Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.

NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma. 1. Disposição Construção <ol><li> Glicanos Preparação e configuração da placa <ol><li> Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%. </li><li> Prepare as amostras de glicano. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) são para ser diluída para 100 ug / ml em tampão de impressão. step1.1.1 monovalentes glicanos,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) para 100 uM em tampão de impressão a partir do passo 1.1.1. Finalmente, preparar as tinturas funcionalizado com amina, para usar como marcadores de grade / luzes de pouso. manchas de marcador corante são impressos em 1? M. NOTA: Atto488-NHS corante é usado em nossas impressões. No entanto, qualquer corante funcionalizado com amina, legível pelo scanner de slides é apropriado para esta finalidade. </li><li> Transferir 10 uL de cada amostra de glicano para placas de microtitulação de 384 poços, utilizados para o robô de impressão. Armazene glicanos não utilizados em solução tampão de impressão a -20 ° C em tubos selados. Tansfer 10 uL do marcador de corante para a placa de impressão. </li></ol></li><li> Impressão NOTA: Todos steps que a preocupação de tocar ou mover os slides devem ser feitas com luvas. <ol><li> Coloque arrayer pins na cabeça de impressão de acordo com a configuração correta do layout. Para este layout usar um pin para imprimir todas as amostras e matrizes. Imprimir os glicanos em blocos de seis, saltando um recurso (uma característica é definida como único local de um determinado composto), de cada lado, de tal modo que os pontos de uma mesma amostra não são impressos exactamente ao lado do outro. NOTA: O usuário final deve decidir a configuração. </li><li> Retirar as lâminas de sacos, caixas abertas, e remover quaisquer partículas de poeira ou pequenos pedaços de plástico que podem ser em suas superfícies por gás nitrogénio ultra-alta pureza em cada slide. Coloque o número desejado de slides, o lado revestido para cima, no palco arrayer. </li><li> Programa do arrayer, usar os parâmetros de 27 pontos por visita para a placa de fonte, usando 3 &quot;pré-spots&quot; em lâminas revestidas com poli-L-lisina, para remover o excesso de líquido na ponta dos pinos de impressão <ol><li> Ligue MPU (Unidade de Alimentação Principal) e Unidade de Controle do Clima. O software de análise Tiling aberto no computador. </li><li> Escolha um layout para a impressão. Selecione Opções → Ferramenta Pin para ser usado para imprimir a matriz 1 x 1 ferramenta de impressão - 1 único pino. Selecione a guia de destino → Matriz Ferramenta Definição → Print Pattern e adicione o pitch (ponto-a-ponto à distância), o número de linhas e colunas para acomodar as amostras a ser impresso, e o padrão de impressão das amostras (para essa matriz de 8 x 8 padrão de impressão é usado em 340 relvado mm para 7 amostras totais). </li><li> Selecione Alvo → Layout de slide e programar a distância de bloco-a-bloco para permitir a impressão de cada matriz replicar para o modelo de slide de 48 poços (4 x 12). Selecione Fonte e adicione o número de captadores de origem (1 para cada amostra quando se usa um pin) (para esta cópia 7 captadores de origem será usado para acomodar 6 poços de amostra e um marcador de corante bem). NOTA: O diálogo fonte deve ficar verde para mostrar que o númerodas visitas de origem coincide com as amostras a serem impressas no padrão de impressão. </li><li> Selecione Alvo → Adaptador de Placa e Layout de slides e ajustar o número de slides (5 slides são impressos em uma hora para esta cópia com 1 slide pré-manchas). </li><li> Solte a bandeja clicando no botão T1 para ativar a bandeja e adicionar o número desejado de lâminas para a bandeja, prestando muita atenção aos locais de slide pré-spotting (azul) e lâminas &quot;reais&quot;. </li><li> Coloque lâminas de vidro lisos em todas as portas de vácuo restantes para bloquear a vácuo e clique em OK para ativar o vácuo. Verifique se todos os slides são mantidos no lugar e clique em OK para retornar a bandeja para a posição inicial. </li><li> Coloque a chapa de impressão no suporte da placa e garantir a cremalheira está definido corretamente no lugar. Clique GO e permitir que o processo de impressão para continuar. </li></ol></li><li> Imprimir os restantes 24 pontos em repetições de 6 pontos por matriz (4 matrizes / visit Fonte). </li><li> Carregar as placas de 384 poçosna impressora e começar a imprimir. Manter a humidade relativa, durante a impressão, em toda a impressão entre 55 e 65%. A impressora pára após a impressão 5 slides. NOTA: Enquanto o microarray neste ensaio é impresso em um 8 x 8 padrão específico, os robôs impressão microarray diferentes exigirá equipamento de programação específica para atingir o layout desejado. Cabe ao usuário final para determinar o padrão mais adequado tendo em conta as especificações dos seus equipamentos. </li></ol></li><li> Umidificação / Imobilização NOTA: Uma vez que as lâminas de terminar a impressão, eles passam por uma etapa de imobilização temporária, também chamado de umidificação. Umidificação pós-impressão ajuda a homogeneizar o anexo amostra por re-molhar as manchas e garantir bloqueio completo. <ol><li> Colocar as lâminas em uma câmara de humidade a 100% imediatamente após a impressão durante um período de 30 min. Construir a câmara de colocação por toalhas de papel molhado muito plana no fundo de um prato de vidro grande, colocando os diapositivosem algum tipo de rack, tal como um suporte de tubos de ensaio, de impressão voltada para cima, e selagem com filme plástico para prender a umidade. </li><li> Número desliza com um / pen álcool resistentes a solventes marcação e armazenar em uma caixa de dessecação. Desidratar durante a noite. </li></ol></li><li> Numeração, bloqueio e armazenamento <ol><li> Prepara-se o tampão de bloqueio - etanolamina 50 mM em 50 mM de tampão de borato. Primeiro, dissolver o ácido bórico, em ddH2O, a uma concentração final de 50 mM num frasco contendo uma barra de agitação magnética. Agita-se a solução vigorosamente numa placa de agitação até todo o sólido se ter dissolvido. Enquanto agitação constante, adicionar a quantidade apropriada de etanolamina a partir de uma solução estoque de 16,54 H até atingir a concentração de 50 mM desejado. Adiciona-se hidróxido de sódio concentrado para ajustar para um pH final de 9,2. </li><li> Mergulhar os slides impressos na solução tampão de bloqueio durante 1 h. </li><li> Seguindo 1 hora, lavar as lâminas em ddH2O para remover qualquer vestígio de excesso de tampão de bloqueio.Descarte tampão de bloqueio em um recipiente adequado de lixo. </li><li> Transferir as lâminas para suportes de vidro para coloração e spin seco. matrizes secas, colocando-os numa centrífuga equipada com suportes de placa oscilante, a uma velocidade de 10 xg durante 5 min. </li><li> Uma vez que as lâminas são secas, elas podem ser incubadas imediatamente ou armazenado. condições de armazenamento: -20 ° C em um saco plástico selado. </li></ol></li></ol> 2. Analisando glicano Proteínas de Ligação <ol><li> Preparar uma câmara umidificado em que as matrizes para ser hibridizado vai caber. Uma câmara simples consiste em um pirex, mergulhado no fundo com toalhas de papel umedecido e um rack, sobre a qual os slides vai descansar. </li><li> Use lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) e CEA (Erythrina aglutinina cristagalli) a 10 ug / ml + 2 ug / ml de estreptavidina-555 de corante, em sondagem de tampão (PBS + 0,01% Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, neste exemplo), o usouma concentração de partida de 20? g / ml pré-complexada, como previamente descrito 34. Resumidamente, fazer uma HA: Rato-α-Strep: mistura cabra-α-murganho Alexa647 em tampão de bloqueio (PBS + BSA a 3% + 0,01% de Tween-20), numa proporção de 4: molar de 1: 2. NOTA: O array é sondado com lectinas para verificar que glicanos são imobilizados e detectável (Figura 1B). </li><li> Transferir a solução de proteína-anticorpo de ligação de glicano mistura de 20 ul de uma placa de 384 poços e incubar em gelo durante 30 min. Seriadamente diluídas amostras de lectina e HA 1: 1, na sua tampão apropriado, 8 vezes, por mistura de 10 ul de amostra com 10 ul de tampão. </li><li> Pipeta 8 ul da amostra para a superfície de micro-poços e incubar na câmara de humidificação selada (100% de HR) durante 90 min. </li><li> Lavam-se as lâminas de um de cada vez, mantendo as bordas e mergulhando-os quatro vezes em uma mistura de PBS e Tween a 0,05%, em seguida, quatro vezes em PBS, e, finalmente, quatro vezes em H 2 O. desionizada utilizaçãoo mesmo protocolo de secagem descrito no passo de bloqueio, as matrizes girar secar numa centrífuga durante 5 min a 10 x g. </li></ol> 3. Análises de digitalização e de dados NOTA: Os microarrays de glicano podem ser digitalizados em configurações diferentes, dependendo do fabricante do scanner microarray. Ao variar a potência do laser e da resolução, o instrumento pode produzir uma imagem com tantos sinais quanto possível dentro de sua faixa dinâmica (Figura 1C). <ol><li> Use um scanner de slides fluorescente e digitalizar as matrizes imediatamente após a incubação com as proteínas de ligação de glicano. Tome cuidado para garantir a lâmina está correctamente inserida no instrumento de varredura. <ol><li> software de digitalização aberta. Clique em Iniciar para abrir o programa. Conectar-se a scanner: Scanner → Connect ou botão verde no menu do painel de navegação Scanner. </li><li> porta autoloader aberta do scanner. Colocar as lâminas em ranhuras no carregador automático, a fim específico. Feche a porta carregador automático. Click &quot;ler loader&quot; no painel Ferramentas de navegação para detectar automaticamente os slides no scanner. </li><li> Ajuste o parâmetro de verificação: parâmetros Scanner → digitalização apropriadas para o experimento (por exemplo, 635 potência do laser de alta, o ganho de detecção de 50%). Digitalizar slides: Scanner → digitalização. Selecione caminho, criando uma pasta para guardar as imagens de varredura e nome scans individuais. Faça isso antes da digitalização real. Repita para cada slide individual. Clique em OK para iniciar a digitalização. </li></ol></li><li> Use o software do scanner para configurar o instrumento e digitalizar os slides. Definir scanner para digitalizar de forma iterativa em baixa potência laser (5 mW) com o aumento ajustes de ganho de 25%, 50% e 75%. NOTA: As configurações podem ser testadas e otimizadas, mas tenha em mente que cada varredura pode eventualmente diminuir a saída de fluorescência dos corantes devido à fotodegradação. <ol><li> aquisição de dados aberto e software de análise, tais como software Mapix. Clique em Iniciar para abrir o programa. Abrir varredura imagem: Arquivo → im abertoidade. Abrir arquivo GAL: Analisar → grade aberta e selecione o arquivo GAL apropriado. </li><li> Entre no modo de blocos: Modo de imagem → blocos para mover o grid. Use os marcadores de grade para definir a rede para o local apropriado no slide. Ajustar os blocos individuais conforme necessário para coincidir com a matriz impressa. </li><li> Entre no modo de pontos: Imagem → Modo de pontos para ajustar localização eo tamanho de pontos individuais dentro do bloco. Uma vez que todos os blocos e os pontos são ajustados e no lugar, intensidades de sinal medida pelo Analisar cálculos fotométricos →. Salve o arquivo de saída. </li></ol></li><li> Uma vez que os slides a digitalização é concluída, as imagens são analisadas para sinais de ligação com o programa de processamento de imagem instalado (Figura 1D - G). Para análise de imagem, carregar um arquivo GAL (Lista Array) sobre a imagem TIFF digitalizada. NOTA: O arquivo GAL contém o padrão de layout de local e as identidades de cada local local. arquivos GAL para matrizes são created pelo software da impressora usando um arquivo de texto delimitado por guia que contém a identidade das amostras e sua localização na placa de fonte de 384 poços. </li><li> Use a grade luzes marcador / desembarque impressas nas microarrays para colocar adequadamente a grade GAL. pontos individuais podem precisar de ser movido de forma individual, mas uma matriz bem impresso será geralmente permitir que os blocos dentro da grade para ser colocado com facilidade. Após a colocação do grid, recolher intensidades local pelo software e salva como um arquivo de texto delimitado por tabulação (.txt). <ol><li> Usando programa de planilha, abra o arquivo a partir do scanner de saída. Abra o arquivo de macro apropriado a partir da localização da pasta. Clique em Exibir → Macro → RunMacro. NOTA: A pré-escrito irá copiar os dados de saída matérias, remover linhas e colunas desnecessárias, classificar os dados por amostra, calcular os valores médios média de fundo menos sinal e traçar os valores resultantes para uma planilha do spread-folha que contém os gráficos para cada dos seis SAMPles testado na matriz. </li></ol></li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+(H1N1)+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray.">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li><li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins.">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses.">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread.">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarray+technologies:+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses.">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus:+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions.">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A(H3N2)+virus+hemagglutinins.">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity.">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especifi...

aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano. IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelope. HA se liga a ácidos siálicos, enquanto que NA é a enzima destruidora de receptor na outra extremidade do ciclo de vida viral e cliva o ácido siálico 2. Todos os vírus que infectam humanos, incluindo H1N1, H2N2 e H3N2, têm uma origem aviária 3. Durante as duas últimas décadas vários aviários para os crossovers humanos ocorreu, com o H5N1, H7N7 e H7N9, sendo o mais conhecido; However, outros subtipos de ter infectado seres humanos mais esporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Felizmente, parece que nenhum destes vírus têm sido inteiramente capaz de se adaptar aos receptores do ácido siálico ligado a α2-6-tipo humano 5-8. Adaptação do vírus zoonóticos aviária ou de outros para acomodar a replicação e transmissão em hospedeiros humanos poderia ter um efeito devastador sobre a saúde humana. Portanto, o conhecimento prévio de como esses vírus estão evoluindo para se ligar receptores do tipo humano ajudará a vigilância mundial do vírus da gripe emergentes. Determinação da preferência receptor foi elucidada primeiro usando eritrócitos de diferentes espécies e continua a ser um ensaio favorecida entre os pesquisadores da gripe 9-12. A demonstração de que os vírus aviários reconhecer ácido siálico α2-3 e vírus humanos α2-6 ligados ácido siálico foi originalmente baseado em um ensaio utilizando hemaglutinação de eritrócitos enzimaticamente modificados para conter cada uma das linkages 13,14. Embora a leitura é hemaglutinação, um ensaio padrão para virologistas, as estruturas de glicano subjacentes não são definidos, a única ligação terminal. Além disso, a disponibilidade limitada das sialiltransferases, utilizados para re-sialilar as células, têm limitado a utilização deste ensaio 15-18. Subsequentemente, outros métodos de determinação das preferências de ligação ao receptor foram introduzidos usando estruturas de glicanos sialilados, ligado a poli-acrilamida (PAA) ou estruturas poli-glutamato (PGA) nos ensaios baseados em placa 19,20. Diversas variações são possíveis tanto no revestimento os glicanos vírus ou a placas de microtitulação, cada um dos quais resulta em um ensaio de ELISA de tipo robusto, fiável e muito sensível 21-23. Alternativamente, glicanos ligados em biotina pode substituir PAA / PGA e podem ser conjugados com placas revestidas com estreptavidina 2,24. Embora alguns soros específicos podem ser necessários, ELISAs estão glicanos padrão e vários ligados ao PAA são prontamente commercially e não comercialmente disponível (Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org)). Tecnologias de microarray glicano surgiram como uma ferramenta valiosa para determinar a especificidade de receptor, como vários glicanos diferentes são vistos, e ligação a uma grande variedade de estruturas diferentes pode ser avaliada dentro de um único ensaio 25-29. A ligação dos IAV para estas estruturas fornece uma melhor compreensão das estruturas de glicano que IAV reconhece preferencialmente 30-33. microarrays de glicano requerem pequenas quantidades de volume de amostra para efectuar um ensaio de ligação e utiliza apenas quantidades diminutas de glicano por ponto (2 nl). No entanto, estas matrizes são normalmente utilizados apenas para avaliar a especificidade dos receptores de glicanos. Análise de vários vírus, ou proteínas de hemaglutinina, em vários intervalos de concentração pode ser proibitivo devido ao número de lâminas necessárias. Além disso, até à data, nenhum ensaio de avidez relativa foi desenvolvido usando ar glicanotécnicas de raios. Para combinar a exigência de baixo amostra proporcionada por técnicas de microarray de glicano e a sensibilidade dos glicanos ligados em PAA em ensaios baseados em ELISA, procurou-se desenvolver uma matriz de glicanos multi-bem que iria permitir a análise de alto rendimento com resolução semelhante ou melhor, em comparação para o ensaio tradicional baseado em ELISA. Simultaneamente, queríamos minimizar a quantidade de produtos biológicos e químicos repórter consumidos. O resultado final é um ensaio de avidez miniaturizado, desenvolvido especificamente para o controlo e especificidade IAV é igualmente aplicável à avaliação de outras proteínas de ligação de glicano. Usando uma lâmina de vidro separada em 48 micro-poços por uma máscara de Teflon, 6 glicanos diferentes são vistos em 6 réplicas por poço. A plataforma de microarray ofereça as mesmas tendências na ligação ao receptor visto no formato macro ELISA com várias vantagens. Estas incluem: (I) a impressão de composto em 6 repetições, utilizando amostra mínima, contra o revestimento de várias linhas iplaca na, usando 100 ul por poço; (II) vários compostos diferentes analisados ​​simultaneamente num único poço, incluindo os controlos; (III) a uma redução maciça no volume de incubação e; (Iv) uma gama dinâmica maior utilizando uma leitura fluorescente. Uma única lâmina pode ser calculada como sendo equivalente a 18x placas de 96 poços. Com o protocolo seguinte, qualquer laboratório capaz de fabricar e análise manchada microarrays deve ser capaz de fabricar este formato de ELISA miniaturizado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NEXTERION&#174; Slide H MPX-48&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1091525</td>
			<td>Microwell slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScanArray Plus&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>-</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroGrid II&#160;</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>-</td>
			<td>microaray printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1305&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1145&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Strep Antibody</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1509-001&#160;</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Alexa-647</td>
			<td>Life</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287&#160;</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-basic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mono-basic Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229903&#160;</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-l-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920&#160;</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>493546</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>incubation/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMP4B pins</td>
			<td>Telechem</td>
			<td>SMP4B</td>
			<td>printing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Nitrogen (Grade5)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>general dusting/drying tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9508-500ML</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 488</td>
			<td>AttoTec</td>
			<td>AD 488-91</td>
			<td>Gridmarker on array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA368</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA362</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA343</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te98</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te175</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te176</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microtiter plate</td>
			<td>Matrix TechCorp</td>
			<td>4361</td>
			<td>Printing plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR lab marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-150</td>
			<td>Slide Numbering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton slide staining dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z103969-1EA</td>
			<td>Blocking and Drying</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a miniaturized glycan microarray assay for assessing avidity and specificity of influenza a virus hemagglutinins

Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados ​​vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.

Impressão, digitalização e análise de dados Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisi...

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A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.9K visualizações.  The Scripps Research Institute. Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Vídeo: A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.