Name: measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay
Uploaded: 2016-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Todos os vírus recombinantes vivos com componentes aviárias devem ser tratadas usando nível de biossegurança 2 (BSL2) práticas Enhanced em um laboratório aprovado para uso pelo Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) e da comissão de biossegurança institucional. 1. Preparação de Material de Partida e Reagentes Nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter a fonte de todos os reagentes. <ol><li> Placas revestidas com fetuína <ol><li> Preparar tampão de revestimento por mistura de 10 ml de 10x tampão de revestimento com 90 ml de H2O desionizada </li><li> Prepara-se uma solução estoque de fetuina a 25 mg / ml em tampão de revestimento 1x e armazenar em alíquotas de 500 uL a -20 ° C. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de fetuina (25 ug / ml) imediatamente antes de placas de revestimento por diluição da solução stock de 1000 vezes em 1x tampão de revestimento. </li><li> Usar uma pipeta de canais múltiplos para dispensar 100 ul da solução de trabalho de fetuína para all poços de uma placa de 96 poços que tem elevada capacidade de ligação de proteína. </li><li> Cobrir cada placa com o selador de placa, em seguida, empilhar as placas em grupos de 10 e envolvê-los em papel alumínio. </li><li> Colocar as placas num frigorífico (2-8 ° C) durante pelo menos 18 horas antes de executar um ensaio. Nota: As placas podem ser revestidas com antecedência e guardadas com a solução de revestimento a 2-8 ° C durante até 2 meses. </li></ol></li><li> diluentes <ol><li> Para preparar o diluente para fazer diluições de vírus e de amostra (2- (N-morf olino) etanossulfónico (MES), pH 6,5, CaCl 2 20 mM, 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Tween 20), 94,2 ml de misturar 1X MES, pH 6,5 com 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% de BSA e 0,5 ml de Tween 20. </li><li> Para preparar o diluente para PNA-HRPO (MES, pH 6,5 com 20 mM de CaCl2 e 1% de BSA), mistura 94,7 mL de 1x de MES, pH 6,5 com 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml) e 3,3 ml 30% de BSA . </li></ol></li><li> Neuraminidase (NA) Nota: H6Nx reass vírusortants (estes têm HA de H6 subtipo ea NA de interesse), são gerados seguintes métodos publicados 5,10. Solicitar frascos de vírus recombinante inactivada de um colaborador se eles não estão disponíveis em casa. Quando se utiliza vírus inactivado, confirmar que a preparação é apropriada para utilização na ELLA através da demonstração de que o processo de inactivação não têm um impacto significativo sobre a actividade de NA. <ol><li> Cultura um estoque de vírus H6Nx em ovos de galinha embrionados 11 e armazenar alíquotas de 0,5 ml de líquido alantóico puro à temperatura de -80 ° C. </li><li> Use uma nova alíquota de vírus para cada ensaio. Não congelar e descongelar as alíquotas. </li></ol></li><li> As amostras de soro e Controles <ol><li> Calor-inactivar todos os soros (por exemplo, amostras de ensaio, os soros pré-vacinação e pós, bem como controlos, por exemplo, com a amostra conhecida título NI) num banho de água a 56 ° C durante 45-60 min. Armazenar o soro a -20 a -70 ° C antes ou depois do tratamento térmico. Se o SAMPles estão a ser testado várias vezes, fazer várias alíquotas antes do congelamento de modo que a amostra não é repetidamente congeladas e descongeladas. </li><li> Use o ELLA para medir os títulos NI de soros humanos que estão disponíveis em quantidade suficiente (&gt; 5 ml) para identificar pelo menos um com baixo título e outro com um título elevado. Armazenar aliquotas de 100 ul como ≤-20 ° C, de modo que a mesma amostra pode ser utilizado como um controlo em muitos ensaios, a fim de controlar o desempenho do ensaio. </li></ol></li><li> Aglutinina de amendoim (PNA) de rábano peroxidase (HRPO) <ol><li> Prepara-se o diluente PNA-HRPO (MES, pH 6,5 com CaCl2 e 1% de BSA). </li><li> Prepara-se uma solução estoque de PNA-HRPO dissolvendo 1 mg de PNA-HRPO em 1 ml de diluente. Armazenar 20-200 mL alíquotas a -20 ° C. </li><li> Antes de utilizar um novo lote de PNA-HRPO, teste 1: 500, 1: 750, 1: 1000 e 1: 2000 diluições deste reagente para identificar a quantidade que resulta em OD máximo com o controlo positivo (vírus só) e um fundo ( nenhum vírus) tchapéu é &lt;10% do sinal positivo. <ol><li> Fazer diluições de vírus quadruplicado como descrito na seção 2.1. </li><li> Transferir as diluições para uma placa revestida com fetuína, tal como descrito na secção 2.2 e Incubar a placa a 37 ° C. </li><li> Lava-se a placa de 16-18 horas mais tarde e adicionar 1: 500, 1: 750, 1: 1000 e 1: 2000 diluições de ANP-HRPO (100 ul / poço) para duplicar as linhas da placa. </li><li> Completar o ensaio como descrito nos passos 2.3.4 a 2.3.9. </li><li> Avaliar os dados para seleccionar a diluição que resultou num sinal máximo que é&gt; 10 vezes o fundo. </li></ol></li><li> Imediatamente antes da utilização, preparar a diluição óptima de PNA-HRPO identificada em 1.5.3. </li></ol></li><li> Prepara-se uma grande volume de tampão de lavagem (0,01 M de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4, 0,05% de Tween 20 (PBS-T)). Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Prepara-se o substrato de peroxidase (dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD)): Nota: os substratos de peroxidase alternativos, tais como 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), podem ser utilizados <ol><li> Preparar tampão fosfato-citrato dissolvendo uma cápsula em 100 mL de dH2O no dia do ensaio. </li><li> Dissolver 1 comprimido de OPD (10 mg) em 20 ml de tampão fosfato-citrato imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Preparar a solução de paragem (1 NH 2 SO 4): adicionar 27,2 ml de estoque de 98% de H 2 SO 4-973 ml de dH 2 O. Misture e, em seguida, armazenar à temperatura ambiente. </li></ol> 2. A determinação da quantidade de Na usar em ELLA <ol><li> Preparar diluições de vírus numa placa de 96 poços <ol><li> Dispense 120 ul diluente da amostra (ponto 1.2) em colunas 1-11 da placa de diluição. </li><li> Para coluna 1, adicione um diluente adicional amostra de 96 mL. </li><li> Descongelar e, em seguida, vortex o frasco do vírus antes de adicionar 24 mL de duplicar poços na coluna 1. Isto dá uma diluição do vírus 1:10. </li><li> Fazer diluições em série de 2 vezes de vírus em diluente da amostra, através da transferência120 mL de um bem para os próximos utilizando pontas de pipeta limpas para cada diluição. </li></ol></li><li> Transferir diluições do virus para uma placa revestida com fetuína <ol><li> Lave as revestidas de fetuína placa 3 vezes com PBS-T (secção 1.6) e, em seguida, seque cada placa sobre papel absorvente para remover qualquer tampão de lavagem em excesso. </li><li> Adicionar 50 ul de diluente de amostra (1.2.1) a cada poço nas colunas 1 a 11 da placa revestida com fetuï¿½a. </li><li> Adicionar 100? L de diluente de amostra à coluna 12 (estes poços são o controlo negativo). </li><li> Transferir 50 ul de vírus diluído a partir de colunas 1-11 da placa de diluição às cavidades correspondentes da placa revestida com fetuína. </li><li> Cobrir a placa com um vedante de placa e, em seguida, coloca-se numa incubadora humidificada a 37 ° C. </li><li> Adicione nota do momento em que restantes passos será realizada (16-18 hr mais tarde). </li></ol></li><li> Complete a Determinação NA <ol><li> Quando a incubação estiver completa (16-18 h), transferir oplaca para o banco e retirar o vedante de placa. </li><li> Lava-se a placa 6 vezes com PBS-T (secção 1.7) e, em seguida, inverter e pat em toalhas de papel absorvente para assegurar que todo o líquido foi removido dos poços. </li><li> Adicionam-se 100 ul / poço solução de PNA-HRPO (na diluição determinada em 1.5.3) a todos os poços e incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Menos do que 15 minutos antes da incubação é a extremidade, preparar a solução de OPD como descrito na secção 1.7. </li><li> Lavam-se as placas de teste 3 vezes para remover o PNA-HRPO e secar antes da adição de 100 ul de substrato OPD a cada poço. </li><li> Incubar a placa durante exactamente 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Parar a reacção por adição de 100 ul / poço de ácido sulfúrico 1N. </li><li> Usar um leitor de placas para medir a densidade óptica (DO) a 490 nm, durante 0,1 seg. </li><li> Salvar e exportar todos os arquivos de dados. </li></ol></li><li> Seleccione a diluição de vírus que será usada para Sorologia <ol><li> Desenhar um gráfico que traça OD 490nm </sub&gt; valores em cada diluição do vírus. Inspeccionar a curva de titulação para identificar o sinal máximo (isto é, normalmente o sinal que corresponde a um patamar no início da curva de titulação), o sinal mínimo (poços que não contêm nenhum vírus na coluna 12 da placa de fornecer o controlo de fundo), e as diluições de vírus que resultam em OD que é proporcional à diluição de entrada (isto é, região linear da curva). </li><li> Marque a diluição do vírus que dá, aproximadamente, 90% do sinal máximo e está dentro do intervalo linear. Confirmar que o diâmetro externo na diluição seleccionado é pelo menos 10 vezes maior do que o sinal de fundo. Use a diluição do vírus selecionado para todos os ensaios que empregam esse estoque vírus em particular. Nota: Em alternativa, medir a actividade de NA do vírus e usar ~ 15-20 mU de actividade de NA / ml no ELLA. </li></ol></li></ol> 3. Enzyme-linked Lectina Ensaio Nota: A Figura 2 Shows a instalação das placas de diluição e de ensaio. <ol><li> Fazer diluições de amostras <ol><li> Coloque as amostras inactivadas por calor em gelo. Nota: 8 soros pode ser diluído em cada placa. </li><li> Para uma criada utilizando diluições a partir de 01:10 ao longo da placa, adicione 120 mL de diluente de amostra para todos os poços das colunas 3-11. </li><li> Para a coluna 2, adicionar 216 uL de diluente de amostra e 24 ul de cada amostra. Misturar a amostra no poço por pipetagem cima e para baixo 3 vezes e, em seguida, transferir 120 ul para a próxima coluna. </li><li> Depois de mudar as pontas das pipetas, misturar o conteúdo do poço pipetando cima e para baixo e, em seguida, transferir 120 ul para a próxima coluna. </li><li> Repita o passo 3.1.4 até que a amostra foi transferida para a coluna 11 e os restantes 120 ul descartado. </li></ol></li><li> Adicionar as amostras e vírus à placa revestida com fetuï¿½a <ol><li> Descongelar uma ampola de vírus, de vórtice e ressuspender o vírus no diluente (secção 1.2) na diluição que foi seleccionado no passo 2.4.2. Preparar pelo menos 5 ml de vírus por cada placa de ensaio. Manter o vírus diluído em gelo até que as placas foram lavadas e amostras de soro foram adicionados à placa. </li><li> Decidir sobre o número de placas revestidas com fetuína que são necessários para o ensaio (geralmente se aplicam 4 soros por placa). Lavar os revestidos por fetuína placa 3 vezes com PBS-T e, em seguida, inverter cada placa e secar sobre papel absorvente para remover o excesso de tampão de lavagem. </li><li> Usar uma pipeta de canais múltiplos para transferir 50 ul de cada diluição de soro de controlo ou amostra a partir da placa de diluição em poços em duplicado nas colunas 2-11. </li><li> Adicionar 50 ul de vírus diluído a todos os poços excepto o controlo negativo (coluna 12). </li><li> Adicionar 50 ul de diluente de amostra aos poços na coluna 1 e adicione 100 ml de diluente de amostra para a coluna 12. </li><li> Cubra os poços com o selador de placa e, em seguida, misture batendo suavemente os lados da placa ou colocar num agitador de placas a uma velocidade moderada durante 10 segundos. </li><li> Colocar a placa num humidifIED incubadora a 37 ° C durante 16-18 hr. </li></ol></li><li> Adicionar PNA-HRPO e completar o ensaio, tal como descrito na secção 2.3 </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Determinar a validade dos resultados do ensaio <ol><li> Confirmar que os valores de fundo (sem vírus) são inferiores a 10% do controlo positivo (vírus e sem soro). </li><li> Confirmar que os títulos de soros de controlo de execução em ensaios diferentes utilizando as mesmas condições estão dentro de 2 vezes do título médio. </li><li> Confirmar que as medições de OD de poços de controlo são consistentes (≤20% diferente) e que as medições de OD de poços de amostras duplicadas são consistentes (≤10% diferente). </li><li> Determinar a causa raiz de resultados inválidos e repita o ensaio se os critérios enumerados no 4.1.1, 4.1.2 ou 4.1.3, não são cumpridas. Considerar os fatores apresentados na Tabela 1 ao tentar solucionar problemas. </li></ol></li><li> Atribuir um título de ponto-End 50% <ol><li> Para cada placa de ensaio, subtract o fundo médio (sem antigénio adicionado aos poços) a partir de todas as leituras. </li><li> Calcular a percentagem de inibição em cada diluição do soro utilizando a fórmula: 100 x (vírus OD único controle - amostra de teste OD) / vírus OD único controle. </li><li> Identificar a diluição mais elevada que resultou em% de inibição do máximo de sinal, pelo menos, 50. </li><li> Relatam o recíproco desta diluição como o ponto final de titulação de 50%. Nota: Se uma inibição de 50% não foi conseguida em qualquer diluição, o título é menor do que a primeira diluição testada, por exemplo, &lt;10 quando 01:10 é a primeira diluição testada. </li></ol></li><li> Calcula-se a concentração de 50% de inibição (IC50) <ol><li> Use quatro regressões logísticas de parâmetros para determinar o IC 50 título da seguinte forma: subtrair o fundo da média de todas as leituras e depois transferir os resultados para um programa que executa análise de regressão. </li><li> Use regressão não-linear, com o conjunto máximopara o vírus apenas controlam e o mínimo definido para zero, para determinar a diluição que corresponde exactamente com a inibição de 50%. </li><li> Relatam o recíproco desta diluição como a IC50 título. </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflicts of interest.

O ensaio de lectina ligada a enzima é um método prático para avaliar os títulos de anticorpos no soro NI. Embora ELLA foi descrito por Lambre et al., Em 1990, a sua aceitação como um ensaio serológico padrão tem sido mais recente, com numerosos laboratórios da realização do ensaio para medir NI títulos de anticorpos de amostras clínicas 12-16. Algumas modificações podem ser feitas a passos de protocolo sem um grande impacto para as titulações da National Instruments que são medidos. Por exemplo, PBS podem ser utilizados como diluente, no entanto, é muito útil para comparar as curvas de vírus de titulação no tampão recomendado (MES, pH 6,5) e PBS antes de ser tomada uma decisão, como alguns subtipos de NA reduziram significativamente a actividade da enzima em pH&gt; 7.0. Quando o pH óptimo não é usado, o sinal máximo de vírus pode ser reduzida, o que resulta na utilização de uma quantidade excessiva de antigénio (isto é, vírus) no ensaio; Sob estas condições, o ensaio pode ter sensibilidade reduzida. alguns nãoinibição específica-N é observada quando os soros não tratados são testados no ELLA. Este é removido por tratamento térmico (56 ° C durante 45 min), indicando a presença de inibidores de p-termolábeis. Outros inibidores não-específicos (α e γ-classe) de gripe HA tem sido descrito, particularmente em relação ao vírus H3N2 hemaglutinação e de infecciosidade. Com efeito, a inibição não específica é também observada em ELLA quando vírus H3N2 são utilizados como a fonte de NA; Esta inibição é removido por tratamento das amostras de soro com uma pequena quantidade de sialidase 9. Como para outros ensaios sorológicos, controlos negativos e positivos deve ser incluído em cada ensaio para proporcionar um meio para avaliar o desempenho do ensaio. Quando o ensaio não cumpriu os critérios de aceitação, a razão deve ser identificado. A Tabela 1 fornece uma lista de possíveis passos no ensaio que podem ser abordados para solucionar problemas. A prov protocolo ELLAided neste relatório utiliza vírus recombinantes que contêm o HA proveniente de um vírus da gripe aviária, como a fonte de NA. Isto representa uma limitação para realizar o ensaio, porque é necessária uma licença para trabalhar com vírus aviária de baixa patogenicidade. vírus recombinantes H6Nx pode ser partilhada entre laboratórios depois de terem sido inactivados. Portanto, o ensaio pode ser realizado através da colaboração uma vez que o laboratório gerar o vírus recombinante natural demonstrou que a inactivação é completa e a preparação reteve a sua actividade de NA. A restrição de uso H6Nx vírus recombinantes podem ser reduzidas mediante a utilização de fontes não-infecciosas de NA. Por exemplo, alguns laboratórios têm utilizado purificada NA recombinante 17, enquanto outros usaram partículas semelhantes a vírus (VLPs) 15. No entanto, nem NA recombinante nem VLP estão prontamente disponíveis e, portanto, continuar a usar os vírus da gripe aviária com um HA antigenicamente-incompatíveis. O tradicionalMétodo para medir títulos de anticorpos NI não é prático por vários motivos; de maior preocupação são as substâncias químicas nocivas que são necessários para produzir uma reação de cor. Além disso, grandes volumes de amostra são necessários e o ensaio é complicado de realizar. Em contraste, o ELLA é fácil de realizar e é de um formato que permite a titulação de um número razoável de amostras. Os dados de estudos que examinaram ELLA variabilidade mostram que resultados os rendimentos de ensaio reproduzíveis 7,8. A ELLA tem, consequentemente, a medição de rotina de títulos de anticorpos NI possíveis, e prevê-se que ele será usado mais frequentemente por laboratórios que conduzem estudos sorológicos. Há vários passos críticos que precisam ser considerados quando se realiza o ELLA. Em primeiro lugar, os inibidores não-específicos de actividade de NA tem que ser removido. Estes inibidores são geralmente termolábeis e são destruídas por um tratamento térmico a 56 ° C durante 45 min. O tratamento térmico é suficiente para eliminar não-especiFIC inibidores a partir de amostras em que os vírus recombinantes H6 são utilizados como a fonte de NA, no entanto, quando o vírus H3N2 são utilizados na ELLA, factores do soro que se ligam a hemaglutinina também interferir com a ELLA e deve ser removido por tratamento com uma pequena quantidade de sialidase antes do tratamento térmico 9. Em segundo lugar, uma quantidade excessiva de antigénio, isto é, vírus H6Nx recombinado, não deve ser utilizado como este reduz a sensibilidade do ensaio. titulação cuidadosa dos vírus é, por conseguinte, um passo essencial; a quantidade de antigénio utilizada em cada ensaio deve fornecer um sinal que está bem acima do fundo, e deve estar dentro da gama linear da curva de titulação, ou seja, o sinal (densidade óptica) deve ser proporcional à diluição do vírus. Além de serologia de rotina, o ELLA pode ser usado para avaliar diferenças antigénicas entre NAS do vírus da gripe sazonal. Esta informação pode ser muito útil ao selecionar estirpes de vírus para a inclusão de ums candidatos a vacinas e facilitará uma maior compreensão das pressões imunes que resultam em variação antigénica de NA. Além disso, a análise antigênica do NAS, de vírus da gripe suína ou de aves pode fornecer informações cruciais para determinar o potencial de pandemia de estirpes emergentes.

Neuraminidase (NA) é uma glicoproteína expressa na superfície de viriões da influenza. A sua actividade enzima é essencial para a libertação de partículas de vírus recentemente formadas a partir de células infectadas 1,2. Os anticorpos que inibem a actividade de NA reduzir os títulos de vírus e os sintomas da doença em modelos de animais 3 e correlacionam-se com a resistência contra a doença em seres humanos 4. Um aumento na inibição NA (NI) títulos após a vacinação pode, portanto, servir um indicador da eficácia da vacina, no entanto muitos estudos de imunogenicidade da gripe passado não incluir este ponto final, porque o ensaio tradicional para medir títulos de anticorpos NI é impraticável para sorologia de rotina. O método tradicional para medir títulos de Ni é ​​baseada na quantificação da quantidade de ácido siálico que é clivado a partir de glicoconjugados por NR 1. Este método, muitas vezes referido como o método de ácido tiobarbitúrico (TBA), utiliza produtos químicos perigosos para converter AC siálicoID de um cromóforo que pode ser quantificada por espectrometria. O ensaio não é apropriado para testar grandes números de amostras, porque os tubos de vidro individuais são utilizados, tornando o ensaio pesado. A miniaturização do ensaio para a placas de 96 poços fornece um formato mais prático 5, no entanto, este ensaio requer ainda o uso de produtos químicos tóxicos e, por conseguinte, não é o ideal. Um ensaio alternativo para medir títulos de anticorpos NI foi desenvolvido por Lambre et al. 6. Este ensaio quantifica a actividade da enzima medindo a quantidade de açúcar a penúltima de glicoproteínas, galactose, que fica exposta quando o ácido siálico é libertado pela NA. Desde amendoim-aglutinina (PNA) se liga especificamente a galactose, a uma peroxidase de rábano-PNA (HRPO) conjugado pode ser usado para obter uma leitura colorimétrica-out. A densidade óptica, que é medido é portanto proporcional à actividade de NA na amostra. Os títulos de NI são medidos determinando-se a diluição mais elevadade soro que inibe, pelo menos, 50% da actividade de NA. Este ensaio de lectina ligada a enzima (ELLA) é realizada em placas de 96 poços revestidas com fetuína, uma proteína de soro altamente glicosilada, tal como o substrato para NA. Uma consideração importante para ensaios que medem títulos de NI, é a fonte de NA. Isto é porque o soro de indivíduos vacinados ou infectados conter anticorpos contra a hemaglutinina (HA), bem como anticorpos para NA. Os anticorpos que se ligam a HA pode interferir com a actividade de NA e, por conseguinte, para evitar inibição não-específica por anticorpos específicos de HA-, purificado NA ou vírus inteiros contendo um HA antigenicamente desemparelhado deve ser usado no ensaio. Estes vírus podem ser geradas por rearranjo clássica ou por genética reversa; o objectivo é resgatar um vírus que contém HA de um subtipo que não está relacionada com a estirpe alvo, e NA do vírus que está a ser estudado. O ensaio descrito neste artigo emprega vírus A da gripe, que são gerados pelo revERSE genética para conter HA de H6 subtipo ea NA alvo de vírus influenza A, subtipos H1N1 e H3N2 5. Os resultados gerados por ELLA e ensaios TBA miniaturizados mostrar esses métodos são comparáveis, com especificidade subtipo semelhante e sensibilidade 7. O ELLA não exigem a utilização de produtos químicos perigosos, pelo que é o método preferido para medir títulos de NI. É fácil de executar, com apenas alguns passos (Figura 1): As amostras são diluídas e transferido para uma placa revestida com fetuína para o qual o vírus (a fonte de NA) é adicionado. A placa é incubada S / N e lavou-se antes da adição de PNA-HRPO. Após uma incubação de 2 horas, a placa foi lavada e o substrato da peroxidase é adicionado; a reacção de cor é parado e finalmente, a densidade óptica é medida e o recíproco da diluição da amostra, que resultou em% de inibição, pelo menos, 50 da actividade de NA é relatada como o ponto final de titulação de 50%. Um estudo intra-laboratório para avaliar reproducibiliTy do ELLA, mostraram que a variabilidade da placa-a-placa é mínima e repetibilidade operador-a-operador não resultou em diferenças mais do que duas vezes no título 7. Um estudo subsequente inter-laboratórios de ELLA variabilidade mostrou que o ensaio tem uma boa reprodutibilidade quando realizado em laboratórios diferentes e que a inclusão de um padrão pode reduzir ainda mais a variabilidade nos resultados 8. O ELLA é adequado para a medição de títulos de anticorpos NI em painéis de soro a partir de estudos sobre a vacina da gripe pré-clínicos e 7 e também pode ser usado para avaliar diferenças antigénicas entre as AN 9 de vírus da gripe.

<table><tbody><tr><td>Coating buffer&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-84-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>5x MES, pH 6.5&amp;nbsp;</td><td>KD-Medical</td><td>PBS-0134</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>30% BSA</td><td>Sigma</td><td>A8327</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lectin PNA-HRPO</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;L7759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-T</td><td>Sigma</td><td>P3563-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>96-well&amp;nbsp; Maxisorp plates</td><td>NUNC</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom well plates</td><td>NUNC</td><td>267245</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-192B</td><td></td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Charles River Laboratories</td><td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Variety of suppliers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Rainin, Eppendorf</td><td>8 or 12 channel manual pipette 50-250 &amp;micro;l volume</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Depends on pipettor brand</td><td>Depends on pipettor brand</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader, with 490 nm filter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor V</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 56 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator set to 4 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

Os anticorpos para neuraminidase (NA), a segunda proteína de superfície mais abundante no vírus da gripe, contribuem para a proteção contra a gripe. Os métodos tradicionais para medir inibição de NA (NI) títulos de anticorpos não são práticos para serologia rotina. Este protocolo descreve o ensaio ligado a enzima lectina (ELLA), um método alternativo é prático para medir títulos NI que é realizado em placas de 96 poços revestidas com um substrato de grande glicoproteína, fetuina. NA cliva ácidos siálicos terminais de fetuina, expondo o penúltimo açúcar, galactose. aglutinina de amendoim (PNA) é uma lectina com especificidade para galactose e, por conseguinte, a extensão da desialylation pode ser quantificada utilizando-se um conjugado de peroxidase de rábano-PNA, seguido pela adição de um substrato cromogénico da peroxidase. A densidade óptica, que é medida é proporcional à actividade de NA. Para medir títulos de anticorpos NI, diluições em série de soros são incubadas a 37 ° CO / N em placas revestidas com fetuína com uma quantidade fixa of NA. O recíproco da diluição mais elevada do soro que resulta na inibição ≥50% da actividade de NA é designado como o título de anticorpo NI. A ELLA fornece um formato prático para avaliação de rotina de respostas de anticorpos humanos após infecção por influenza ou vacinação.

O ensaio apresentado neste trabalho é mostrado esquematicamente na Figura 1. A Figura 2 mostra a disposição da placa de 96 poços, e indica que as diluições em série de amostras de soro são preparadas de uma placa de diluição antes da transferência para a placa revestida com fetuína. Um parâmetro crítico do ensaio é a quantidade de neuraminidase que é utilizado no ensaio; isto é determinado através da titulação do vírus recombinante natural. Exemplos de H6N1 e H6N2 titulações de vírus estão apresentados na Figura 3. A 1:10, 1:20 e 1:40 diluições de H6N1, a densidade óptica foi semelhante, indicando que as condições eram tais que uma leitura máxima foi obtida. Numa diluição de 1:80, o read-out foi de aproximadamente 90% do máximo e, por conseguinte, esta diluição do vírus foi usada em ensaios subsequentes. Exemplos de titulações de soro são mostrados na Figura 4. A figura mostra uma amostra de soro humano que era titrados contra o H6N1 e os vírus H6N2. Cada ponto de dados mostra a percentagem de inibição da actividade de NA, que foi obtida por diluições em série de soro; a primeira diluição do soro no ensaio foi de 1:80 H6N1; a primeira diluição de soro no ensaio foi H6N2 5. Uma vez que a diluição mais elevada que resulta em inibição ≥50% é o título de anticorpo NI, o título do soro mostrado neste exemplo é de 640 contra a NA de NC / 99 (N1) e 160 contra o nA de WI / 05 (N2). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . Figura 1. Um esquema do protocolo ELLA (A) Determinação da diluição de antigénio (vírus) para usar no ensaio (passo 2 do protocolo): diluições de vírus são adicionados a uma placa revestida de fetuina e a actividade medida por NA quantificação de resíduos de galactose terminais de ligação através de PNA-HRPO como descrito na etapa 2.3 do protocolo; (B </stron<html> g&gt;) Determinação de títulos de anticorpos séricos NI (passo 3 do protocolo). As amostras são diluídas e, em seguida, transferido para uma placa revestida com fetuína em que o vírus é adicionado. A placa é incubada O / N antes de adicionar PNA-HRPO e completando os passos necessários para gerar uma reação de cor. Finalmente, a reacção de coloração é parada e a densidade óptica é medida. O recíproco da diluição da amostra que resulta em pelo menos 50% de inibição da actividade NA é relatado como o ponto final título 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama para mostrar a placa ELLA definido acima. As diluições em série de amostras de soro são feitos em uma placa de diluição e, em seguida, transferido para uma placa revestida com fetuína.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de H6N1 e H6N2 titulações de vírus. Diluições em série de H6N1 BR / 07 (NA de A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) apresentados na símbolos azuis) e H6N2 UR / 07 (NA de A / Uruguai / 716 / 2007 (H3N2) mostrado na símbolos vermelhos) foram incubadas durante 18 h em placas revestidas com fetuína e a reactividade com PNA-HRPO determinada como descrito. Média OD 490 nm de 2 poços é representada graficamente contra o recíproco da diluição do vírus. A diluição de H6N1 seleccionado para utilização no ELLA foi de 1:80 e uma diluição de 1:40 foi seleccionado H6N2 porque estas diluições resultou em aproximadamente 90% da densidade óptica máxima e estavam dentro do intervalo linear.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> Figura 4. A titulação de soro contra NA de N1 (símbolos vermelhos) e N2 (símbolos azuis) subtipos. Títulos de inibição de NA foram medidos contra vírus recombinantes H6N1 NC / 99 (contém o NA de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) e H6N2 WI / 05 (contém o nA de a / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). inibição da enzima por cento por diluições em série de soro é demonstrado com a linha horizontal tracejada indica uma inibição de 50%. Os títulos de inibição de NA contra as AN de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) e A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) foram 2 9.3 (640) e 2 7.3 ( 160), respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior ve</a>rsion desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Causas possíveis) </td><td> Solução </td></tr><tr><td> Sinal fraco ou nenhum patamar alcançado em titulação do vírus </td><td> i) atividade da enzima baixo NA ii) Stock vírus não armazenados em condições ideais </td><td> i) confirmar que o diluente tem de pH que é óptimo para a actividade de NA; se o pH é óptima, preparar um novo estoque de vírus ou se concentrar vírus ii) crescerem e da alíquota; frascos snap-congelamento de gelo seco antes de armazenar a -80 ° C </td></tr><tr><td> Fraca ou nenhuma cor em poços de controlo de células positivas </td><td> i) diluição Virus atribuída incorretamente ii) frasco-para-ampola variabilidade em alíquotas de vírus congeladas iii) PNA- HRPO desnaturado ou muito diluído iv) OPD preparado de forma incorrecta </td><td> Eu); titulação do vírus Repita ii) Titula-se vários frascos do mesmo lote para assegurar que não há variabilidade. Se variabilidade significativa, prepare alíquotas frescas iii) Use diluição do vírus ideal para retitrate PNA- HRPO iv) Repita com a preparação fresca de OPD </td></tr><tr><td> Fraca ou nenhuma inibição por soros de controlo positivo </td><td> i) O excesso de vírus utilizado no ensaio ii) Soro deteriorou </td><td> i) titulação do vírus Repita ii) obter novas condições de armazenamento anti-soros Verifique </td></tr><tr><td> Inibição por soros de controlo negativo </td><td> i) tratamento térmico inadequado de soro ii) É muito pouco usado no ensaio de vírus </td><td> i) Repete-inactivação de calor de soro ii) titulação do vírus Repita </td></tr><tr><td> fundo de alta </td><td> i) a possível contaminação de placas ii) a concentração PNA- HRPO muito alta / muito baixa </td><td> i) Repita usando placas revestidas de fresco ii) Titular PNA-HRPO para identificar a diluição correta para usar </td></tr><tr><td> titulação do vírus mostra aparente inibição da atividade da NA em baixas diluições </td><td> i) fluido alantóico podem conter substrato para NA </td><td> ii) a utilização de vírus que foi sedimentado através de uma almofada de sacarose </td></tr></tbody></table> Tabela 1. A análise de causa raiz de ensaios que não satisfazem os critérios de desempenho. Esta tabela fornece as possíveis causas e soluções para problemas que podem ocorrer durante a execução do ELLA.

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Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K visualizações.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Medicina

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

Ensaios ELISA: Indireto, Sanduíche e Competitivo

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
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Education

JoVE Science Education

Biologia Avançada

Imunologia

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Source: Kaufmann, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55833">An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

O ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra um antígeno alvo

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

Um ensaio para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase da influenza

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

Source: Gross, F. L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56448">Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing &#945;2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human serology