de três, com alturas que variam de 166-267 M, faixa 13,9-34,6 a taxas de fluxo de calculated para obter uma tensão de cisalhamento de 15 dinas / cm 2. Em taxas de fluxo calculado para uma tensão de cisalhamento de 100 dinas / cm 2, o número de Reynolds das câmaras variou de 90,4-234. Todos estes números são muito mais baixos Reynolds de 2300 e atender o critério de fluxo laminar. Segundo, para o campo de velocidade e tensão de cisalhamento para ser independente da distância ao longo do canal de fluxo (ou seja, totalmente desenvolvido), a distância entre a entrada de líquido para o slide deve ser maior que o comprimento de entrada, e L. Isto pode ser satisfeita por meio do cálculo do comprimento de entrada, conforme a equação 5 9. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Para os valores listados acima, o comprimento de entrada varia de 0,01 a 0,25 centímetros. Terceiro, a fim de garantir que a velocidade ea tensão de cisalhamento na direção laterais não variamsignificativamente do valor de fluxo unidimensional canal (Δ Ph / 2L), a relação h / w deve ser muito menor que 1. Para a tensão média de cisalhamento de parede em condições bidimensionais fluxo a ser de 95% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,10, e para a tensão de cisalhamento de parede em condições bidimensionais de fluxo para ser 97,5% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,05. Com as dimensões da nossa câmara de fluxo projetado 1,7 centímetros de largura e 166-267 M de altura, estes critérios estão preenchidos. A pressão vai variar apenas na direção do fluxo, se não houver gradientes de pressão lateral na entrada. Isto pode ser avaliada utilizando corantes ou partículas no caminho de fluxo. Além disso, para experimentos de fluxo contínuo, um amortecedor de pulso é inserido no circuito de fluxo. O amortecedor de pulso tira a maior parte do pulsatility causada pela bomba de roletes no circuito, e nos permite a assunção aproximado de fluxo constante. De nota, o amortecedor de pulso utilizada deve ser compatível com a bomba e tubos utilizados no circuito, de modo que ele pode efetivamente eliminar pulsações no fluxo de saída para as freqüências específicas da bomba de rolete. Em nossa demonstração do Masterflex L / S amortecedor de pulsações atinge fluxo laminar, quando utilizado na linha de descarga com qualquer bomba série Masterflex L / S (0-600 RPMs) e I / P tubo 26. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Além disso, o circuito é projetado de tal forma que as amostras de perfusato pode ser facilmente coletadas em momentos diferentes sem o risco de contaminação das células ou médio fluxo. No nosso exemplo, a concentração de NO 2 - foi medido por quimioluminescência comum Ionics / Sievers Analyzer óxido nítrico (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), como descrito anteriormente 10. O redutor usado para análise de nitrito foi de iodeto de potássio em ácido acético (14,5 M de ácido acético e 0,05 M KI), que tem o potencial de redução para converter o nitrito a NO, mas é insuficiente para reduzir qualquer óxidos de nitrogênio superiores tais como o nitrato e, portanto, é relativamente específico para nitrito. O nitrito total produzido foi calculado como o produto da concentração produzida eo volume total do circuito, enquanto o ajuste de volume perdido, enquanto a recolha de amostras 6. Os passos seguintes são críticos para a execução bem sucedida de experimentos de fluxo: <ol class="lroman"><li> É desejável para evitar formação de bolhas durante o fluxo de set-up, uma vez que as bolhas têm o potencial para arrancar as células de sua superfície. Isto pode ser evitado tomando cuidado ao colocar a parte superior da câmara de fluxo para a parte inferior, o que é melhorrealizado, mantendo ambos paralelos entre si e diminuindo o topo para o fundo em um movimento sem reajustes. Ao fazer isso, pequenas bolhas de ar que possam estar presentes e / ou flutuando no canal de fluxo, serão desviados para as armadilhas de bolha em cada extremidade da carcaça de alumínio. </li><li> É importante assegurar que a tubulação de saída do reservatório desce para o fundo do reservatório. Caso contrário, o ar pode ser sugado para dentro do tubo que conduz a partir de reservatório para a câmara se o nível de perfusato cai ligeiramente abaixo da extremidade da tubulação. </li><li> O pesquisador deve estar familiarizado com a direção do fluxo da bomba para que a bomba não acidentalmente correr na direção oposta ao início do fluxo, o que resultaria no ar sendo sugado para dentro do circuito e de câmara. </li><li> Para evitar a formação de espuma (devido às proteínas desnaturadas contidas no soro), aconselhamos baixar o tubo que conduz da câmara para o reservatório a aproximadamente uma polegada acima do perfusate de nível dentro do reservatório. No entanto, mantendo-o acima do nível médio de fluxo lhe permite verificar o fluxo no reservatório durante o experimento. </li><li> Quando unir as peças de câmara em conjunto, é importante agarrar firme a habitação com uma das mãos ao operar a chave de fenda elétrica com a outra mão. Note que o movimento da chave de fenda elétrica será traduzido em torque que tem o potencial de &quot;arremessar a câmara em torno de&quot; uma vez que o parafuso é apertado. </li><li> Para evitar qualquer ondas de pressão de formação no circuito e levantamento de células fora de sua superfície, assegurar que todas as torneiras estão abertos antes de iniciar o fluxo. </li><li> Especialmente para estudos de fluxo de longo prazo (&gt; 48 horas) recomendamos o uso do tubo mais duro e mais resistente para ser inserido na cabeça da bomba para impedir a quebra da tubulação. </li><li> É possível que os tubos &#39;migra&#39; dentro da cabeça da bomba devido a mal-ajustadas dentes cabeça da bomba. Portanto, sugerimos prestando muita atenção à forma como a banheiraing é garantido na cabeça da bomba e marcar cada extremidade do tubo com uma caneta marca de tal forma que você pode facilmente perceber se o tubo é &#39;puxado&#39; ou deslocada durante o experimento. </li><li> Sempre verifique cuidadosamente cada conector único do circuito e da câmara antes de iniciar a perfusão, a fim de evitar fugas de perfusato durante um experimento devido a uma conexão defeituosa. Isto é especialmente importante para os conectores de entrada e saída de amortecedores de pulso! </li><li> Lembre-se de limitar a exposição à luz, se você usar etiquetas fluorescentes. </li></ol> Uma possível limitação do nosso câmara de fluxo é que a altura é fixado pela altura do canal usinado no alumínio. No entanto, este tem a vantagem de não ter que verificar e ajustar a altura do canal antes de cada experiência e, portanto, simplifica os cálculos tensão de cisalhamento por apenas ajustando o fluxo da bomba para o valor desejado. Dependendo de seus objetivos de pesquisa, pode ser desejávelaumentar a tensão de cisalhamento sem aumentar a velocidade da bomba. Neste caso, recomendamos o aumento da viscosidade do perfusato é, por exemplo, a adição de dextran a 11 médio. Uma possível limitação do circuito de fluxo é o grande volume de meio utilizado, que pode ser problemático quando se tenta quantificar concentrações muito pequenas de metabólitos celulares. Embora não seja mostrado aqui, é possível reduzir substancialmente o volume do circuito usando um reservatório menor e amortecedor de pulso e diminuir comprimento da tubulação e diâmetro. Além disso, existem vários outros sistemas disponíveis no mercado que podem ser usados ​​para aplicar tensão de cisalhamento de fluidos para células em cultura. Sistemas baseados em microfluídica, por exemplo, o sistema de BioFlux Fluxion, permitem análises simultâneas de células em diferentes canais de fluxo microfluídicos carregado com solução em placas bem atuando como reservatórios de entrada e de saída para estes canais 12,13,14. No entanto, essas e outras microsistemas fluídicos não são compatíveis com lâminas de microscópio padrão e não permitir a recuperação de um número suficientemente grande de células para novas experiências, tais como RT-PCR ou Western Blot. Além disso, eles são menos user-friendly, um custo mínimo de US $ 40.000 e pode chegar a um total de mais de US $ 100.000, dependendo do equipamento acessório. Dois sistemas macrofluidic disponível a partir do FlexCell Internacional Corporation, o Streamer FlexCell e os sistemas FlexFlow, tem sido utilizado com sucesso para estudar células endoteliais 15,16,17, as células humanas anel 18 e 19 fibroblastos em condições de escoamento de fluidos. Um terceiro sistema, disponível através GlycoTech, tem sido utilizada para estudar a adesão de células tumorais 20 e 21 a adesão de leucócitos monocamadas endoteliais. O sistema permite Streamer vários slides para serem executados sob as mesmas condições de tensão de cisalhamento de uma só vez, mas carece de uma janela de visualização e - ao contrário de nossosdesign - não permite a visualização em tempo real de células em fluxo. O sistema FlexFlow tem uma janela de visualização, mas requer um microscópio vertical, que pode não ser o microscópio padrão usado na maioria dos laboratórios. Além disso, o sistema exige uma FlexFlow lamínula célula revestido de ser invertida quando colocado na câmara de fluxo. Isto impede a visualização de células fluorescentes em uma superfície opaca, como o titânio revestido de vidro, que demonstramos em nosso estudo. Por último, o lamínulas especializados precisam ser comprados especificamente para o sistema FlexFlow, que é na faixa de preço de vários mil dólares, similar ao sistema Streamer FlexCell. GlycoTech oferece circular e retangular câmaras de placas paralelas de fluxo, que são significativamente menos caro, mas fabricados a partir de acrílico moldado que não podem ser convenientemente tronco autoclavado como a nossa câmara. De nota, câmaras de fluxo de outras que têm sido descritos para ser autoclavávelparecem impraticáveis, pois requerem especial lentes microscópicas 22,23. O sistema utiliza GlycoTech juntas de borracha de silicone interposta entre as placas superior e inferior, que mudará de espessura com o uso repetido e, portanto, alterar a altura da câmara ao longo do tempo (o fabricante recomenda a compra de novas a cada dez usa). Nossa câmara de alumínio com built-in O-rings permite a completa oposição de placas superior e inferior e altura da câmara garante constante entre experimentos. Por último, bombas de vácuo são necessárias para alcançar um selo à prova de vazamentos em projetos de câmara de fluxo de muitos, incluindo as câmaras GlycoTech, que não são necessárias em nosso projeto. Considerando não mostrado aqui, a câmara de fluxo pode ser mantido sob um microscópio durante o experimento de vazão em tempo real imagens de adesão celular e / ou comportamento. Se isso for desejado, recomendamos usar lâmpadas de calor ou uma almofada de aquecimento sob a câmara para manter a temperatura do perfusato a 37 ° C. Pelelá, a bomba de roletes pode ser substituído por uma bomba de seringa, se não &quot;recirculação&quot; da células ou metabólitos ou droga investigacional ou agentes é desejado 24. Também é possível ao fluxo de células de maneira diferente rotulados sobre células aderentes, por exemplo, plaquetas fluorescentes sobre uma camada de EPCs confluentes (utilizando o ensaio de plaquetas descrito por Achneck et al. 6,25) para avaliar a célula a célula-interação sob tensão de cisalhamento do fluido. Nossa câmara de fluxo combina recursos valiosos de outras câmaras de fluxo disponíveis, como uma porta de amostragem perfusato e uma janela de visualização e tem a importante vantagem de compatibilidade com qualquer um microscópio invertido ou vertical. É totalmente autoclavável e permite experimentos repetidos na altura da câmara constante e sem a necessidade de bombas de vácuo para conseguir um selo à prova de fugas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produtos / Reagentes </td><td> Companhia </td><td> Produto # </td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> Seringa 30 ml </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Torneiras </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Liga de alumínio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cultura de células-Pratos (4-bem, rectangular) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Rastreador de celular Laranja </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Organics pesquisa </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Adaptador Luer fêmea </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2mg </td></tr><tr><td> Garrafa de vidro (250ml) com Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubos rígidos </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Solution Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptador Luer macho </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Médio </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Acessórios polipropileno farpado </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulso-amortecedor </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Bomba de acionamento (Masterflex L / S disco economia de velocidade variável) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Bomba-Head (Cabeça da bomba Masterflex Fácil Load) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Slide </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubulação macia </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Seringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Solução de tripsina Neutralizing </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

O objetivo geral deste método é descrever uma técnica para assunto células aderentes às condições de fluxo laminar e avaliar sua resposta ao cisalhamento de fluidos bem quantificáveis ​​sublinha 1. Nosso projeto de câmara de fluxo e circuito de fluxo (Fig. 1) contém uma região de visualização transparente que permite o teste de adesão celular ea imagem da morfologia das células imediatamente antes de fluxo (Fig. 11A, B), em momentos diferentes durante o fluxo (Fig. 11C) , e depois de fluxo (Fig. 11D). Estes experimentos são ilustrados com cordão umbilical humano derivados do sangue células progenitoras endoteliais (EPCs) e suínos EPCs 2,3. Este método é também aplicável a outros tipos de células aderentes, por exemplo, células musculares lisas (PMEs) ou fibroblastos. A câmara e todas as partes do circuito são facilmente esterilizados com autoclavagem a vapor. Em contraste com outroscâmaras, por exemplo, câmaras de microfluídica, um grande número de células (&gt; 1 milhão, dependendo do tamanho da célula) podem ser recuperados após o experimento de fluxo sob condições estéreis para cultura de células ou de outros experimentos, por exemplo, DNA ou extração de RNA, ou imuno-histoquímica (Fig. 11E), ou microscopia eletrônica de varredura 5. A tensão de cisalhamento pode ser ajustado pela variação da taxa de fluxo do perfusato, a viscosidade do fluido, ou a altura ea largura do canal. Este último pode reduzir o volume de fluido ou necessidades célula, assegurando simultaneamente que unidimensional de fluxo é mantida. Não é necessário para medir a altura da câmara entre os experimentos, uma vez que a altura da câmara não depende do uso de juntas, o que aumenta a facilidade de múltiplas experiências. Além disso, o projeto de circuito facilmente permite a coleta de amostras de perfusato para análise e / ou quantificação de metabólitos secretados pelas células sob exposição ao estresse de fluidos de corte, o óxido nítrico por exemplo (Fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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43.2K visualizações.  Duke University Medical Center. Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Bioengenharia

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico para dimensionamento de nanopartículas de ouro em suspensão

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...