Name: producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).

1. cepas e plasmídeos
<ol><li>
Estirpes bacterianas
	<ol>
<li>Use a e. coli as estirpes BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20e BL21ΔABCF21. Consulte Tabela de materiais para mais informações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bacteriófagos
	<ol>
<li>Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com algumas gotas de clorofórmio (consulte a etapa 2.2). Para obter mais informações, consulte Tabela de materiais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmídeos
	<ol>
<li>Use os seguintes plasmídeos neste protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Como plasmídeos de controle, use pASK-IBA2 e pET22b (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condições de crescimento
	<ol>
<li>Propaga as bactérias em um lisogenia caldo (LB) médio25 com agitação vigorosa (180 – 200 rpm) a 37 ° C ou 30 ° C, no caso de tensões que contém pCP20 e BL21ΔABCF.</li>
		<li>Executar o plasmídeo curando a 43 ° C.</li>
		<li>Para um meio sólido, suplemento LB com ágar de 1% (p/v).</li>
		<li>Para ágar superior, suplemento LB com 0,7% agar e 10 mM CaCl2 e autoclave a médio. Use meio de SOC para a recuperação após electroporation26.</li>
		<li>Use as seguintes concentrações de antibióticos: 100 μg/mL para o Amp e 25 μg/mL para Kan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar um Phage lisado
<ol><li>
Infecção da estirpe dos doadores
	<ol>
<li>Crescer a tensão do doador JW4197 em 5 mL de LB suplementado com 10 mM CaCl2 e opcionalmente com Kan (25 µ g/mL) para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Medir o valor de600 OD usando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Fazer uma série de diluição de um stock de fago P1 existente no meio de LB: recomendado diluições são entre 10-3 a 10-7.</li>
		<li>Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje as misturas em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lisado preparação
	<ol>
<li>No dia seguinte escolha uma placa com um crescimento semi confluente de placas do fago. Em um prato semi confluente, aproximadamente metade da área de superfície da placa é evidente (Figura 3).</li>
		<li>Raspar a camada superior de ágar de tal uma placa usando um loop de inoculação ou uma ferramenta semelhante e coloque o ágar superior num tubo de centrífuga. Adicionar 1 a 2 mL de LB e uma gota de clorofórmio e vortex o tubo vigorosamente para ~ 1 min Add o clorofórmio em uma coifa.</li>
		<li>Centrifugar o tubo durante 15 minutos a 4.000 x g ou mais rápido para o agar e células bacterianas de Pelotas.</li>
		<li>Mova o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, evitando carregando ao longo de todos os restos da pelota. Adicione 2 gotas de clorofórmio e armazenar o lisado 4 e 10 ° c. Adicione clorofórmio em uma coifa. Não congele o fago lisado como isso irá resultar em uma redução significativa do número de partículas infecciosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação do título de lisado
	<ol>
<li>Cresce BW25113 em LB suplementado com 10 mM CaCl2 a 37 ° C até a cultura atinge uma OD600 ~ 1.0.</li>
		<li>Prepare uma série de diluição do fago lisado em LB (por exemplo, 10-6– 10-9). Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar a transferência de clorofórmio para as diluições.</li>
		<li>Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje a mistura em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>No dia seguinte contar o número de placas (regiões claras na esteira da bacteriana) por cada placa e calcular o título do lisado, usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> Exemplo: Em placas com as diluições 10-7, 10-8e 10-9, existem 231, 27 e 2 placas, respectivamente. Como 100 μL de cada diluição foi utilizado para a infecção, e porque o título é expresso como formadoras de placa unidades (pfu) / mL, o fator do chapeamento é 10. Estes números são inseridos na fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> Assim, o título é aproximadamente 2 x 1010 do fago infecciosas partículas/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 transdução
<ol><li>
Preparando as células destinatários
	<ol>
<li>Crescer o destinatário estirpe BL21ΔABCF em LB suplementado com uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use um espectrofotômetro para medir o valor de600 OD.</li>
		<li>Calcule o volume do fago lisado necessário para a realização de uma multiplicidade de valor de infecção (MOI) de 0,5. Para calcular o MOI, estime o número de bactérias baseada o OD600 da cultura. Suponha que um valor de600 OD de 1.0 corresponde ~ 109 UFC/mL. Calcule o volume necessário com base do título conhecido do lisado. Exemplo (com base do título calculado no exemplo após etapa 2.3.6): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>Adicione o CaCl2 para a cultura de estirpe destinatário a 10 mM e misture. Tome 1 mL da cultura para a transdução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizando a transdução
	<ol>
<li>Adicionar o volume apropriado do fago lisado a 1 mL de cultura destinatário (incluindo CaCl2 a 10 mM), conforme calculado no passo 3.1.2 e misture delicadamente. Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar transferir clorofórmio à mistura.</li>
		<li>Estaticamente, incubar a mistura por 20 min a 37 ° C.</li>
		<li>Pare a infecção pela adição de citrato de sódio, pH 5,5 a 100 mM.</li>
		<li>Centrifugar as bactérias (5.000 x g por 2 min) e remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda-los em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Lave as células mais duas vezes como na etapa 3.2.4 para garantir a remoção do fago livre e cálcio.</li>
		<li>Ressuspender as bactérias em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5. Incube a bactéria a 30 ° C, durante 1 h com agitação (> 100 rpm).</li>
		<li>Recolher as bactérias por centrifugação (5.000 x g por 2 min) e Resuspenda-los em ~ 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Espalhar as bactérias em uma placa LB suplementado com Kan a 25 µ g/mL e citrato de sódio de 10 mM, pH 5,5 e crescer a bactéria a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selecionando as transductants
	<ol>
<li>Uma vez que as colónias têm crescido na placa de seleção, restreak-los na LB + Kan para colônias única e crescer a 30 ° C até colônias única aparecem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. extirpando a gaveta de Kan
<ol><li>
A transformação com plasmídeo de recombinação
	<ol>
<li>Fazer o electrocompetent de estirpe BL21ΔABCF Kan-resistente.<ol>
<li>Crescer a tensão de uma única colônia em fresco LB (5 mL), suplementado com Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C até que o OD600 ~0.5-0,7.</li>
			<li>A partir daqui, execute as etapas a seguir a 4 ° C ou em gelo. Centrifugar as bactérias (5.000 x g durante 10 minutos) e remover o sobrenadante.</li>
			<li>Lave o centrifugado com água destilada gelada duas vezes, repetindo o passo anterior de centrifugação e, finalmente, resuspenda o pellet de células em 100 µ l de gelado 10% de glicerol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Arrefecer cubetas de eletroporação de 1 mm no gelo.</li>
		<li>Adicionar 1 pg de plasmídeo (pCP20) para a suspensão de eritrócitos, misture-os delicadamente a suspensão e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de refrigeração.</li>
		<li>Definir o electroporator para 1,8 kV e electroporate as células.</li>
		<li>Resgate de células transformadas, adicionando 1 mL de meio SOC e fazê-los crescer por 1h a 30 ° C.</li>
		<li>Placa de 100 µ l de células na LB + Amp placas e crescer as células a 30 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indução da recombinação
	<ol>
<li>Palheta simples colônias do LB + Amp placa e inocular fresco LB, omitindo todos os antibióticos.</li>
		<li>Crescem as células à temperatura não-permissivo (43 ° C) durante a noite para induzir a expressão de recombinase FLP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seleção de recombinantes
	<ol>
<li>Fazer diluições em série e 50 µ l de uma diluição de6 105-10 em placas não-seletivo da placa e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. verificação da exclusão Gene
<ol><li>
Verificação da perda do plasmídeo e recombinação de sucesso
	<ol>
<li>Colônia de raia única dos pratos preparados na etapa 4.3.1 na LB Kan, LB + Amp e placas LB sem antibióticos, nesta ordem. Para ajudar as estrias, usar uma grade de Colônia (ver arquivo complementar 1). Crescem as placas a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).</li>
		<li>Pegue 10 – 20 clones que têm crescido na placa não-seletivo, mas não conseguiram crescer na mídia seletiva para posterior verificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificação suplementar por PCR de colônia
	<ol>
<li>Realizar uma colônia PCR com primers flanqueando o tamA sequência de código (consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Prepare uma mistura PCR a mestre. A quantidade de mistura necessária depende do número de colónias a ser testado (Veja o exemplo na tabela 1). Misture os reagentes no gelo, adicionar o polymerase última.</li>
		<li>Homogeneizar a mistura de mestre de PCR e, em seguida, diluir 20 µ l em tubos de uma tira PCR. Pegue uma pequena quantidade de cada colônia para ser exibido usando uma ponta de pipeta estéril e adicioná-lo para um tubo. Lembre-se de incluir a estirpe de destinatário original para comparação. Opcionalmente, também inclua a estirpe do doador.</li>
		<li>Executar uma reação de PCR (ver tabela 2 para o programa utilizado).</li>
		<li>Prepare um gel de agarose a 1%.<ol>
<li>Para um gel 50 mL, medir 0,5 g de agarose e adicionar 50 mL de tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Aqueça a mistura em um forno de microondas até dissolver toda da agarose.</li>
			<li>Uma vez que a agarose dissolveu, arrefecer a solução para cerca de 50 ° C e adicione 5 μL de DNA coloração tintura. Misture a solução bem e despeje em uma bandeja de gel em uma câmara de fundição. Insira uma ou mais linhas de pentes bem assim há poços suficientes para todas as amostras, bem como marcadores de tamanho molecular. Permitir que o gel definir por 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uma vez concluída a execução PCR, adicione 4 µ l de 6 x tintura do carregamento de DNA de cada amostra. Colocar o gel na câmara de eletroforese e adicionar tampão TAE até os poços estão cobertos.</li>
		<li>Aplica 10 a 15 µ l de cada reação de PCR para um poço no gel. Também Adicione 5 µ l de um marcador de tamanho molecular. Em seguida, execute o gel por 30 min a 75 V.</li>
		<li>Uma vez concluída a execução, o gel usando um gerador de imagens de luz azul da imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. outras técnicas
<ol><li>
Expressão da proteína Nota: A expressão de proteínas de teste (YadA e EibD) tem sido descrito em detalhe em outro lugar,23,24. Este é um breve resumo das principais etapas.<ol>
<li>Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with os necessários plasmídeos (YadA-pIBA2 e pEibD10 e os correspondente plasmídeos de controle) e selecione para transformants na LB + Amp.</li>
		<li>Para a expressão da proteína, inocular 100 mL de meio LB + Amp 1ml da cultura de bactérias transformadas durante a noite e crescer estas a 30 ° C até a fase log de mid, momento em que, induzir a produção de proteína com qualquer anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) ou thiogalactoside isopropílico (a 0,5 mM).</li>
		<li>Depois de 2h de indução a 30 ° C, medir a turbidez das culturas e coletar um número de células, correspondente a 50 mL no OD600 = 1.0 por centrifugação as culturas por 15 min a 4.000 x g. Lave o pellet 1x com 10 mM HEPES, pH 7,4 e em seguida ou armazená-lo a-20 ° C ou processo etapa 6.2 ainda mais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de membrana externa Nota: Extração de membrana externa é realizada conforme descrito em detalhe por Leo et al . 27. as principais etapas estão resumidas a seguir.<ol>
<li>Ressuspender o pellet de células em 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, suplementado com 10 mM MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e uma pitada de DNase eu.</li>
		<li>Lise as células (por exemplo, usando um batedor do grânulo).</li>
		<li>Centrifugar as células em breve (2 min a 15.600 x g) para remover os detritos celulares e mover o sobrenadante para um tubo de fresco.</li>
		<li>Centrifugar as células por 30 min a 16.000 x g, após o qual, resuspenda o pellet em 400 μL de 1% N-lauroyl sarcosina em 10 mM HEPES, pH 7,4.</li>
		<li>Incube as celulas com agitação por 30 min à temperatura ambiente, após o qual, centrifugue-los durante 30 min como acima.</li>
		<li>Lave o translúcido da pelota 1x com 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspenda-lo em 30 μL de 10 mM HEPES e adiciona 10 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 4x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaios de atividade Nota: Realizar ensaios de SDS-PAGE e atividade para YadA e EibD como descrito28. As principais etapas estão resumidas a seguir.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Aquece as amostras a 50 ° C por 5 min antes de carregá-los em um gel de poliacrilamida, para evitar a desnaturação das proteínas.</li>
		<li>Após a separação em SDS-PAGE, transferi as proteínas para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno.</li>
		<li>Após a transferência, bloquear a membrana com pó de leite desnatado 2% em PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Borrão do extremo-oeste YadA-colágeno
	<ol>
<li>Após o bloqueio, adicionar tipo de colágeno bovino que diluído em tampão de bloqueio a uma concentração de 10 μg/mL e incubar a membrana por 1h.</li>
		<li>Lavar a membrana 2 x com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Adicione o anticorpo primário (anticorpo monoclonal anticolágeno COL-1) para a membrana, 1:2,000 diluído em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Após a incubação da membrana por 1h, lave 2x como mencionado na etapa 6.3.2.2 e em seguida, adicione o anticorpo secundário [conjugado de peroxidase (HRP) de rábano-IgG de anticabra rato], 1:10,000 diluído em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 vezes com PBS-T. Adicionar um substrato quimioluminescente reforçado para a membrana de acordo com as instruções do fabricante e detectar a banda usando uma câmera CCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG ensaio
	<ol>
<li>Após o bloqueio, adicione um anticorpo secundário (de cabra anticoelho HRP), diluído 1:2,000 em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 x com PBS. Execute a detecção quimioluminescente como mencionado na etapa 6.3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem método...

Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.
Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).
Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Wild-type strain of Keio collection</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Expression strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derived from BL21(DE3)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 &lt;em&gt;vir&lt;/em&gt;</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Generally transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>conditionally replicating plasmid with FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of EibD; plasmid available on request</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of YadA; plasmid available on request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagen type I antibody COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Bovine collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA dye</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA molecular size marker</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrate</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl thiogalactoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; forward primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-GAAAAAAGG&lt;br /&gt;ATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-TCATAATT&lt;br /&gt;CTGGCCCCAGACC-3&#039;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis chamber</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Bead beater</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubating shaker</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Wet transfer unit</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF:
A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF21. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana extern...

Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

17.0K visualizações.  University of Oslo. Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Vídeo: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Bioengenharia

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genética

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Quantificação da resistência aos antibióticos mediada por plasmídeos em uma abordagem de evolução experimental

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imunologia e Infecção

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biologia

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Quantificação da resistência aos antibióticos mediada por plasmídeos em uma abordagem de evolução experimental

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias

Do genoma deleções de genes em

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Geração de

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em