The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Todos os procedimentos de manuseio e tratamento do mouse devem aderir a regras estabelecidas pelos programas legislativo e / ou de cuidados de animais e aprovados por um comitê de cuidados com os animais local. Todos os métodos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care com a aprovação do comitê de cuidados com os animais local. ATENÇÃO: Todos os trabalhos com radioatividade (incluindo, mas não limitado a manipulação do trítio, γ-irradiação externa, manipulação de tecidos animais, resíduos radioativos cama) devem aderir a regras estabelecidas pelas autoridades legislatura e / ou protecção contra as radiações e ser executada por pessoal autorizado pessoal em um laboratório e / ou instalação de certificado. 1. Trabalho animal <ol><li> Agrupamento animal <ol><li> Se os ratos estiver chegando de uma organização externa, aclimatar os animais durante pelo menos 10 dias na unidade animal. Se o estudo inclui vários grupos de tratamento, garantir que o fornecedor animal pode enviar all animais como um único lote. </li><li> Alocar aleatoriamente ratinhos em grupos de tratamento de 10 ratinhos por grupo. Se estiver usando ratos machos da estirpe C57BL / 6, temos o fornecedor de animais pré-organizar randomização de muito jovens C57BL / 6 do sexo masculino em suas instalações para mitigar problemas de agressão. </li></ol></li><li> A exposição crônica de ratos para Internal Radiation β- <ol><li> Prepare as concentrações de trabalho de trítio (10 kBq / L e um MBq / l) em água potável rato diluindo o estoque original da HTO e OBT (uma mistura de prolina tritiada, alanina e glicina ácidos aminados) soluções. </li><li> Validar as concentrações finais de trítio na água de beber, medindo a radioactividade utilizando um contador de cintilação líquida. Ajuste concentrações, se necessário. </li><li> Tratar os animais durante um mês, fornecendo ad libitum acesso à água trítio. Se a água de tratamento fica baixa durante o período de duas semanas, adicione mais água. De outro modo, alterar garrafas em duas semanas. </li><li> Tratar sham irradiado controleratos de forma idêntica. Mantê-los em uma sala &quot;limpa&quot; em separado ou em um rack &quot;limpa&quot; em separado sob pressão de ar positiva para evitar a contaminação cruzada trítio a partir do ar. </li></ol></li><li> A exposição crônica de ratos para External γ-Radiação Nota: facilidade γ-irradiação / equipamento irá variar dependendo da localização. </li><li> Usando os métodos disponíveis de dosimetria, determinar as distâncias de uma fonte de radiação-γ que têm campos de radiação que produzem as doses desejadas. Assegurar a homogeneidade dos campos de radiação dentro das áreas que abrangem as gaiolas dos animais. Nota: 1,7 Gy / h é equivalente a uma taxa de dosagem produzida por um MBq / L trítio no corpo. </li><li> Expor ratinhos por gaiolas colocação do rato a distâncias determinadas no passo 1.3.1, durante um mês. Minimizar interrupção diária de γ-irradiação de 30 min. Use dosímetros termoluminescentes para medir doses totais absorvidas. </li></ol> 2. Sacrifícios e Amostragem <ol&gt; <li> Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis, 60 milímetros pratos de petri com inseridos filtros celulares de 70 micron, 15 ml e 1,5 ml tubos, meio RPMI suplementado com soro fetal bovino a 5% (FBS) e coloque tudo dentro de uma cabine de segurança biológica. Garantindo a esterilidade do trabalho é crucial. </li><li> Pipetar 5 ml de meio RPMI em cada placa de 60 mm de petri. </li><li> Sacrifício camundongos, usando um método aprovado pelo comitê de cuidados com os animais local. Luxação cervical é uma boa escolha para o trabalho esplenï¿½ito descrito neste protocolo. No entanto, se são necessárias amostras de sangue para outros ensaios (por exemplo, para o mFISH, o bloco de micronúcleos citocalasina ou outros ensaios genetoxicity comum), use punção intra-cardíaca após anestesia com isoflurano. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal, com a cabeça apontando para longe de você. Pulverizar o mouse para baixo com etanol 70%. Utilizando uma pinça, pegue a pele anteriormente à abertura da uretra e fazer uma pequena incisão com tesoura na região perineal. <ol&gt; <li> A partir dessa incisão, cortada ao longo da linha média ventral para a cavidade torácica, tendo o cuidado de corte apenas a pele e não a parede muscular debaixo. Dissecar a pele longe da linha média. </li><li> Agarrar a parede abdominal com uma pinça e cortar ao longo do eixo mediano da parede muscular para abrir a cavidade abdominal. </li></ol></li><li> Extirpar o baço levemente segurando-o com uma pinça estéril e delicadamente puxando-o, ao mesmo tempo cortando o tecido conjuntivo com uma tesoura. </li><li> Corte um pequeno pedaço do baço (aproximadamente 1/10 do baço) e coloque em um tubo de 1,5 ml. Pressão congelar em azoto líquido para posterior armazenamento a -80 ° C para ensaios suplementares. </li><li> Inserir o restante do baço em um filtro de células dentro de uma placa de petri de 60 milímetros com 5 ml de meio RPMI pré-dispensada. </li><li> Prossiga para a próxima mouse. Nota: Extraído baços podem ser mantidos em placas de 60 mm com meio (por até 2 horas), enquanto o resto dos ratos são sacrificed. Dependendo do número de pessoas que participam, entre 5 e 15 ratos podem ser processados ​​no mesmo dia. </li></ol> 3. Preparação das Culturas esplenócitos <ol><li> Homogeneizar o baço por picados dentro de um filtro de células com pinça estéril com uma extremidade curva. </li><li> Remover o filtro celular e recolher a suspensão de células filtradas da placa de 60 mm para um tubo de 15 ml. </li><li> Lavar o filtro de células com 5 ml de meios para recolher o restante das células. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA. </li><li> Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 10 ml de RPMI. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA. </li><li> Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 5 ml de meio RPMI. </li><li> Transferência de 4 ml de suspensão de células para um frasco de cultura de tecido de 25 ml e remover para um incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade) </li></ol> 4. Desafiando irradiação e Fixação <ol><li> Transferir orestante 1 ml de suspensão de células a partir do passo 3.8 em um tubo de 1,5 ml em gelo e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Danos no ADN medido na amostra irá representar tanto o dano induzido por tratamento e t = 0 ponto de dados para a construção de uma curva de reparação do ADN. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de tampão TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Delicadamente ressuspender sedimento em 300 mL de TBS. </li><li> Enquanto se mistura num vórtice a baixa velocidade, adiciona 700 ul de etanol a -20 ° C, 100%. Fechar a tampa e inverter algumas vezes para misturar. </li><li> Armazenar as amostras a -20 ° C. Os esplenócitos fixos em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 12 meses sem qualquer perda perceptível no sinal γH2AX. </li><li> Irradiar as culturas de esplenócitos a partir do passo 3.8 com um desafio γ-Rad<html> dose de iation de 2 Gy em uma taxa de dose ≥ 200 mGy / min usando disponível dispositivo de irradiação. Nota: O objetivo desta irradiação é induzir DNA DSB para desafiar a maquinaria de reparo. Raios-X também pode ser utilizado para este fim. </li><li> Retornar imediatamente as culturas para uma incubadora de CO 2. </li><li> 1 hora após o desafio 2 Gy irradiação, retire as culturas da incubadora para uma cabine de segurança biológica. Para recolher uma alíquota de amostra representativa, gentilmente re-suspender as células utilizando um pipetador e transferir 1 ml da suspensão de células para um tubo de 1,5 ml em gelo. Retorno das culturas de células para uma incubadora de CO 2. </li><li> Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de TBS. </li><li> Repita os passos 4,3-4,5. </li><li> 24 horas após o desafio 2 Gy γ-irradiação, a colheita e fixar a amostra = 24 horas, tal como descrito no passo 4,8-4,10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Labeling Immunofluorescent com Anti-γH2AX Antibody Nota: Normalmente, 15-30 amostras por dia pode ser rotulada imunofluorescência e analisadas por citometria de fluxo em uma única corrida. Para garantir uma comparação rigorosa entre os grupos de tratamento, incluem a amostra (s) a partir de cada grupo. Consulte também Referência 16 para mais detalhes. <ol><li> Preparar um conjunto rotulada de tubos para o número de amostras a serem processadas e colocar no gelo. Use 12 x 75 milímetros tubos de vidro não niveladas. A esterilidade não é necessário para este trabalho. Incluir uma amostra de controlo histórico adicional para marcação com anticorpo secundário somente (&quot;unicamente segundo Ab&quot;). Utilize esta amostra de controlo histórico em todos os citometria de fluxo executado dentro de um estudo. </li><li> Adicionar 0,5 ml de TBS arrefecida em gelo a cada tubo. </li><li> Remover esplenócitos fixos de -20 ° C, de vórtice durante 5 segundos e transferir uma alíquota de 0,5 ml para tubos preparados com TBS. Inserir o restante das amostras de volta para -20 ° C e armazenagemmanter como uma amostra de backup. </li><li> Esplenócitos centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de tampão TE (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS em TBS). Incubar durante 20 min em gelo. </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de anticorpo anti-γH2AX primário diluído 1: 150 em tampão TST. Use 200 mL de TST para o &quot;único 2 Ab&quot; amostra de controlo. </li><li> Tubos de posição sobre um agitador rotativo com um ângulo de 45-60 ° e agitar durante 1,5 horas a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto os tubos são a incubação, preparar um volume suficiente (200 ul / amostra) de cabra anti-ratinho anticorpo secundário conjugado com Alexa-488 a uma diluição de 1: 200 em tampão TST. Nota: Todo o trabalho envolvendo Alexa-488anticorpo conjugado (passos 5,10-5,16 abaixo) deve ser feita sob condições de pouca luz e amostras marcadas deve ser protegido da luz por envolvimento tubos em papel de alumínio. </li><li> Uma vez que a incubação de 1,5 horas está completado, adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 2% de FBS a cada um dos tubos e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS contendo 2% de FBS. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de solução de anticorpo secundário a partir do passo 5.8. </li><li> Incubar as amostras em uma plataforma de agitação durante 1 hora como no passo 5.7. </li><li> Adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS arrefecida em gelo. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 0,5 ml de TBS contendo 50 ug / mliodeto de propídio. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente protegida da luz. </li><li> Analisar amostras em um citômetro de fluxo, utilizando protocolos específicos do aparelho 16. Ler, pelo menos, 10.000 células por amostra. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

O protocolo apresentado neste artigo é útil para a realização de rato grande escala estudos in vivo que examinam os efeitos genotóxicos de baixos níveis de vários agentes químicos e físicos, incluindo a radiação ionizante. Nossa biotério livre de patógenos específicos único equipado com um irradiador Gammabeam 150 e um salão de 30 metros de comprimento irradiação permite a realização de estudos ao longo da vida que envolvem irradiações baixa ou muito baixa taxa de dose em centenas ou mesmo...

Controvérsia significativa sobre os potenciais efeitos nocivos, tanto de doses baixas ou muito baixas de radiação e medo do público de radiação, impulsionado por imagens dos bombardeios atômicos de Hiroshima e Nagasaki e de acidentes em usinas nucleares raros ionizante (exacerbada pelos meios de comunicação de massa), tem levado a muito estrita regulação protecção contra as radiações e padrões que não são potencialmente justificada cientificamente. Nas últimas três décadas, numerosos relatórios têm documentado tanto a falta de nocivos e a presença de efeitos biológicos potencialmente benéficos induzidos pela baixa dose de radiação 1-4. O principal fator de risco para a saúde da radiação é a probabilidade de câncer, estimado com base em estudos epidemiológicos de sobreviventes da bomba atômica que receberam doses elevadas ou médias de radiação. Extrapolação linear destes dados (os chamados linear não-limiar ou modelo LNT) é utilizada para estimar os riscos de cancro em doses baixas. No entanto, esta abordagem não tem recebido aceitação científica mundiale é fortemente debatido 5. É evidente que mais estudos são necessários para esclarecer esta questão e, eventualmente, melhorar os padrões de protecção contra as radiações. Esses estudos devem envolver tratamentos crônicos (melhor aproximação das exposições ambientais e ocupacionais), em modelos animais in vivo (melhor para efeitos para a saúde humana) e extrapolar esses pontos finais como taxas de danos no DNA, reparo do DNA e mutagênese. Sabe-se que o DNA é o alvo principal para efeitos de radiação prejudicial e incompleta ou mis-reparação pode levar a mutagênese e câncer desenvolvimento 6. ADN quebras de cadeias duplas (DSB) são um dos tipos mais deletérios de lesões do ADN e podem levar a morte celular e a tumorigénese 7. É, portanto, importante ser capaz de medir com segurança e precisão o nível de ORL após a exposição à radiação de baixa dose e / ou outros factores de stress, tais como poluentes químicos. Um dos marcadores mais sensíveis e específicosde DSB de ADN é fosforilado histona H2AX, chamado γH2AX 8, ainda outros marcadores e métodos têm sido sugeridos 9,10. Estima-se que milhares de moléculas de H2AX, na vizinhança de uma DSB induzidos, estão envolvidos na formação de γH2AX possibilitando a detecção de ORL indivíduo por marcação imunofluorescente com um anticorpo e microscopia de fluorescência de anti-γH2AX 11. A resposta é muito rápido, atingindo um máximo entre 30 e 60 min. Existem evidências de que γH2AX facilita o reparo de DNA DSB, atraindo outros fatores de reparação para os sites de pausas e modificando a estrutura da cromatina para ancorar as extremidades do DNA quebrados e fornecer acesso para outras proteínas de reparo (revisto em 12). Após a conclusão do reparo de DNA DSB, γH2AX fica de-fosforilada e / ou sofre degradação, e moléculas H2AX recentemente sintetizadas substituir γH2AX nas áreas afetadas da cromatina 10. Formação e perda de γH2AX Monitoramento pode,portanto, fornecer uma estimativa precisa da cinética de reparo de DNA DSB. Esta abordagem tem sido utilizada para estudar a reparação de DSB em várias linhas celulares tumorais humanas irradiadas com doses elevadas de radiação e a sua taxa de DSB e níveis residuais foram mostrados para correlacionar com radiossensibilidade 13-15. Nós modificamos essa abordagem experimental e aplicou-a a um estudo de rato in vivo para examinar os efeitos de baixas doses de γ- crônica e β-irradiação sobre os níveis de ADN DSB e reparação (Figura 1). Em primeiro lugar, nós demonstramos um método para executar uma exposição crónica a longo prazo de ratinhos para β-radiação emitida pela ou trítio (hidrogénio-3) sob a forma de água tritiada (HTO) ou como trítio ligado organicamente (OBT) dissolvido na água potável . As duas formas são de esperar a acumulação e / ou distribuir de forma diferente no corpo e, por conseguinte, produzir diferentes efeitos biológicos. Ambas as formas são possíveis riscos na indústria nuclear. Este tratamentoé comparada com a exposição crónica à radiação-γ a uma taxa de dosagem equivalente a permitir uma comparação correcta dos dois tipos de radiação, que é fundamental para a avaliação da sua eficácia biológica relativa. -Radiação Beta é composto de electrões, tornando-se muito diferente da radiação γ, fotões de alta energia. Devido a esta diferença, Β-radiação representa perigo para a saúde na maior parte interna e pode produzir diferentes efeitos biológicos em comparação com γ-radiação. Esta complicação resultou em controvérsias significativas sobre a regulação da exposição a β-radiação emitida pelo HTO. Assim, os níveis regulatórios de HTO na água potável para o público variam de 100 Bq / L na Europa para 75.000 Bq / L na Austrália. É, portanto, importante para comparar os efeitos biológicos de HTO a doses equivalentes de γ-radiação. Em segundo lugar, a taxa de DNA DSB é medido em esplenócitos isolados após a conclusão de exposições crônicas usando imunofluorescência marcado γH2AX detectared por citometria de fluxo. Isto permite a avaliação da extensão do dano do ADN infligido por as exposições in vivo. No entanto, é sensato esperar que tais exposições de baixo nível pode não produzir quaisquer taxas detectáveis ​​de DNA DSB; em vez disso, algumas alterações ocultas / respostas pode-se esperar que afetariam a capacidade das células para reparar danos no DNA. Estas alterações, quando detectado, pode ser ou estimulador (a produção de um efeito benéfico) ou inibidor (que produz um efeito deletério). O protocolo proposto permite revelar tais alterações por desafiar os esplenócitos extraídos com uma dose elevada de radiação que produza uma quantidade significativa de danos (por exemplo, 2 Gy produzindo aproximadamente 50 DSB de ADN por célula ou um 3 -. Aumento de 5 vezes no nível γH2AX total) . Subsequentemente, a formação e a perda de γH2AX, reflectindo o início e conclusão de reparação de DSB, é monitorizada por citometria de fluxo. Desta forma, não só os níveis basais e induzida por tratamento de DSB de ADN pode ser medido, mastambém o seu efeito potencial sobre a capacidade das células para responder e reparar danos ao DNA induzidos por níveis muito mais elevados estressores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Exposição à radiação de dose baixa pode produzir uma variedade de efeitos biológicos, que são diferentes em quantidade e qualidade dos efeitos produzidos por doses elevadas de radiação. Abordar questões relacionadas com a segurança da saúde ambiental, ocupacional e público de uma forma adequada e cientificamente justificada depende fortemente a capacidade de medir com precisão os efeitos biológicos de poluentes doses baixas, como as substâncias químicas e radiação ionizante. Danos e reparação do ADN são os mais importantes indicadores precoces de riscos para a saúde devido às suas potenciais consequências a longo prazo, como o cancro. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar o efeito da crônica exposição in vivo a doses baixas de radiação β γ- e sobre os danos e reparação do ADN em células de baço de ratinho. Usando um marcador geralmente aceite de quebras de ADN de cadeia dupla, histona H2AX fosforilada chamado γH2AX, demonstramos como ele pode ser usado para avaliar não só os níveis de danos no DNA, mas também mudana capacidade de reparo do DNA potencialmente produzido por dose baixa em exposições in vivo. A citometria de fluxo permite a medição rápida, precisa e fiável de imunofluorescência marcado γH2AX em um grande número de amostras. ADN de cadeia dupla reparação de quebras pode ser avaliada por exposição esplenócitos extraídos a uma dose desafiadora de 2 Gy de produzir um número suficiente de ADN para provocar quebra reparação e medindo o induzido (1 h pós-irradiação) e danos no ADN residual (24 hrs pós-irradiação). Danos no ADN residual seria indicativo de reparação incompleta e o risco de instabilidade genómica longo prazo e cancro. Combinado com outros ensaios e de pontos finais que podem ser facilmente obtidos em tais estudos in vivo (por exemplo, as aberrações cromossômicas, freqüências de micronúcleos em reticulócitos de medula óssea, a expressão do gene, etc.), esta abordagem permite uma avaliação precisa e contextual dos efeitos biológicos estressores de baixo nível.

A Figura 2 mostra exemplos de citometria de fluxo gráficos esperados para os esplenócitos preparados utilizando o método descrito aqui. As células são primeiro fechado com base na &lt;eletrônico dispersão volume-lateral&gt; gráfico de dispersão (Figura 2A e 2D, volume eletrônico é equivalente a dispersão para a frente). FL3 / propidium histogramas de iodo (Figura 2B e 2E) confirmar distribuição normal do ciclo celular. Sin...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K visualizações.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Biologia

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

Um método altamente reprodutível e fácil de executar<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.