O financiamento para este trabalho foi fornecida pela Fondation Bettencourt Schueller em apoio da equipe de Paris Bettencourt iGEM. Agradecemos a unidade INSERM pesquisa U1001 e Chantal Lotton para a assistência técnica e aconselhamento. Fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP foi fornecida por Monica Ortiz e Drew Endy de Stanford.

1. Projeto e Construção de fagemídeo vetores Tendo sRNA silenciamento Cassetes <ol><li> De Novo Projeto de Srna silenciadas Cassetes 8 <ol><li> Identificar a sequência completa do mRNA a ser silenciado utilizando uma base de dados de sequência de ADN. Para gerar a sequência alvo, observar as primeiras 24 pb da sequência de codificação, a partir da posição 1-24 começando com o codão de início (por exemplo, ATG). Nota: O silenciamento é menos eficiente quando outros sites ou segmentos do mRNA são direcionados 8. </li><li> Leve o complemento inverso da sequência alvo para produzir a sequência de guia para a cassete sRNA. Ver Tabela 1 para exemplos de sequências alvo e guia para cloranfenicol acetiltransferase (CAT). </li><li> Para projetar a cassete completa expressão sRNA 292 bp, organizar o promotor PR, sequência GUIA, domínio HFQ proteína de ligação e sequências de terminação da transcrição T1 / TE em série (Tabela 2). </li><li> Adicionar sítios de clonagem adicionais de escolha para facilitar a clonagem da cassete de sRNA no vector alvo. </li><li> Obter a cassete completa sRNA através de síntese de genes comercial ou um método semelhante e cloná-lo em qualquer vector fagemídeo com uma origem de replicação f1 funcional 11. Consulte Informações de Apoio para a sequência completa do vector fagemídeo final. </li></ol></li><li> Alterando a sequência alvo de uma cassete sRNA expressão existente usando o Site baseado em PCR Directed Mutagênese 12 <ol><li> Identificar a sequência GUIA 24 pb em uma cassete de expressão sRNA existente. Nota: O plasmídeo pAB.001 anotada, utilizada neste trabalho, está disponível como um arquivo sequência suplementar. </li><li> Projeto iniciadores com regiões curtas de homologia com a cassete sRNA existente ladeando a nova sequência GUIA 24 pb para a frente e para trás. Obter os iniciadores através de síntese de oligonucleótidos comercial. Nota: o desenho de primers para a mutagénese dirigida é depicted na Figura 2. sequências molde de primers Exact são fornecidos na Tabela 3. </li><li> Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando o molde fagemídeo sRNA expressão. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. </li><li> Extrair e purificar o modelo de expressão fagemídico do sRNA 5 ml de cultura bacteriana utilizando um kit de miniprep de ADN ou método semelhante 12. </li><li> Prepare a duas reacções de PCR utilizando o modelo de fagemídeo sRNA expressão e de alta fidelidade da polimerase, um a frente e com um iniciador inverso com a (Tabela 4). Use As condições de PCR, tal como recomendado pelo fornecedor da polimerase (Tabela 5). Aumentar a concentração de molde de 10-50x maior do que um padrão de reacção para dar conta do facto de a reacção com uma única escorva não produz a amplificação exponencial. </li><li> Combinam-se as duas reacções de PCR acima num tubo de microcentrífuga. AnneaL os produtos por aquecimento até 98 ° C num banho de água a ferver. Imediatamente após a colocação do tubo de microcentrífuga no banho de água, remove a fonte de calor e permitir que o banho de voltar lentamente para a temperatura ambiente ao longo de 1-2 h. </li><li> Para eliminar a expressão fagemídeo modelo sRNA não mutada, adicionar 1 ul. enzima de restrição Dpnl para a mistura e incubar a 37 ° C durante 1 hora, ou o tempo recomendado pelo fabricante para a digestão completa. Nota: DpnI digere locais-alvo única metilados, que estão presentes em fagemï¿½eos replicados por host, mas não produtos de PCR. </li><li> Transformada adquiridos ou preparados 13 quimicamente competente E. coli com 1-5 ul do produto de PCR recozido. Isolar colónias individuais da estirpe transformada por plaqueamento selectivo em placas de agar LB contendo antibióticos apropriados. </li><li> Para verificar a incorporação da sequência de orientação correcta, o ecrã de colónias resultantes por PCR de colónias. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, collect uma pequena quantidade de células de uma única colónia transformada. Mark e preservar a colônia original para uso a jusante após a verificação. </li><li> Adicionar as células recolhidas a 50 ul de água isenta de nuclease num tubo de microcentrífuga. Misturar por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Usando um termociclador de bancada ou num banho de água a ferver, a lise das células por meio de aquecimento a 95 ° C durante 2 min. </li><li> Amplificar por PCR a região fagemídeo usando 1 ml de células lisadas termicamente, tal como um molde de ADN. As condições de PCR e protocolos termociclador são fornecidos nas Tabelas 6 e 7. Consulte o arquivo sequência pAB.001 suplementar para sequências de verificação de primers. </li><li> Sequenciar o produto de PCR para verificar a incorporação da sequência GUIA correta. </li><li> Inocular uma cultura de 5 ml da E. clone coli carregando o fagemídeo expressão sRNA verificou-sequência. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB. </li><li> Prepare um estoque de gliceroldo clone verificou-sequência. Adicionar 750 ul da cultura durante a noite a 250 ul de 60% de glicerol num tubo de crio com tampa de rosca. </li><li> Armazenar o estoque de glicerol a -80 ° C por tempo indeterminado. O restante da cultura durante a noite pode ser utilizada como uma fonte para a expressão fagemídeo sRNA no passo 2. </li></ol></li></ol> 2. Produção e Colheita de Stocks fagemídeo M13-embalados <ol><li> Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando a expressão fagemídeo sRNA. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. Nota: A expressão fagemídeo sRNA podem ser obtidas por meio da clonagem de novo, conforme descrito no passo 1.1.5, ou modificada a partir de um fagomídeo existente e colhido no passo 1.2.16. </li><li> Do mesmo modo preparar uma cultura de 5 ml de E. coli portadora do plasmídeo ajudante M13KO7. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB. </li><li> Extrair e purificar a expressio sRNAN fagemídeo e plasmídeo auxiliar utilizando um estojo de extracção de ADN ou método semelhante 12. </li><li> Cotransformar adquiridos ou preparados 13 de E. coli quimicamente competentes, com 1 ml de cada um dos sRNA fagemídeo expressão e plasmídeo ajudante. Selecionar para cotransformants por plaqueamento em agar LB com antibióticos seletivos para ambas as construções. </li><li> Prepara-se uma cultura de 10 ml de uma única colónia da estirpe de co-transformado em LB com os antibióticos selectivos. Incubar a 37 ° C com agitação durante 8-12 horas ou durante a noite. </li><li> Centrifugar a cultura a 3300 xg durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e filtra-se através de um filtro de 0,2 um. Cuidado: Em caso de derramamento de mídia, limpar a área com água sanitária diluída (0,5%) para destruir as partículas de fagos infecciosos. </li><li> Manter o filtrado fagemídeo embalados a 4 ° C. Nota: As amostras podem ser mantidas durante dias a semanas sem perda de actividade. </li></ol> 3. Preparação de células F + alvo para Silenciando <ol><li> Determinar se as células a serem direcionados para silenciar expressar a pilus F 14. Se o pilus F já está presente, vá para a etapa 4. Nota: cepas comuns laboratoriais de E. coli são anotados como F + ou M &#39;para indicar a presença do pilus F no seu genoma ou num plasmídeo. </li><li> Obter uma estirpe F + de E. coli, tais como TOP10F &#39;. Nota: Assegurar que a estirpe alvo transporta um marcador de resistência única, a fim de ser separado do doador de F-plasmídeo após conjugação. </li><li> Para introduzir F pilus por conjugação com uma estirpe F +, preparar 5 ml culturas de ambos a tensão alvo e doadores F-plasmídeo 14. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. </li><li> No dia seguinte, dilui-se ambas as estirpes 1: 100 em 5 ml de LB selectiva e continuar a cultura a 37 ° C com agitação. </li><li> Determinar a fase de crescimento das células medindo a optical densidade da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15. </li><li> Prepare reacções 3 Conjugação em tubos de microcentrífuga de: 0,5 ml de F-plasmídeo estirpe dadora + 0,5 ml de destino, 0,5 ml de F-plasmídeo dador + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo) e 0,5 ml de estirpe alvo + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo). Permitir que a conjugação prosseguir durante 2 horas a 37 ° C com agitação. </li><li> Placa de 100 ul de cada reacção de conjugação em agar selectivo LB com antibióticos específicos para o F-plasmídico (tipicamente tetraciclina) e estirpe alvo. Placa das reacções de controlo negativo para confirmar que nenhum doador ou estirpe receptora expressar ambas as resistências a antibióticos. </li></ol> 4. A infecção com fagemídeos embalado para Silenciando <ol><li> Inocular uma colónia única de células alvo F + em uma cultura de 5 ml de LB Medium com os antibióticos apropriados. Incubar durante a noite a 37 ° C com agitação. </li><li> No dia seguinte, diluir as células alvo M + 1: 100 em 5 ml de meio selectivo LB e continuar a cultura a 37 ° C com agitação. </li><li> Determinar a fase de crescimento das células medindo a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15. Nota: Expressão do pilus e infecção F eficiência é mais elevada na fase log. </li><li> Adicionar os fagemídeos M13-embalados (do passo 2.6) para as células alvo numa proporção em volume de 1: 100 para alcançar infecção quase 99% da população alvo. Permitir que a infecção prosseguir a 37 ° C com agitação durante 30-60 min. </li><li> Ensaio, o fenótipo sRNA silenciador de acordo com o método de escolha. Nota: Para uma proteína alvo fluorescente, o efeito de silenciamento pode ser quantificadadirectamente por fluorometria 10. Como alternativa, ensaios fenotípicos pode ser usado para observar as consequências fenotípicas de gene knockdown 8. </li><li> Prepare um estoque de glicerol para a sRNA expressando acolhimento fagemídeo seguindo os passos 1.2.14-1.2.16. Nota: o fagemídeo irá propagar na estirpe hospedeira indefinidamente e pode ser mantida com antibiótico semelhante a um plasmídeo convencional. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O presente método conseguido redução de 80% nos níveis de fluorescência mKate comparação com controles não direcionados. Isto está de acordo com outros métodos de knockdown de ARN, onde silencioso completo não é observada e eficiência 50-90% é típico 16,17. Ao nível fenotípica, knockdowns alvo-CAT foram capazes de atenuar significativamente a resistência ao cloranfenicol, e eliminá-lo sob algumas condições. O fenótipo knockdown foi detectável ao nível da população depois de apenas algumas horas após a infecção (Figura 3B). Isto ilustra uma característica importante de entrega à base de fagos: uma frequência alta knockdown pode ser obtida directamente na cultura em lotes, sem modificação genética antes. Ao contrário as modificações genéticas convencionais utilizando transformação ou plasmídeo de integração genómico, infecção fágica não exige que uma população ser re-cultivadas a partir de uma única colónia isolada. Isto permite que os efeitos da infecção por fagos para ser Explored em populações com dinâmicas espaciais complexos 11, com estruturas espaciais pré-existentes, como biofilmes 18, ou em populações naturais geneticamente mistos 19. Um passo crítico neste método é a produção de fagemídeo embalados em título elevado. A carga metabólica associada com a produção de partículas de fago pode conduzir a altas taxas de mutação ou perda do plasmídeo na estirpe de produção fagemídeo. Recomenda-se que a estirpe de produção fagemídeo ser cultivado directamente a partir de uma única colónia co-transformadas e não refrigerados, congelados ou sub-cultivadas antes da colheita de fagos. A baixa eficiência de co-transformação também pode ser observada quando se introduz o plasmídeo fagemídeo e ajudante para E. coli simultaneamente. Neste caso, as eficiências mais elevadas podem ser obtidos por transformação do plasmídeo auxiliar em primeiro lugar, em seguida, a preparação de células competentes que ostentam o plasmídeo ajudante para a subsequente transformação com o fagemídeo. Phainfecção gemid ou expressão sRNA também impõe uma carga metabólica detectável nas células alvo, e pode resultar em alguma perturbação fenotípica. Por exemplo, foi observada uma redução na fluorescência mKate2 mesmo quando as células foram infectadas com um fagemídeo segmentação CAT (Figura 3). A infecção com o M13 não é pensado para desencadear respostas de estresse sistêmico em E. coli 20, mas pode alterar os padrões de transcrição indiretamente. Alternativamente, os marcadores de resistência à ampicilina ou GFP incluídos no fagemídeo pode concorrer para recursos celulares, reduzindo a expressão e crescimento mKate2 9. Finalmente, a cassete de sRNA si pode alterar globalmente perfis de expressão de gene por titulação da proteína HFQ, ou por meio de silenciamento de ARNm para fora do alvo. Efeitos alvo Off são comuns em in vivo RNAi visando 21-23, mas eles ainda têm de ser sistematicamente investigada para este sistema. Uma limitação deste método é que a efi infecçãoeficiência é inferior a 100%, permitindo que algumas bactérias não infectadas para persistir na população. Os resultados deste trabalho e trabalho anterior 10 sugerem que as células não infectadas representam 1-10% da população final, e são responsáveis ​​pela maioria dos fenótipos nonsilenced observados. Uma variedade de rotas para a M13-resistência são conhecidos, com a perda mutacional sendo mais comum da expressão de pelos 24. À luz destas limitações, os controles devem ser utilizadas para confirmar a altas taxas de infecção e eficiência knockdown. Outra limitação potencial para algumas aplicações é a transferência ocasional de contaminação do fago auxiliar. Embora M13K07 contém um sinal de empacotamento mutado, pode ser empacotado em cápside do fago em baixa frequência e transferido para populações infectadas, o que resulta em células competentes para a produção de fagos e a propagação continuada de fago além do evento infecção inicial 25. Modificações para o fago auxiliar têm se mostrado eficazesa redução de embalagens não específica, embora às vezes com o custo de produção de fagos reduzida 26. Bacteriófago engenharia tornaram-se uma ferramenta indispensável para E. biologia sintética coli, permitindo a entrega rápida de novos genes de uma população crescente. Um trabalho recente produziu circuitos de comunicação intercelular 11 ou expressa fatores de transcrição para reprimir a resistência aos antibióticos vias 27. O protocolo aqui apresentado acrescenta a uma crescente coleção de ferramentas que permitem o controle da fisiologia bacteriana através de RNAs programados. Nucleases CRISPR-cas, quando sofre mutação para eliminar a actividade nuclease, foram mostrados para reprimir a transcrição de genes alvos guiados por RNA 17,28. Em contraste, sRNA silenciamento funciona ao nível da tradução e não requer a expressão de proteína exógena. biotecnologias da próxima geração podem se unir controle da transcrição e tradução, com entrega mediada por fago para programar pheno complexotipos em tempo real.

knockdowns de genes mediada por ARN de proceder em duas fases. Em primeiro lugar, uma molécula de RNA é introduzido a uma linha de célula ou organismo de estudo. Em segundo lugar, as proteínas de ligação a ARN endógenos facilitar o reconhecimento de ARN-alvo e produzir o efeito de silenciamento. Todas as tecnologias de ARN knockdown beneficiar da natureza personalizada de sRNAs sintéticas, que podem ser facilmente produzidos a corresponder a um alvo específico de interesse. No entanto, os detalhes moleculares de captação de ARN e silenciamento variam amplamente entre sistema modelo, restringindo onde e como knockdowns ARN pode ser aplicada. Em nemátodos, ARN de cadeia dupla moléculas (dsRNA) pode ser introduzido directamente nos meios de alimentação ou por os vermes com uma população de ARNcd-expressando E. células de E. coli 1,2. Em Drosophila, RNAi pode ser conseguida por microinjecção de embriões com três ARNcd, ou aplicada em linhas de células por simples adição de ARNdc para o meio de cultura quatro. Em linhas celulares de mamífero,sintéticos pequenos ARN interferentes (siRNAs) podem ser entregues a células vivas por electroporação 1,2,5, empacotado em lipossomas 3,6, ou expressas a partir de vectores de DNA do plasmídeo 4,7. Uma vez que as espécies de ARN atinge o citossol, a via de RNAi baseia-se no complexo RISC para processar ARNcd, anti-sentido de facilitar o reconhecimento do alvo, e catalisar a repressão de translação, a degradação de ARNm, ou a formação de heterocromatina, dependendo do hospedeiro. Devido a esses requisitos, clássica RNAi pode ser realizada apenas em organismos que ocupam RNA exógeno de forma eficiente e expressam RISC ou uma atividade RISC-like. Notavelmente, isto exclui o modelo bactéria E. coli, que não possui a via de RNAi. No entanto, os recentes avanços na biologia sintética fornecer as ferramentas para resolver tanto o problema da entrega eo problema silenciamento. Neste protocolo, as construções Srna estão expressos em E. coli a partir de um vector de ADN entregue a Living células utilizando o sistema de fagemídeo / ajudante M13. Um fagemideo é qualquer plasmídeo com uma origem F1 derivadas de fagos de replicação. Um plasmídeo auxiliar, neste caso M13KO, carrega toda a maquinaria necessária para a produção de partículas virais, mas não em si é competente para replicação e empacotamento. Quando um fagemídeo e o plasmídeo ajudante são co-transformada, o fagemídeo sozinho é replicada na origem f1, embalados e segregada. O fagemídeo vectorizado é então competente para infectar E. vivo coli através do pilus F. Neste sistema, o efeito silenciador é produzido por cassetes srna costume combinando uma sequência de suporte com uma sequência de ligação ao alvo. A sequência de ligação ao alvo é de 24 pares de bases anti-sentido a um ARNm alvo, normalmente no local de ligação ao ribossoma (RBS). A sequência de suporte, desenvolvido pela Na e colegas 8, contém um motivo de ligação HFQ extraído de MICC, um pequeno ARN de regulação endógeno para E. coli. A proteína HFQ estimula ARN-ARN binding e degradação do mRNA, que serve um papel neste sistema semelhante ao RISC em RNAi. A Figura 1 representa um esquema completo para knockdowns srna mediada por fago, incluindo a estrutura sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento. Como um método para modular a expressão do gene em E. coli, sRNA silenciamento é simples, rápida e versátil. A E. alvo coli não é sobrecarregado além de propagar o fagemídeo e expressando a sRNA. Isto pode ser relevante no contexto da biologia sintética ou pesquisa básica em que a expressão de construções heterólogas maiores podem forçar os recursos celulares 9. Os fagemídeos com novos alvos pode ser produzido com uma única PCR e colhido um dia depois da transformação fagemídeo. Finalmente, quase todo o mRNA podem ser alvo. A cassete de regulação sRNA (num plasmídeo padrão) foi mostrado para trabalhar sobre uma variedade de alvos no metabolismo com níveis de repressão típicos&gt; 90% 8. 10. Em primeiro lugar, um fagomídeo empacotado é introduzido a uma cultura em lotes de E. células de E. coli e utilizada para silenciar a expressão da proteína fluorescente mKate2. alterações de fluorescência subsequentes são monitorados em tempo real. Em segundo lugar, derrubar o gene CAT é mostrado para reduzir a resistência ao cloranfenicol fenotípica em placas de agar. Em ambos os casos, o próprio fagemídeo transporta um marcador GFP, permitindo que a taxa de infecção a ser medida independentemente da eficiência knockdown.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F&#039; Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

knockdowns mediada por RNA são amplamente utilizados para controlar a expressão do gene. Esta família de técnicas versátil faz uso de ARN curto (sRNA) que pode ser sintetizado com qualquer sequência e concebido para complementar a qualquer gene alvo para silenciamento. Porque sRNA construções podem ser introduzidas para muitos tipos de células, directa ou usando uma variedade de vectores, a expressão do gene pode ser reprimida nas células vivas sem modificação genética trabalhoso. O ARN mais comum tecnologia knockdown, a interferência de ARN (ARNi), faz uso da sequência de reconhecimento complexo de silenciamento (RISC) induzido por ARN para mediar endógena e a clivagem do ARNm alvo. Aplicações desta técnica são, por conseguinte, limitadas a organismos que expressam RISC, principalmente eucariotas. Recentemente, uma nova geração de ARN biotechnologists desenvolveram mecanismos alternativos para controlar a expressão do gene através de ARN, e assim tornada possível knockdowns de genes mediada por RNA de bactérias. Aqui nós descrevemos um método para silenciar genes expresSion em E. coli que funcionalmente se assemelha RNAi. Neste sistema, um fagomídeo sintético é desenhado para expressar sRNA, que podem concebidos para ter como alvo qualquer sequência. A construção de expressão é entregue a uma população de E. células de E. coli com o fago M13 não lítico, após o que é capaz de se replicar de forma estável como um plasmídeo. Reconhecimento de anti-sentido e silenciamento do ARNm alvo é mediada pela proteína HFQ, endógena para E. coli. Este protocolo inclui métodos para a concepção da sRNA anti-sentido, a construção do vector fagemídeo, o empacotamento do fagemídeo em bacteriófago M13, a preparação de uma população de células vivas para a infecção, e realizando a infecção em si. A proteína fluorescente mKate2 eo cloranfenicol acetiltransferase gene de resistência a antibiótico (CAT) são direcionados para gerar dados representativos e quantificar a eficácia knockdown.

Silenciamento de mKate2 fluorescência em meio líquido A Figura 1 representa o esquema para knockdowns sRNA mediadas descritos neste trabalho, incluindo a concepção sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento. Seguindo o protocolo 1.2, a cassete de silenciamento sRNA do plasmídeo pAB.001 foi alterada para segmentar mKate. A cassete sRNA foi sintetizado e clonado em fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP, um presente de Monica Ortiz e Drew Endy 11. Este fagemídeo transporta marcadores de expressão GFP e resistência à canamicina, permitindo que infecções de sucesso para ser rastreado. stocks fagemï¿½eos embalados foram preparados seguindo o protocolo 2. Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, marcador mKate2 cromossomicamente integrado foi preparado para a infecção do fago por conjugação<html> com uma estirpe de plasmídeo dador F seguinte protocolo de 3. As células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Após a infecção fagemídeo, 200 ul culturas foram transferidas para um leitor de fluorescência de placas e a fluorescência foi monitorizada continuamente durante 24 h. A Figura 3 mostra o efeito de silenciamento sRNA mediada por expressão em mKate2. A estirpe infectada com um fagemídeo anti-mKate2 não mostrou fluorescência mKate2 detectável sobre o fundo. Em contraste, esta estirpe expressaram o marcador GFP, indicando a absorção bem sucedida de fagemídeo. As células de controlo não infectadas produziu mKate2 fluorescência mas não GFP. Um controlo adicional, em que o domínio de direccionamento anti-mKate2 foi substituído com uma sequência de direccionamento CAT, não teve efeito sobre mKate2 fluorescência. Silenciamento de resistência ao cloranfenicol em placas de agar conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Seguindo o protocolo 1.1, uma cassete silenciar sRNA foi produzido para atingir CAT Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, cromossomicamente marcador CAT integrada estava preparado. infecção fágica por conjugação com uma estirpe dadora F-plasmídeo seguinte protocolo de 3. as células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Depois de 1 hora de incubação a 37 ° C, as células infectadas foram diluídas em série e plaqueadas a uma gama de concentrações de cloranfenicol. as placas foram incubadas durante a noite, e a proporção de células resistentes a cloranfenicol cada concentração foi determinada através da contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) no dia seguinte. A Figura 4 mostra o efeito de silenciamento mediado sRNA no fenótipo de resistência a cloranfenicol. As células não infectadas ou células infectadas com o fagemídeo de segmentação mKate2, eram resistentes acloranfenicol em todas as concentrações testadas. Em contraste, as células infectadas com o fagemídeo de segmentação CAT mostraram redução da sobrevivência em baixas concentrações de cloranfenicol, e cerca de 99% de morte em concentrações mais elevadas. A adição de ampicilina, para selecionar apenas as bactérias que levam o fagemídeo, reduziu a sobrevivência cloranfenicol a níveis indetectáveis. Isto é consistente com trabalhos anteriores mostrando que a fuga de infecção fágica é uma via comum para escapar silenciamento 10. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figura 1: silenciamento de genes em E. coli com sRNA cassetes de expressão entregue por fago M13 A cassete sRNA é composto por 4 módulos:. o promotor Pr (um promotor constitutivo obtido a partir do bacteriófago lambda), um domínio de direccionamento 24 pb, um domínio de ligação HFQ extraído de MICC e um terminador da transcrição de 8 </sup&gt;. A cassete é incorporado num fagemídeo tendo a origem de replicação e F1 de M13 empacotado no capsídeo M13 utilizando o fago auxiliar M13KO7. Fagomídeos acondicionados são capazes de infectar E. coli que expressam o pilus F, onde a expressão começa sRNA. O sRNA recruta então a proteína HFQ (representado em vermelho) e liga-se um alvo mRNA antisense perto do local de ligação ao ribossoma, resultando em repressão translacional e degradação do mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figura 2:. Desenho de primers e Site-Directed Mutagenesis da Site de destino sRNA Dois iniciadores foram concebidos com homologia parcial para uma cassete de sRNA existente. O iniciador directo contém 20 pb homólogo ao promotor do fotorreceptor na extremidade 5 &#39;, seguido pela24 pb representando a nova sequência de orientação, em seguida 18 pb homólogo ao domínio de ligação HFQ na extremidade 3 &#39;. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo, com as regiões de homologia com a cassete sRNA existente que flanqueia o complemento inverso da sequência de orientação novo. Sequências iniciadoras exactos são dadas na Tabela 3. Reacções separadas de PCR em uma única escorva com a frente e os iniciadores reversos produzir linear, ADN de cadeia simples com a sequência modificada desejada. Recozimento da frente e verso, produtos de reacção, após clean-up, conforme descrito no protocolo, resulta em DNA de cadeia dupla plasmídeo tendo a cassete sRNA modificado desejado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figura 3: Knockdown de um repórter integrado no cromossoma mKate2 fluorescente. E. coli MG1655 K12 expressar mKate2 foram ou não tratados (linhas vermelhas e bares) de esquerda, infectado com um fagemídeo anti-mKate2 (linhas verdes e bares), ou infectadas com um controle fagemídeo segmentação CAT (linhas azul e bares). (A) não tratada E. coli cresceu para densidades de saturação mais alta, indicando um custo metabólico à infecção fago. As linhas pontilhadas indicam os desvios-padrão de 3 repetições. (B) O sinal mKate2 foi reduzida para níveis próximos dos de fundo no anti-mKate2 tratada tensão, mas não em cepas de controle. Fluorescência (C) GFP, também transportado pelo fagemídeo, foi detectada apenas em controles de fagemídeo-tratada. (D, E) leituras de fluorescência final após 24 h de crescimento foram normalizados para OD. sinal de GFP, indicando infecção fagemídeo, estava ausente em controles não tratados, mas também substancialmente reduzida na sequência anti-CAT ptratamento hagemid. Isso pode indicar efeitos fora do alvo do fagemídeo. O sinal mKate2 foi reduzido por tratamento fagemídeo anti-mKate2 em comparação com controlos não tratados. O fagemídeo controle alvejado-CAT não mostrou nenhum efeito sobre mKate2 fluorescência. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown do CAT restaura a sensibilidade cloranfenicol a uma população geneticamente resistente E.. coli K12 MG1655 que expressa um gene de CAT integrado cromossomicamente foram deixados sem tratamento (barras vermelhas), tratou-se com um fagemídeo controlo segmentação mKate2 (barras verdes), ou tratados com um fagemídeo que expressa um anticorpo anti-CAT sRNA (barras azuis). Depois de 1 hr de infecção, a viabilidade na formiga indicadoibiotics foi avaliada por diluições em série e plaqueamento. Estirpes tratados com anti-CAT fagemídeo foram mortos de forma significativa (&gt; 90%) por cloranfenicol em concentrações mais elevadas, enquanto que os tratamentos de controlo não foram afectadas. A adição de ampicilina para as placas de cultura selecciona positivamente pela infecção fagemídeo e elimina as células não infectadas. Sob estas condições, não há colónias resistentes ao cloranfenicol foram observadas após o tratamento anti-CAT. Isto indica que a maioria dos sobreviventes representar uma falha de infecção, em vez de uma falha de silenciamento. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sequência alvo CAT </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> sequência GUIA DE CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Um exemplo TARGET e GUIA Sequence para o CAT Gene Nota a relação complemento reverso. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> promotor pR </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> GUIA sequência </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> domínio de ligação HFQ </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / terminador TE </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tabela 2:. componentes de seqüência da cassete sRNA Cada sequência é escrito 5&#39;-3 &#39;. A cassete completa é a concatenação destes 4 elementos em ordem e compreende 292 pb. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adiante Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> Primer reverso </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Iniciador desenho nos elementos de guia existentes Alter O iniciador de sentido directo inclui as últimas 20 pb do promotor PR, a nova sequência de orientação, e os primeiros 18 pb do domínio de ligação ao HFQ.. A sequência alvo é o complemento inverso da sequência exacta do GUIA. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> plasmídico molde </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 uM Primer </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> Polimerase de alta fidelidade (2 U / ul) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Tampão de PCR 5x </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> O volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Sugestão Condições de Single-Primer mutagênicos PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> A desnaturação inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 98 ° C </td><td> 10 seg </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 seg </td></tr><tr><td> extensão final </td><td> 72 ° C </td><td> 300 seg </td></tr><tr><td> Armazenamento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 5: Sugestão de Termociclador Protocolo para a Single-Primer mutagênicos PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> ADN molde </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 10 uM para a frente Primer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Iniciador inverso </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Taq Master Mix 2X </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> wate livre de nucleaser </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> O volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 6: Sugestão de condições para a sequência de Verificação PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> A desnaturação inicial </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> extensão final </td><td> 68 ° C </td><td> 300 seg </td></tr><tr><td> Armazenamento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 7: Sugestão de Termociclador Proprotocolo para a Sequência de Verificação PCR.

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K visualizações.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Bioengenharia

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Genética

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by pathogenic and virulent bacteria of the genus Leptospira, either by direct contact with the bacteria or indirectly by exposure to contaminated water or soil. Domestic and wild animals act as reservoir hosts of infection, shedding leptospires from colonized renal tubules of the kidney, via urine, into the environment. The generation of mutant strains of Leptospira is critical to evaluate and understand pathogenic mechanisms of infection. CRISPR interference (CRISPRi) has proven to be a straightforward, affordable, and specific tool for gene silencing in pathogenic Leptospira. Therefore, the methodological details of obtaining the plasmid constructs containing both dCas9 and guide RNA, delivery of plasmids to Leptospira by conjugation with the E. coli strain &#946;2163, and transconjugant recovery and evaluation, will be described. In addition, the recently described Hornsby-Alt-Nally (HAN) media allows for the relatively rapid isolation and selection of mutant colonies on agar plates.

Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Here, the application of CRISPR interference (CRISPRi) for specific gene silencing in Leptospira species is described. Leptospira cells are transformed by conjugation with plasmids expressing dCas9 (catalytically "dead" Cas9) and a single-guide RNA (sgRNA), responsible for base pairing to the desired genomic target. Methods to validate gene silencing are presented.

Aplicação de CRISPR Interference (CRISPRi) para Silenciamento genético em espécies patogênicas de Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Biologia

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1 
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA
Transduction is a form of genetic exchange between bacteria that utilizes bacteriophages, or phages, a class of virus that infects exclusively prokaryotic organisms. This form of DNA transfer, from one bacterium to another by way of a phage, was discovered in 1951 by Norton Zinder and Joshua Ledererg, who termed the process &#34;transduction&#34; (1). Bacteriophages were first discovered in 1915 by British bacteriologist Frederick Twort, then independently discovered again in 1917 by French-Canadian microbiologist Felix d&#39;Herelle (2). Since then, the structure and function of these phages have been widely characterized (3), dividing these phages into two classes. The first of these classes are the lytic phages which upon infection multiply within the host bacterium, disrupting the bacterial metabolism, lysing the cell, and releasing progeny phage (4). As a result of this anti-bacterial activity and the increasing prevalence of antibiotic-resistant bacteria, these lytic phages have recently proved useful as a substitute treatment for antibiotics. The second of these classes are the lysogenic phages which can either multiply within the host via the lytic cycle or enter a quiescent state in which their genome is integrated into that of the host (Figure 1), a process known as lysogeny, with the ability for phage production to be induced in multiple later generations (4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig1.jpg" /> 
Figure 1: Infection of host cell by bacteriophage. Adsorption by the phage to the bacterial cell wall via interactions between the tail fibers and receptor (purple). Once on the cell surface, the phage is irreversibly attached to the bacterial cell using the base plate (black) which is moved to the cell wall by the contractile sheath (yellow). Phage genome (red) then enters the cell and integrates into the host cell genome.
While bacterial transduction is a naturally occurring process, using modern technology it has been manipulated for the transfer of genes into bacteria in the laboratory setting. By inserting genes of interest into the genome of a lysogenic phage, such as phage, one is able to transfer these genes into the genomes of bacteria and consequently express them within these cells. While other methods of gene transfer, such as transformation, use a plasmid for gene transfer and expression, the insertion of the phage genome into that of the recipient bacterium not only has the potential to confer new traits to this bacterium, but also allows for naturally occurring mutations and other factors of the cellular environment to alter the function of the transferred gene.
Compared to other methods of horizontal gene transfer, such as conjugation, transduction is fairly flexible in the criteria required for donor and recipient cells. Any genetic element that can fit inside the genome of the phage being used can be transferred from any strain of donor bacteria to any strain of recipient bacteria as long as both are permissive to the phage, requiring the expression of necessary phage receptors on the cell surfaces. Once this gene is moved out of the donor genome and packaged into the phage, it can be transferred to the recipient. Following transduction, it is necessary to select for recipient bacteria that contain the gene of interest have to be selected for. This could be done by use of a genetic marker, such as a FLAG-tag or polyhistidine-tag, to mark the gene of interest, or the intrinsic function of the gene, in the case of genes that encode for antibiotic resistance. Additionally, PCR could be used to further confirm successful transduction. By using primers for a region within the gene of interest and comparing signal to a positive control, bacteria that has the gene of interest, and a negative control, bacteria that underwent the same steps as the transduction reaction with no phage. While bacterial transduction is a useful tool in molecular biology, it has and continues to play an important role in the evolution of bacteria, particularly with regard to the recent rise of antibiotic resistance.
In this experiment, bacterial transduction was used to transfer the gene encoding for resistance to the antibiotic ampicillin from the W3110 strain of E.coli to the J53 strain via the P1 bacteriophage (5). This experiment consisted of two main steps. First, the preparation of P1 phage containing the ampicillin resistance gene from the donor strain. Second, the transfer of this gene to the recipient strain by transduction with the P1 phage (Figure 1). Once carried out, the successful transfer of the ampicillin resistance gene could be determined by qPCR (Figure 2). If transduction was successful, the J53 strain of E. coli would be resistant to ampicillin, and the gene conferring this resistance detectable by qPCR. If unsuccessful, there would be no detection of the ampicillin resistance gene and ampicillin would still function as an effective antibiotic against the J53 strain.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig2.jpg" /> 
Figure 2: The confirmation of successful transduction by qPCR. By comparing the Cq values detected for the gene of interest from the transduction reaction and the negative control reaction, and normalizing these values against a housekeeping gene, one was able to confirm that bacterial transduction was successful.

Phage Transduction: Transferring Ampicillin Resistance in E. coli

Transdução fágica: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Avançada

Microbiologia

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

Plaqueamento de RNAi para alimentação de C. elegans: uma técnica para induzir a expressão de dsRNA alvo em E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em

Resumo

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