This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant n&#186; 32003B_127619).

Cultura 1. celular <ol><li> Células de cultura de hepatoma humano HepG2 6 em 25 centímetros 2 frascos de cultura de células em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa incubadora (5% de CO 2, 95% de ar) (densidade de sementeira: 1 X 10 6 células por balão de cultura de 25 centímetros de células 2, tempo de incubação na incubadora a 37 ° C: 48 horas, a densidade celular em confluência: 4-5 x 10 6 culas por 25 cm garrafa de cultura de 2 célula). </li><li> Executar as experiências quando as células são de 90% a 95% confluentes. </li></ol> 2. High-resolution Respirometria calibração de sensores de oxigênio Polarográfico <ol><li> Pipetar 2,1 ml de tampão de respiração numa câmara de oxygraph e agita-se o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h até que um sinal de fluxo de oxigénio estávelo sensor de oxigénio é obtido polarográfica. NOTA: eletrodos de oxigênio Polarográfico dentro de cada concentração medida de oxigénio câmara oxygraph e calcular o consumo de oxigênio (fluxo) dentro de cada câmara. A concentração de oxigénio e as taxas de consumo de oxigênio (de fluxo) são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados. </li><li> Executar uma calibração de ar do sensor de oxigénio polarográfico de acordo com os protocolos do fabricante 14. NOTA: A calibração de sensores de oxigênio polarográficos em media respiração e concentração de oxigênio nos meios de comunicação na saturação do ar temperatura experimental é realizada apenas uma vez por dia no período da manhã. Depois, os meios de comunicação pode ser removido das câmaras e as células ressuspensas em meios frescos respiração são adicionados a uma câmara de oxygraph e taxas respiratórias são medidos. Após a primeira experiência, a câmara pode ser lavada e uma série adicional de experiências pode ser realizada em tele mesma câmara sem mais calibrações. </li></ol> 3. A tripsinização de células aderentes, contagem de células <ol><li> No dia da experiência, aspirar o DMEM a partir do balão de cultura de 25 centímetros de células 2. </li><li> Lavar a monocamada de cultura de células no frasco de cultura com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Pipetar 0,5 ml de 25 mg / ml de solução de tripsina (pré-aquecido a 37 ° C num banho de água a 37 ° C) na monocamada de células no recipiente de cultura e incuba-se durante 5 min a 37 ° C num CO incubadora (5% 2 , 95% de ar). </li><li> Pipetar 5 ml de DMEM contendo FBS a 10% para as células destacadas do frasco de cultura de células e suspender as células por pipetagem. </li><li> Transferência de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar novamente suspensas durante 5 min a 350 xg à temperatura ambiente e decanta-se o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de tampão de respiração 13 (T abela 1). </li><l<html> i&gt; Contar as células utilizando um contador de células e ressuspender-los em tampão de respiração para uma densidade final de 1 x 10 6 células / ml. Como as taxas de respiração celular será normalizado ao número de células, contar as células com um contador de células exato e preciso. </li></ol> 4. High-resolution Respirometria <ol><li> Depois de calibração do ar (realizada apenas uma vez por dia, as etapas de 2,1-2,2), aspirar o meio a partir de uma câmara de respiração do oxygraph e adicionar 2,1 ml de suspensão de células (1 X 10 6 células / ml) a partir do passo 3.7 para a câmara. </li><li> Fechar a câmara de oxygraph por inserção da rolha. </li><li> Agita-se continuamente as células com uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. NOTA: A concentração de oxigênio e sinal de fluxo de oxigênio são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dadoss = &quot;xref&quot;&gt; 14. </li><li> Em seguida, injectar substratos e inibidores para a respiração mitocondrial através dos orifícios de injecção de titânio das rolhas, utilizando os seguintes protocolos. </li></ol> 5. Digitonin titulação em células intactas por Respirometria <ol><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo. </li><li> Injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 uM) &#39;CUIDADO &quot;para dentro da câmara oxygraph contendo suspensão de células através da porta de injecção de titânio da rolha de câmara usando uma seringa e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é conseguido . NOTA: Todas as injeções nas seguintes etapas são realizadas através dos portos de injeção de titânio de rolhas usando seringas. A adição de rotenona é opcional (que evita o fluxo de electrões reversa) e pode ser omitida no caso de experiências de titulação digitonina, verpasso 6.3. </li><li> Injecte 20 ul de succinato 1 M (10 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Injectar 2 ul de digitonina 2 mM (2 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular para 2-5 min, até que um sinal de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Novamente injectar 2 ul de 2 mM de digitonina para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular para 2-5 min, até que um sinal de oxigénio estável é alcançada. NOTA: adição gradual de digitonina para as células irá induzir um aumento no consumo de oxigénio celular e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar. </li><li> Continuar injectando 2-4 ul de 2 mM stepwise digitonina (2-4 uM em cada passo) para dentro da câmara. Após cada etapa, registrar a respiração celular para 2-5 maté que é alcançado um sinal de fluxo de oxigénio estável. NOTA: Pare de injetar digitonina quando o sinal de fluxo de oxigênio atinge um nível máximo e mais injecções de digitonina não aumentam a taxa de respiração. Os leitores devem determinar a concentração de digitonina ideal em seus laboratórios usando seus próprios reagentes e uso obtidos concentração ideal digitonina nos passos 6.2 e 7.2 dos seguintes protocolos para seus experimentos. </li></ol> 6. Avaliação da integridade de membrana mitocondrial externa: citocromo C <ol><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo. </li><li> Injectar 2 ul de digitonina mM de oito (8 uM) para a câmara de oxygraph contendo a suspensão de células (1 x 10 6 / ml) e permeabilizar as células durante 5 min. </li><li> Injecte 20 ul de succinato 1 M (10 mM) para a câmara de oxygraph e gravar Respirat celularde iões para 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. NOTA: A adição de ADP para as células irão estimular complexo I e induzir um aumento no consumo de oxigénio, e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar e estabilizar. </li><li> Injectar 5 ul de 4 mM de citocromo c (10 pM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Finalmente injectar 1 ml de 4 mg / ml de oligomicina (2 ug / ml) e gravar a respiração celular até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li></ol> 7. máxima do ADP estimulado Respiração (estado 3) de células permeabilizadas HepG2 <ol><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo.</li><li> Injectar 2 ul de digitonina mM de oito (8 uM) para a câmara de oxygraph contendo a suspensão de células e permeabilizar as células durante 5 min. </li><li> Injectar 12,5 ul de 0,8 M de malato (5 mM) e 10 ul de 2 M de glutamato (10 mM) para a câmara de oxygraph. respiração celular da ficha, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza. NOTA: A adição de ADP às células irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar. </li><li> Injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 M) &quot;CUIDADO&quot; para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza. </li><li> Em seguida, injectar 20 jil de um succinato H (10 mM) para a câmara de oxygraph gravar e até que a respiração celular sinal aumenta o fluxo de oxigénioe estabiliza. </li><li> Em seguida, injetar 2 mL de 5 mM antimicina A (5 M) &quot;CUIDADO&quot; para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza. </li><li> Em seguida, injectam 2,5 ul de ascorbato 0,8 mM (1 mM) e imediatamente após a injecção 2,5 ul de TMPD 0,2 mM (0,25 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza. </li><li> Finalmente Injectam-se 10 ul de azida de sódio 1 M (5 mM) &quot;CUIDADO&quot; para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigénio e estabiliza. </li></ol> 8. Consumo de Oxigênio de células intactas <ol><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo. </li><li> Injectar 1 ul de 4 mg / ml de oligomicina (2 ug / ml) para dentro da câmara oxygraph contendo uma suspensão de célulasd ficha respiração celular até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Depois injetar 1 ml de 0,2 mM de FCCP (0,1 M) &quot;CUIDADO&quot; para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que o oxigênio sinal aumenta fluxo e estabiliza. </li><li> Injectar 3 uL de 0,2 mM de FCCP (0,4 uM) para a câmara de oxygraph gravar e até que a respiração celular sinal aumenta ainda mais o fluxo de oxigénio e estabiliza. </li><li> Titula-se FCCP em 0,1 a 0,3 uM passos 1-3 por injecção de ul de 0,2 a 1 mM de FCCP (0,1 a 2 uM concentração final na câmara) para dentro da câmara oxygraph até que o sinal de fluxo de oxigénio atinge o seu nível máximo e sem mais aumentos e, em seguida começa a diminuir. NOTA: Pare de injetar FCCP quando o sinal de oxigênio atinge um nível máximo e começa a diminuir. </li><li> Em seguida, injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 mM) e 2 ul de 5 mM de antimicina A (5 uM) para dentro da câmara. Grave a respiração até tele diminui sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza. </li></ol>

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An Introduction to OXPHOS Analysis.</a> Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O objetivo do presente protocolo foi a utilização de alta resolução respirometria para medir mitocondrial complexos da cadeia respiratória &quot;(I-IV) taxa respiratória, a capacidade do sistema de transporte de elétrons mitocondrial máxima e integridade mitocondrial externa da membrana. Existem alguns passos críticos dentro do presente protocolo. Em primeiro lugar, as taxas de consumo de oxigénio celular são geralmente normalizados para o número de células (pmol / [seg x númer...

As mitocôndrias desempenham papéis importantes no metabolismo da energia celular, especialmente através da utilização de oxigénio para a produção de trifosfato de adenosina (ATP). Eles são implicados na morte de células e em várias doenças humanas. fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) combina transporte de elétrons ao longo da cadeia de transporte de elétrons com o consumo de oxigênio e síntese de ATP. O ciclo mitocondrial tricarboxílico (TCA) está envolvido na conversão de proteínas, hidratos de carbono e gorduras, em compostos ricos em energia como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) e flavina adenina dinucleótido (FADH 2). Os electrões do NADH e FADH2, em seguida, são transferidos para os complexos de proteína de transporte de electrões da cadeia respiratória (I a IV) localizado na membrana mitocondrial interna. Além disso, dois outros percursos redox pode transferir electrões para corrente de transporte: i) mitocondrial de electrões transferência flavoproteína (FEF), que está localizado na face da matriz interior Mitomembrana condral, e fornece elétrons de ácidos graxos β-oxidação; e ii) glicerofosfato desidrogenase mitocondrial que oxida glicerofosfato de fosfato de dihidroxiacetona e alimenta elétrons para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. IV Complex (o receptor de elétrons final) transfere os elétrons a uma molécula de oxigênio, convertendo oxigênio para duas moléculas de água. Movendo dos electrões do complexo cadeia de transporte electrónico respiratório I a IV é acoplado com o fluxo de protões a partir da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar que estabelece um gradiente electroquímico através da membrana interna mitocondrial. Depois, mitocondrial complexo V (ATP sintase) transporta os íons de hidrogênio de volta para a matriz mitocondrial e sintetiza moléculas de ATP. OXPHOS função pode ser avaliada in vivo e in vitro utilizando várias técnicas e vários estados da respiração mitocondrial pode ser obtido. Em mitocôndrias isoladas a seguinte influencestados Ry pode ser medido: i) basal respiração mitocondrial (estado 1), ii) o consumo de oxigénio após a adição de substratos específicos dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (estado 2), iii) o consumo de oxigénio mitocondrial máxima após a adição de concentrações saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) e, iv) a respiração de repouso após o consumo de ADP (convertido em ATP) (estado 4). Em células intactas as seguintes estados respiratórios podem ser medidos: i) consumo de oxigénio celular basal, na presença de substratos endógenos e ADP, ii) o consumo de oxigénio celular basal, na presença de oligomicina (oligomicina-insensível respiração) e oligomicina-sensível respiração (ATP volume), iii) FCCP respiração desacoplado, e iv) a respiração não-mitocondrial após a adição de antimicina a e rotenona. Em células permeabilizadas, podem ser adicionados os substratos específicos dos complexos de cadeia de transporte electrónico e máximas de ADP e dependente de complexos s taxas respiratóriasuch I- tão complexo, II- e respiratória IV-dependentes podem ser medidos. As medições da respiração celular fornecem importantes insights sobre a capacidade respiratória mitocondrial específico para complexos I-IV, integridade mitocondrial eo metabolismo 1, 2, 3 energia. Um dos dispositivos que permitem que as medições de consumo de oxigénio mitocondrial com alta precisão, sensibilidade e resolução é o oxygraph de alta resolução 4. O dispositivo de alta resolução oxygraph contém duas câmaras com as portas de injecção e cada câmara está equipada com um sensor de oxigénio polarográfica. suspensões mitocondriais celulares ou isoladas são agitados continuamente no respirometer. Para avaliar a função mitocondrial, substratos e inibidores de atividade complexa mitocondrial podem ser adicionados de acordo com protocolos padrão. Os substratos e inibidores pode ser titulado por injecção into as câmaras do oxygraph, e as taxas de consumo de oxigênio são calculados usando o software e expressa como picomoles por segundo por número de células. De alta resolução ventilometria oferece várias vantagens sobre dispositivos eletrodo de oxigênio polarographic tradicionais e convencionais, incluindo aumento da sensibilidade ea capacidade de trabalhar com um pequeno número de amostras biológicas, tais como células intactas ou permeabilizadas. Além disso, cada dispositivo contém duas câmaras, e taxas respiratórias podem ser gravados simultaneamente para as comparações das concentrações de oxigénio. O oxygraph de alta resolução, também tem a vantagem de redução das fugas de oxigénio a partir das câmaras do dispositivo em relação aos dispositivos de eléctrodos de oxigénio polarográficos tradicionais. Outro dispositivo recentemente desenvolvido para medir o consumo de oxigênio celular é a de 96 poços analisador de fluxo extracelular 5. O analisador de fluxo extracelular está equipado com sensores de fluorescência em vez de polarografia. As vantagens da extracelularanalisador de fluxo em comparação com o oxygraph de alta resolução são i) é em grande parte um dispositivo automatizado, ii), é possível medir o consumo de oxigénio em 24 e placas de 96 poços para rastreio de elevado rendimento, necessitando de menores quantidades de amostras biológicas, e iii) medição adicional do fluxo glicolítico celular é possível. As desvantagens do analisador de fluxo extracelular em comparação com o oxygraph de alta resolução são: i) os elevados custos do dispositivo e de bens de consumo, tais como placas fluorescentes, que são não reutilizáveis, e ii) apenas quatro compostos por ensaio / poço são injectável , por conseguinte, o sistema não é praticável para protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor. No presente estudo, utilizamos de alta resolução respirometria para determinar respiração mitocondrial. Para as experiências de consumo de oxigénio celulares, as células são permeabilizadas para permitir a entrada de ADP exógeno e mitocondriais substratos oxidáveis ​​para a alimentação de electrões em complexes do sistema respiratório. Esta abordagem permite a dissecção de complexos mitocondriais individuais capacidades respiratórias, o que é uma vantagem distinta em relação a células intactas (muitos substratos são de célula-impermeabilizante). No entanto, a permeabilização da membrana celular irá perturbar a barreira entre o citosol e o espaço extracelular e forma (lavagem de solutos citosólicas) e a composição do espaço intracelular é equilibrada com o meio extracelular. Uma das desvantagens de células permeabilizadas sobre células intactas é que a membrana mitocondrial externa pode ser danificado se quantidades excessivas de detergente são empregues durante a permeabilização celular. Em células intactas, basal, respiração das células intactas acoplado e desacoplado pode ser medido. Este método avalia o consumo de oxigénio de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado e também fornecer informação sobre máxima transpo de electrões mitocondrialcapacidade rt 6, 7. Uma das vantagens de células intactas sobre células permeabilizadas é que ambiente celular não é interrompido e as mitocôndrias são em contacto com toda a componentes das células. A fim de permeabilizar a membrana plasmática celular, tais como detergentes digitonina foram utilizados 8. No entanto, a integridade da membrana exterior mitocondrial pode ser comprometida se são empregues quantidades excessivas de digitonina. Para confirmar que a integridade da membrana mitocondrial externa não está comprometida em células permeabilizadas, a titulação é efectuada de digitonina para determinar a concentração óptima para permeabilização celular. Para estas experiências, as células são ressuspensas em meio de respiração e concentração de digitonina é titulado por ventilometria na presença de substratos mitocondriais e ADP, e taxas respiratórias são medidos. Respiração de células intactas, não-permeabilizadas não é estimulado na presença de mitochondrial substratos e ADP. No entanto, a titulação subsequente digitonina gradual renderia permeabilização gradual de membranas de plasma, e a concentração óptima é obtida digitonina. Isto é mostrado pelo aumento da respiração até permeabilização completo. Mitocondrial qualidade e integridade da membrana externa pode ser verificada por adição exógena citocromo c 2, nove. Citocromo c é uma proteína transportando 12 elétrons kDa da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons 10, 11, 12. Ele está localizado no espaço intermembranar mitocondrial, e está envolvido no consumo de oxigénio, transportar electrões do complexo III a IV complexo. Uma vez que a membrana mitocondrial externa está danificado, citocromo c é liberado, e o consumo de oxigénio é reduzida mitocondrial. Após a adição de citocromo c exógeno, qualquer aumento na respiração mitocondrial é indicativo de uminterrompido membrana mitocondrial externa. Em células permeabilizadas, substratos e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados seguindo vários protocolos de 3, 9. Por exemplo, a fim de investigar as taxas respiratórias-driven complexos mitocondriais, o protocolo seguinte pode ser usado. Após a permeabilização das células, o primeiro complexo I é estimulada pela malato substratos e glutamato, os quais geram o NADH como um substrato para a cadeia respiratória e provocam a activação do complexo I. Em seguida, o ADP é adicionado para a conversão de ATP (estado 3, activa complexo I-dependente respiração). Depois de um sinal estável seja alcançado, rotenona (complexo I mitocondrial inibidor) é administrado para inibir complexo I. rotenona é seguido por succinato de FADH 2 e para activar o complexo II (estado 3, activa complexo respiração II-dependentes). A fim de medir a respiração dependente do complexo IV, primeiro complexo IIIrespiração -dependente é inibida pela adição de antimicina A (inibidor mitocondrial complexo III). Em seguida, a respiração complexo dependente de IV é estimulado através da administração de ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD pode auto-oxidam no buffer de respiração, por conseguinte, a taxa de respiração máxima complexo dependente de IV (estado 3) é calculada subtraindo-se as taxas respiratórias antes e depois da adição de azida de sódio, um inibidor do complexo mitocondrial IV. As experiências de respiração pode ser levada a cabo em duas câmaras de um oxygraph em paralelo um servindo como um controlo (células não estimuladas), o outro contendo as células estimuladas. Obviamente, as células podem ser pré-tratados de várias maneiras, por exemplo, com drogas que afectam funções mitocondriais, antes de o seu consumo de oxigénio é medida na câmara de oxygraph. Este protocolo permite o exame funcional dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial individuais. Além disso, pode-se medir a ADP-estimulada máximarespiração (estado 3) de células permeabilizadas, utilizando ácido gordo exógeno sob a forma de palmitato. Neste protocolo, as ações concentradas de palmitato de sódio são conjugados com ácido graxo de ultra albumina do soro bovino livre (BSA) (6: 1 proporção molar de palmitato: BSA). Em seguida, as células são primeiro permeabilizadas com digitonina e a respiração mitocondrial é avaliada pela adição de carnitina e ácido palmítico, seguido pela adição de ADP (estado 3, respiração máxima). Então, oligomicina é adicionado para imitar o estado 4 (estado 4o) e índice de controlo respiratório (valor RCR) é calculado como o estado 3 / estado 4o. β-oxidação promove a produção de acetil-CoA (que entra no ciclo do TCA) e geração de FADH 2 e NADH, os electrões dos quais são passados para a cadeia de transporte de electrões por flavoproteína de transferência de electrões e β-hidroxiacil-CoA-desidrogenase. As mitocôndrias são colocados no centro do metabolismo do ácido gordo e descrito protocolo palmitato-BSA pode ser usado por investigadores examinam gorduraa oxidação de ácidos Ty. Em células intactas, ativadores e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados na sequência de um protocolo diferente 6, 9. Para estas experiências, primeiro o consumo de oxigénio de células não-permeabilizadas, na ausência de substratos exógenos é medido (fosforilar taxa de respiração). Em seguida, a taxa de respiração de não-fosforilação é medida após a adição de oligomicina, que é um inibidor da ATP sintase mitocondrial. Em seguida, o cianeto de carbonilo protonophore p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) é administrado em várias concentrações e a taxa respiratória mitocondrial desacoplada máxima é medida. Protonophores tais como FCCP pode induzir um aumento na permeabilidade de protões da membrana interior, permitindo o movimento passivo de protões para dissipar o gradiente quimiosmótica. Um aumento na permeabilidade de protões desacopla respiração oxidativo (sem a produção de ATP) e induz um aumento na óconsumo xygen. Depois, rotenona e antimicina A são adicionados para inibir a respiração mitocondrial, e a respiração mitocondrial não é subtraída de todas as outras taxas respiratórias. As taxas de consumo de oxigénio pode ser expresso como 2 IO [pmol x seg-1 x 10 células -6] (fluxo de oxigénio por milhão de células) que é calculado dividindo-se o fluxo de oxigénio específicos do volume (em oxigénio na câmara fechada), JV, ó 2 [pmol x seg -1 x ml-1], através da concentração de células na câmara de células (número de células por volume [10 6 células ∙ ml 1]) 15. Cell-massa fluxo de oxigênio específico, JO 2 [pmol x seg -1 x mg -1], é o fluxo por célula, IO 2 [pmol x seg -1 x 10 -6 células], divididos em massa por célula [mg ∙ 10 6 células]; ou específicos de volume de fluxo, JV, O 2 [pmol x seg -1 x ml -1], dividido por massa por volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 é o fluxo de oxigénio por proteína de células, peso seco ou volume celular. No presente estudo, usando alta resolução ventilometria, que descrevem protocolos para determinar i) concentração óptima de digitonina para completa a permeabilização da membrana do plasma celular (ensaio de titulação de digitonina), ii) a integridade mitocondrial externa da membrana utilizando exógeno citocromo c, iii) complexos da cadeia respiratória mitocondrial I , II e IV as taxas respiratórias máximas em células HepG2 permeabilizadas-digitonina, na presença de ADP exógeno e substratos da cadeia respiratória mitocondrial, e iv) basal, acoplado e máxima respiração desacoplado (capacidade de transporte de electrões máxima) de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">ADP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 4386</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 8674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:156px;">Ascorbate</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.00127</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">BSA</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 6003</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FCCP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 2920</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:75px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;">Automated cell counting instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Cytochrome c</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 7752</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Digitonin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">D 5628</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">31966021</td>
			<td style="width:92px;">Medium</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">EGTA</td>
			<td style="width:92px;">fluka</td>
			<td style="width:75px;">3779</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FBS</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">26010-074</td>
			<td style="width:92px;">Medium component</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Glutamate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma,</td>
			<td style="width:75px;">G 1626</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Hepes</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">H 7523</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KCl</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04936</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04873</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">K-lactobionate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">L 2398</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">MgCl2</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">M 9272</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:75px;">10000-02</td>
			<td style="width:92px;">High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">O 4876</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">15140122</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S2002</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Rotenone</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">R 8875</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Succinate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S 2378</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Taurine</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 8691</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">TMPD</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 3134</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td>T 4674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Determinação da Optimum Digitonin Concentração para Cellular permeabilização: Digitonin Titulação Experiment A digitonina da titulação é efectuada para determinar a concentração óptima para permeabilização das células HepG2. Para estas experiências, a digitonina é titulado em células intactas na presença de rotenona, succinato (complexo mitocondrial substrato II) e uma quantidade saturante de ADP (que induzem...

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Respirometria de alta resolução para avaliar a função mitocondrial em células permeabilizadas e intactas | Biologia | Vídeo

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória &quot;(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

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41.2K visualizações.  University of Bern.  respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana. 

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A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Mitochondrial fusion was measured by tracking the equilibration of photoconverted matrix-targeted GFP across the mitochondrial network over time. Thus far, only one cell could be subjected to an hour long kinetic analysis at a time. We present a method that simultaneously measures multiple cells, thereby speeding up the data collection process.

Uma resolução mais rápida, alta, MTPA-GFP baseada em ensaio de fusão mitocondrial aquisição de dados cinéticos de várias células em paralelo usando microscopia confocal

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Biologia

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Estudar mitocondrial estrutura e função em<em&gt; Drosophila</em&gt; ovários

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or enzymes are involved in the pathogenesis of several diseases. Mitochondrial substrate flux can be studied using intact cells, permeabilized cells, or isolated mitochondria. Investigating intact cells encounters several problems due to simultaneous oxidation of different substrates. Besides, several cell types contain internal stores of different substrates that complicate results interpretation. Methods such as mitochondrial isolation or using permeabilizing agents are not easily reproducible. Isolating pure mitochondria with intact membranes in sufficient amounts from small samples is problematic. Using non-selective permeabilizers causes various degrees of unavoidable mitochondrial membrane damage. Recombinant perfringolysin O (rPFO) was offered as a more appropriate permeabilizer, thanks to its ability to selectively permeabilize plasma membrane without affecting mitochondrial integrity. When used in combination with microplate respirometry, it allows testing the flux of several mitochondrial substrates with enough replicates within one experiment while using a minimal number of cells. In this work, the protocol describes a method to compare mitochondrial substrate flux of two different cellular phenotypes or genotypes and can be customized to test various mitochondrial substrates or inhibitors.

In this work, we describe a modified protocol to test mitochondrial respiratory substrate flux using recombinant perfringolysin O in combination with microplate-based respirometry. With this protocol, we show how metformin affects mitochondrial respiration of two different tumor cell lines.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...