O trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional do Centro de Pesquisa Biológica Excelência [número de concessão 1P20GM109005], o Grant Consortium Arkansas espaço através do National Aeronautics and Space Administration [número de concessão NNX15AK32A] Saúde e do Instituto Nacional de Segurança Ocupacional e saúde (NIOSH) [número de concessão 2T420H008436]. Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fettes para revisão e edição deste manuscrito.

1. Recolha de partículas e Preparação <ol><li> Calibração do dispositivo de amostragem partículas total de alto volume suspensa <ol><li> Desligar o motor amostrador a partir do controlador de fluxo de massa e ligar o motor a uma fonte de alimentação de CA estável (Figura 1). NOTA: Um filtro não é usado durante este procedimento. </li><li> Monte o orifício calibrador e superior placa adaptadora de carregamento para o amostrador. Aperte os principais adaptador de carga porcas de fixação da segurança para garantir que não há vazamentos de ar estão presentes. Permitir que o motor amostrador aquecer até à sua temperatura de funcionamento normal (aproximadamente 10-15 min). </li><li> Realizar um teste de vazamento, cobrindo os furos na parte superior do orifício e da pressão da torneira no orifício com as mãos. Ouvir um som agudo estridente feito por escapar ar. Se este som é ouvido, volte a apertar os principais adaptador de carga porcas de sujeição como um vazamento está presente. Se o som é mais baixo, o vazamento é perto de uma das outras juntas nas sysTEM. </li><li> Conectar um lado de um manómetro de água da torneira à pressão no lado do orifício com um tubo de vácuo de borracha. Deixar o lado oposto do manómetro aberto para a atmosfera. Segure um manómetro verticalmente para garantir leituras precisas. Tocar na parte traseira do gravador de fluxo contínuo vai ajudar a centrar a caneta e fornecer leituras precisas. </li><li> Repita o passo 1.1.2, usando cinco vazões que representam as taxas de fluxo que operam a partir de 30 a 60 pés / min (aproximadamente a cada 5-6 pés 3 / min). Ajuste o botão no orifício variável em cinco posições diferentes e ter cinco leituras diferentes. </li><li> Grave a temperatura ambiente do ar, pressão ambiente, número de série amostrador, número de série orifício, inclinação orifício e intercepção com data do último certificado, a data, local do site, e as iniciais do operador sobre a folha de calibragem. </li></ol></li><li> Coleta de amostra total de partículas suspensas e análise gravimétrica <ol><li> enrole uma8 &quot;x 10&quot; filtro de fibra de quartzo em duas camadas de folha de alumínio. Colocar o filtro envolvido na fornalha e ajustar a temperatura a 550 ° C. Coza no filtro durante pelo menos 4 h. Deixe o fresco do forno e recuperar o filtro. Colocar o filtro no exsicador com CaCO3. </li><li> Pesa-se o filtro numa microbalança com precisão de 10 ug. Repetir a medição três vezes durante um dia. medições individuais deverão estar dentro de 25 ug. Se isto não for conseguido, devolver o filtro enrolado para o exsicador e repetir o processo no dia seguinte. </li><li> Abrir a tampa do abrigo (Figura 2). Retire o filtro chassis de suporte soltando os quatro porcas de asa, permitindo que os parafusos de latão e arruelas para oscilar para baixo fora do caminho. Desdobrar o filtro da folha de alumínio, e utilize uma pinça limpas para centralizá-lo cuidadosamente, lado mais áspero para cima, na tela de apoio. Alinhe corretamente o filtro na tela. </li><li> Coloque a moldura na tela e prenda-o comos parafusos e anilhas de metal enquanto aplica pressão suficiente para evitar fugas de ar nas extremidades. Limpe qualquer acúmulo de poeira de todo o suporte do filtro com um pano limpo. Feche a tampa abrigo com cuidado e prendê-lo. </li><li> Certifique-se de todos os cabos estão conectados a suas bases receptáculo apropriado e a tubulação entre a torneira de pressão do motor do ventilador e o gravador de fluxo contínuo está ligado. </li><li> Prepara-se o gravador de fluxo. Deprimir a pena braço levantador para levantar ponto caneta e inserir um novo gráfico. Alinhe a guia do gráfico para o cubo de acionamento do gravador e pressione com o polegar para abaixar o centro de gráfico no cubo. tempo definido pela rotação do cubo de acionamento dos ponteiros do relógio até a hora correta no gráfico é alinhada com o ponteiro índice de tempo. </li><li> alternar manualmente no amostrador e iniciar a coleta. Monitorar o gravador para ter certeza de que está cobrindo corretamente e o indicador de tempo decorrido para ter certeza de que está funcionando corretamente. </li><li> No final do período de recolha de amostras, desligar o amostrador, fichao tempo decorrido e recuperar o gráfico. Remover o quadro para expor o filtro. Retire o filtro exposta a partir da tela de suporte, segurando-o delicadamente nas extremidades com a pinça. Dobre o filtro de comprimento de modo que a amostra toca amostra duas vezes e envolvê-la na folha de alumínio original. </li><li> Armazenar o filtro em um exsicador com CaCO3 para, pelo menos, 24 h antes da pesagem. Repita o passo 1.2.2 para medir o peso dos filtros após a amostragem. Coloque o filtro em um saco plástico zip e guarde-a -80 ° C até análise. </li></ol></li><li> Análise de amostra de partículas totais em suspensão recolhidas <ol><li> Recuperar o filtro armazenados, abra a folha de alumínio e transferir o filtro sobre uma superfície de Teflon limpa. Utilizando uma pinça e bisturi, cortar a parte exterior (branco) do filtro e descarte. <ol><li> Em seguida, cortou o filtro em 0,5 &quot;x 0,5&quot; pedaços e peças para um balão de 100 ml. Adicionar 50 ml de água ultrapura. Colocar o recipiente em um ultra-sombanheira e sonicate durante 60 minutos a 33 ± 3 kHz. </li></ol></li><li> extrato de filtro através de um filtro de seringa em polipropileno de 0,45 um a um frasco de 100 ml de fundo redondo. Evapora-se a água usando um aparelho evaporador rotativo sob pressão a 50 ° C até cerca de 5 ml de extracto permanece no frasco. <ol><li> Evapora-se a água restante em um frasco de 15 ml em forma de pêra de peso conhecido. Pesa-se o balão com o extracto seco e registar a massa do extracto seco. </li></ol></li><li> Dissolve-se a amostra seca com 400 ul de D 2 O por sonicação durante 15 minutos e transferir para um tubo de RMN de 5 mm padrão. Centrifugar durante 5 min a 12.000 xg, à temperatura ambiente para remover qualquer matéria não dissolvida. </li><li> Repetir com 300 ul de D 2 O. Adicionar 10 ul de NaN3 1,4% (concentração final .: 0,02% w / v) no tubo de RMN. Adicionam-se 10 ul (32 ug) de partículas totais em suspensão (TSP) D4 (3,2 mg / ml) em D 2 O (concentração final de 0,258 mM) no tubo de RMN. </li><li>Adquirir espectros de 1 H RMN utilizando um espectrómetro de RMN operando a 600,17 MHz. <ol><li> Inserir o tubo de RMN em crio-sonda de ressonância tripla. Calibrar o aparelho na seguinte ordem: fechamento, melodia, calço, calibragem de comprimento de 90 ° de pulso e ajuste de ganho do receptor. </li><li> Medir espectros a 25 ° C com um 1 D sequência de excitação esculpir usando 180 pulsos seletiva de água em modo de detecção de Quad Digital, 8.192 exames, 4 scans manequim, largura de varredura de 8012,57 Hz, freqüência de offset para a supressão do sinal de água fixado em 4,70 ppm, 1,70 seg tempo de aquisição, pontos de dados de domínio 32.768 tempo (DT), 1 gradiente de duração ms (p16), 100 ms de atraso recuperação após gradiente (d16). </li></ol></li><li> Processo 1 H RMN Os espectros através da aplicação de um alargamento de linha de 1 Hz e de enchimento de zero por um factor de 2 (65.536 pontos de dados). Corrigir a fase e de linha de base manualmente e integrar. Definir pico TSP-d4 em 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> Exposição 2. Partícula<ol><li> Cultura configurado <ol><li> meios de crescimento completo quente contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina (100 U / ml), solução de tripsina a 0,25% e de magnésio de fosfato de cálcio livre tampão salino (PBS) num banho de água (a 37 ° C) durante pelo menos 30 min antes do início da cultura. </li><li> Retire um frasco T75 a partir de 5% de CO 2 incubadora contendo células cultivadas RAW264.7 e lavar as células com 2 ml de PBS pré-aquecido duas vezes. </li><li> Desalojar as células aderentes RAW264.7 a partir do fundo do recipiente de cultura de tecido usando 1 ml de solução de tripsina pré-aquecida, seguido por raspagem. </li><li> Recolher as células a partir do vaso de cultura de tecidos e fazer uma suspensão de células individuais por pipetagem repetida. Contar o número de células com azul de tripano e a placa a uma densidade de 8000 / cm2 (500.000 células totais) em uma placa de cultura de tecidos de 100 mm, com meio completo pré-aquecido. Ajustar o volume de suporte de 10 ml para uma concentração final de 50000 célulaspor ml. NOTA: dobrar o número de placas se a análise de metilação do DNA também é realizada. </li><li> Colocar as células plaqueadas RAW264.7 recém volta em 5% de CO2 a 37 ° C e deixa-se aderir durante 24 h. </li><li> Também em uma cabine de segurança biológica, ressuspender as partículas filtradas. Por exemplo, dilui-se as partículas a uma concentração de 0,5 mg / ml em PBS estéril para uma dose de tratamento de 5 ug / ml e de 5 mg / mL para uma dose de tratamento de 50 ug / ml. As diluições podem ser preparados até meses de antecedência e guardadas a -80 ° C. </li></ol></li><li> O tratamento com material particulado <ol><li> Retire as células de 5% de CO 2 incubadora e verificar em 10x utilizando um microscópio invertido para o crescimento celular, morfologia celular, condição de cultura e contaminação. Deve-se esperar ter, pelo menos, 30% de células confluentes na presente fase. </li><li> Assepticamente, aspirar a mídia que usa a pipeta esterilizada e lavar o recipiente de cultura com 2 ml 37 ° C PBSduas vezes para remover completamente os meios de comunicação e células flutuantes ou mortas. </li><li> Adicionar dose pré-determinada de material particulado por meio fresco nos vasos de cultura e incuba-se durante o tempo desejado a 37 ° C em 5% de CO2. Neste estudo, o tratamento de células com RAW264.7 PM durante 72 horas para paralelo a exposição utilizada para a análise e genotóxica epigenotoxic concomitante. NOTA: A citotoxicidade pode afetar negativamente a qualidade da análise citogenética. Assim, ensaios adicionais, tais como citotoxicidade, a metilação do DNA, Western blotting, ou análise da expressão do gene são tipicamente realizadas em células tratadas. Expor as células como descrito e prosseguir com o ensaio específico desejado. usuários inexperientes também pode querer incluir um controlo positivo, tais como metanossulfonato de metilo para testar a sua capacidade de detectar CAs. </li></ol></li></ol> 3. Ensaio citogenética <ol><li> Tratamento para prender células em metáfase <ol><li> Aqueça o colcemid assimlução (10 ug / ml) num banho de água a 37 ° C durante 30 min. Limpe a tampa com álcool a 70% no âmbito de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação </li><li> Remover completamente os meios de comunicação de forma asséptica e lavar os recipientes de cultura com 2 ml de pré-aquecido PBS duas vezes. </li><li> Adicionar meio fresco pré-aquecido (2 ml de meio / 10 6 células) contendo solução colcemida (5 ul / ml) no recipiente de cultura e incuba-se durante 2 h. </li></ol></li><li> colheita celular <ol><li> solução de tripsina quente e PBS num banho de água mantido a 37 ° C durante 30 min. A partir deste passo em diante, não há necessidade de manter a condição asséptica. </li><li> Remover completamente meios, lavar os recipientes de cultura com 2 ml de 37 ° C de PBS por duas vezes, adicionar o volume necessário de uma solução de tripsina pré-aquecido (em geral, de 2 ml para placa de cultura de 60 mm ou frasco T25 e 4 ml de placa de 100 mm ou frasco T75 ), e colocar o recipiente de cultura de volta em 5% de CO2 a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Take o recipiente de cultura, retire as células usando um raspador, e adicione 10 ml de PBS para parar a ação de tripsina. </li><li> Pipeta cima e para baixo, pelo menos, dez vezes para fazer a suspensão única célula e as células de transferência em um tubo de 15 ml de fundo cónico de centrífuga. </li><li> suspensão de células Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos em um balanço para fora centrifugadora à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante, quebrar o sedimento celular batendo suavemente, adicionar 10 ml de PBS e, novamente, centrifugar durante cinco minutos. </li></ol></li><li> Tratamento hipotónico e fixação <ol><li> Pré-aquecido solução de cloreto de potássio 0,075 M em um banho de água 37 ° C pelo menos durante 30 min. </li><li> Remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e deixar cerca de 0,5 ml de PBS. </li><li> Suavemente quebrar o sedimento de células e fazer a suspensão de células isoladas usando uma pipeta P200. </li><li> Adicionar gota 4 ml de solução pré-aquecida de cloreto de potássio a gota, com agitação suave. </li><li> Incubar as células em p hipotónicasolução de cloreto de otassium em um banho de água a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Faça solução acetomethanol fresco adicionando 3-peças metanol com 1-parte de ácido acético glacial. Manter este fixador recentemente preparada à temperatura ambiente. </li><li> Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador no tubo e misturar suavemente a solução por inversão do tubo. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Com esse tamanho de pelotas de células estágio aumenta, tornar-se esbranquiçada e mais visível. </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 4 ml de fixador e mantê-la à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifuga-se a 400 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e dar mais duas lavagens com 4 ml de fixador. </li></ol></li><li> De limpeza de slides e preparação metafase <ol><li> Imergir as lâminas de vidro completamente em detergente líquido a 10% durante 30 min. </li><li> Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente fria por 30 min. </li><li> Rinse desliza três vezes com água destilada para remover completamente o detergente, mergulhe em água destilada, e guarde na geladeira para uso futuro. NOTA: A limpeza lâminas antes do uso facilita a uniformidade do espalhamento e aumenta a qualidade metáfase. </li><li> Gota suspensão de células 10 ul no slide molhado gelada e deixe-o ar seco durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Coloração e montagem <ol><li> Prepare 50 ml de solução de coloração Giemsa pela mistura de uma parte da solução Giemsa com uma parte da PBS e despeje em um frasco Coplin. </li><li> Imergir as lâminas em solução de coloração para 20 min. </li><li> Lavar as lâminas em água destilada para remover o excesso de corante e imediatamente secar as lâminas através de um secador de cabelo. </li><li> Deixar as lâminas à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Aplique uma gota de meio de montagem no slide, coloque delicadamente uma lamela sobre o meio de montagem, permitem que o meio para espalhar sobre a lâmina lentamente e removao excesso de meio com uma toalha de papel. Permitir que a corrediça montada a secar durante pelo menos 1 h antes de se mudar ou visualização sob um microscópio para evitar o movimento da lamela. Cuidado: É importante colocar a lamela cuidadosamente sem formar quaisquer bolhas durante este passo. A utilização de excesso de calor para remover as bolhas não é recomendado. </li></ol></li><li> Tipos de observação microscópica e de aberração <ol><li> Examine os CAs estruturais na metáfase se espalha pelo 100X usando um de boa qualidade microscópio de campo brilhante. </li><li> Marque pelo menos 50 a 100 metáfase espalha para cada grupo de tratamento para tratamentos que induzem um grande número de autoridades de certificação. Para tamanhos de efeito menores, a análise de até 300 metáfase é aconselhada. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

estudo de citogenética ou análise microscópica dos números ou estruturas de cromossomos, principalmente nos spreads metáfase, fornece informações cruciais para o prognóstico, avaliação de risco e tratamento de várias doenças. está agora bem estabelecido que anomalias citogenéticas estão associados com a progressão e desenvolvimento de várias doenças, incluindo câncer. Até à data, as CAs foram encontrados em todos os principais tipos de tumores. CAs pode surgir espontaneamente ou por qualquer estímu...

Estima-se que a exposição ao material particulado (PM) faz com que mais de 3 milhões de mortes em excesso por ano, principalmente por doenças cardiopulmonares e cancro do pulmão 1. Na verdade, PM foi reconhecido como carcinogênico para humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (Grupo 1), com um risco aumentado de câncer de pulmão com o aumento dos níveis de exposição a PM foi mostrado 2. Curiosamente, quase todas as células cancerosas abrigar anormalidades cromossômicas numéricas e / ou estruturais. carbono orgânico particulado é uma variante, complexo e mistura heterogénea, cuja composição e tamanho de distribuição depende das emissões, bem como as transformações físicas e químicas. É responsável 35-55% da massa urbana PM 2,5 (PM 2,5 mm de tamanho e menores) e mais de 60% do fundo rural e continental PM 2,5 em massa 3, 4. A fração solúvel em água é responsável por 30-90% dos aerossóis orgânicos. Um grande número de compostos orgânicosForam identificados, incluindo os hidrocarbonetos alifáticos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e seus derivados oxigenados e nitrados, aldeídos alifáticos e álcoois, ácidos gordos livres e os seus sais, ácidos di-carboxílicos, compostos multifuncionais, proteínas e macromoléculas húmicos-like (HULIS) usando métodos cromatográficos acoplados com técnicas de espectrometria de massa 5-8. Estes compostos representam menos de 10-20% do carbono orgânico particulado, assim, a maioria de carbono orgânico é desconhecida 9. A evidência experimental sugere que a citotoxicidade, o stress oxidativo, e a inflamação estão envolvidos no desenvolvimento de estados patológicos PM-associados. Recentemente, foi mostrado, no entanto, que a exposição a PM também resulta num certo número de alterações epigenética, incluindo alterações na metilação do ADN de elementos repetitivos, tanto experimental em sistemas in vitro e em indivíduos humanos 10-12. De particular interesse são os efeitos dePM em DNA satélite - maiores e menores satélites - que são encontrados na região heterocromática em torno do centrômero dos cromossomos. Mostrou-se que estes efeitos podem ser persistente, por natureza, uma vez que pode ser detectado durante pelo menos 72 horas após a exposição 12. Alterações na metilação do ADN, em particular ao redor de centrómeros, pode levar a uma acumulação de transcritos de ARNm de ADN cromossómico por satélite, integridade compromisso durante a divisão celular e, subsequentemente, resultam no desenvolvimento de uma variedade de estados patológicos 13. Adaptação de abordagem citogenética para a análise de CAs como um ponto final de alterações epigenética causadas por PM, portanto, é de grande importância. Aqui, nós relatamos a abordagem para a recolha PM ambiente e preparação, a exposição in vitro e análise de CAs usando o murino sistema de macrófagos modelo RAW264.7. Os macrófagos compreendem a primeira linha de defesa contra os objectos estranhos inaladas e, por conseguinte, tsua linha celular serve como um modelo mais utilizado em toxicologia partícula 11, 12, 14, 15 e estabelecido.

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

A exposição a partículas (PM) é um importante problema de saúde mundial, que pode danificar vários componentes celulares, incluindo o material genético nuclear. Para avaliar o impacto da PM na integridade genética nuclear, aberrações cromossómicas estruturais são marcados nos spreads metáfase de macrófagos do rato RAW264.7. PM é recolhida a partir do ar ambiente com um amostrador de partículas totais alto volume suspenso. O material recolhido é solubilizado e filtrou-se para reter a porção fina solúvel em água. As partículas são caracterizadas por composição química por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Diferentes concentrações de suspensões de partículas são adicionados para uma cultura in vitro de macrófagos de ratinho RAW264.7 para um tempo total de exposição de 72 horas, juntamente com as células de controlo não tratadas. No final da exposição, a cultura é tratada com colcemida para prender células em metafase. As células são então recolhidas, tratou-se com uma solução hipotónica, fixo em acetomethanol, dropped em lâminas de vidro e, finalmente, corados com solução de Giemsa. Slides são examinados para avaliar as aberrações estruturais cromossómicas (CAs) em metáfase se espalha de 1000X ampliação usando um microscópio de campo brilhante. 50 a 100 metafase são marcados para cada grupo de tratamento. Esta técnica é adaptado para a detecção de aberrações estruturais cromossómicas (CAs), como quebras de tipo chromatid, trocas do tipo chromatid, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos e anel, minutos duplos, endorreduplicação, e translocações Robertsonianas in vitro após exposição a PM. É um método poderoso para associar um ponto de extremidade citogenética bem estabelecida a alterações epigenética.

Grande deve ser tomado cuidado na escolha da localização do dispositivo de amostragem de TSP, bem como a altura do ano em que a recolha é realizada. A composição química, bem como o tamanho das partículas pode influenciar significativamente os resultados. O material recolhido deve ser visível em relação ao filtro branco. Um rato metaphase propagação normais terá 40 cromossomos acêntricos. O objectivo da técnica é demonstrar uma alteração (ou ausência da mesma) na propo...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente.

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K visualizações.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente. 

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genética

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Imunologia e Infecção

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Bioengenharia

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biologia

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um

Resumo

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Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis por fluorescência múltipla

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando

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