Este projecto foi financiado por doações do Ministério Singapore da Educação (MOE, número de concessão 2013-T2-2-126) e do Instituto Nacional de Saúde, EUA (NIH, conceda número 1R21AT008452-01A1). TY recebeu uma bolsa de pós-graduação do Departamento de Ciências Biológicas NUS. Agradecemos a unidade confocal do Centro de Ciências NUS bioimaging (CBIS) pelo seu apoio constante.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura (R14-293). 1. Os peixes Pecuária e à colheita de embriões <ol><li> Levante WT, CTSK: nlGFP 24, RANKL: HSE: PCP 24, e OSX: mCherry 21 simples ou peixe medaka composto transgénico a 26 ° C sob um ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h escuro) para induzir a desova. </li><li> desova diária ocorre durante os primeiros 30 minutos após a luz é ligado. Os ovos ficar juntos através de filamentos e anexar ao abdômen da fêmea por várias horas. Use uma rede de malha fina para pegar uma fêmea adulta que transporta um conjunto de ovo. Deixe o peixe descansar brevemente na rede e, em seguida, massageie suavemente o abdômen do peixe para retirar cuidadosamente o cluster óvulo fertilizado do abdome da fêmea. NOTA: Uma fêmea medaka saudávelpode produzir 10 - 20 ovos por dia durante cerca de 5 meses. </li><li> Coloque os ovos em uma 60 mm plástico placa de Petri. Usar uma pipeta de plástico para lavar os embriões com 5-10 ml de de 0,3x Danieau forma de solução (peixe; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, MgSO4 0,13 mM, Ca 0,2 mM (NO 3) 2, e 1,7 mM de HEPES, pH 7.0). Adicionar 1 ml de uma 0,25% (w / v) de solução azul de metileno estoque para 2,5 L de meio de peixes para prevenir o crescimento de fungos. </li><li> Rode ligeiramente aglomerado de ovo para formar um nó de filamentos de fixação. Use uma pinça para remover cuidadosamente os filamentos de fixação dos aglomerados de ovos fertilizados para obter embriões individuais (Figura 1A). </li><li> Estágio os embriões de acordo com Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embriões por 60 milímetros de plástico em placas de Petri de 28 ° C incubadora. Alterar a média diária para assegurar o desenvolvimento normal dos embriões. NOTA: O tempo em volta do palco para incubação (8-9 d pós-fertilização,DPF) é especialmente crítica para a sobrevivência. Remover córions de livre flutuação para manter o meio limpo e para garantir boas taxas de sobrevivência das larvas. </li></ol> 2. Rastreio Embryo Transgenic <ol><li> Use um estereomicroscópio equipado com uma lâmpada de mercúrio para imagens de fluorescência e GFP, RFP, e os filtros da PCP para a tela embriões transgênicos para a expressão repórter fluorescente utilizando 40X. </li><li> Identificar visualmente OSX: embriões mCherry por expressão repórter mCherry no início de formação de ossos cranianos, tais como o cleitro, em ambos os lados da cabeça posterior (Figura 1B, seta), e o parasphenoide, numa posição central no crânio ventral ( Figura 1B, cabeça de seta). NOTA: expressão Reporter começa a partir de 5 DPF em diante 21. </li><li> Identificar CTSK: embriões nlGFP por expressão nlGFP forte na cabeça (Figura 1C, seta) e uma cauda (Figura 1C, seta), a partir de6 DPF. NOTA: osteoclastos endógenos formam apenas depois de 21 DPF. células neste estágio inicial (6 DPF) nlGFP expressando não são osteoclastos, mas outra, até agora não caracterizada, CTSK células -positivas 24. </li><li> Identificar RANKL: HSE: PCP embriões transgénicos por expressão ubíqua PCP depois de um tratamento a curto choque térmico durante 20 min a 39 ° C, conduzida em duas DPF ou posterior para fins de rastreio. NOTA: A RANKL e PCP transgenes estão sob o controle do mesmo bidirecional Choque elemento térmico (HSE). Expressão PCP indica indução bem-sucedida RANKL 24. </li><li> Executar uma 1,5-2 h tratamento de choque térmico a 9 DPF ou mais tarde, para induzir um grande número de osteoclastos ectópica na região do tronco, o que consequentemente resulta em um fenótipo osteoporose-like 24. NOTA: expressão RANKL Transgenic induzida em 9 resultados da DPF em uma ativação ectópica de células progenitoras osteoclastos dormentes, que endogenamente não é acionadoantes de 21 de DPF. Usar um banho de água para se obter condições estáveis ​​a 39 ° C. Deixe as placas de Petri contendo embriões medaka flutuar na superfície da água. Certifique-se a tampa da placa de petri é seco, para impedir o afundamento do prato. </li><li> Embriões de tela de linhas compostas, tais como RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP double-transgênica e OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP triple-transgênica, de acordo com o padrão de cada transgene indivíduo expressão. NOTA: embriões transgênicos hemizygous e homozigotos foram distinguidos por diferentes níveis de fluorescência do transgene repórter. embriões homozigóticos tinham uma intensidade de fluorescência que aproximadamente duplicou em comparação com a de transgênicos hemizigóticas. Linhas de compostos que eram homozigotos para ambos RANKL: HSE: PCP e CTSK: nlGFP foram obtidos por incrossing repetido ao longo de várias gerações. Para triple-transgênica OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP,<html> RANKL homozigoto: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP foram cruzados com OSX homozigoto: portadores mCherry. A progênie triple-transgênico heterozigoto resultante foram levantadas e incrossed obter embriões homozigotos para RANKL: HSE: PCP. O RANKL: HSE: PCP transgene deve ser homozigótica, a fim de obter a indução eficiente de osteoclastos ectópicas. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT e Transgenic Medaka embriões em 7 D pós-fertilização (DPF). Uma. embriões WT observado com iluminação de campo claro. B. Embriões transgênicos mostrando OSX: Expressão mCherry em torno do cleithrum (seta) e paresfenóide (ponta de seta). C. Embriões transgênicos mostrando CTSK: Expressão nlGFP na cabeça (seta) ea cauda (ponta de seta). Barras de escala: 500 mm.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Tratamento com bisfosfonatos de Medaka Larvas <ol><li> Prepare soluções contendo concentrações diferentes de bisfosfonatos (BPS) para os estudos de dose-resposta. NOTA: A BP exemplar utilizado neste protocolo é alendronato. <ol><li> Dissolve-se o alendronato em forma de peixe a uma concentração de 100 ug / mL para preparar uma solução de reserva. </li><li> Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Guardar a solução estoque a 4 ° C. </li><li> Preparar soluções de trabalho diferentes por diluição da solução de estoque com meio peixes a uma série de concentrações (isto é, 25, 37,5, 50, 62,5, e 75 ug / mL). NOTA: Diferentes drogas podem ter diferentes absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) parâmetros, que devem ser considerados durante o teste usando este sistema larvas medaka. Além disso, a solubilidade do fármaco e a estabilidade pode variar quandoaplicado como uma solução aquosa. compostos menos solúveis em água pode ser necessário primeiro ser dissolvido em solventes orgânicos, tais como DMSO. Neste caso, uma solução de reserva é preparada em DMSO, que é, em seguida, diluídas em meio de peixe. Note-se que as soluções de trabalho em água (meio de peixe) podem ser armazenadas no frigorífico durante várias semanas. No entanto, as soluções contendo DMSO deve ser armazenado à temperatura ambiente para evitar a cristalização. </li></ol></li><li> Transferência larvas Medaka em placas de seis poços (seis larvas / poço) para o tratamento subsequente BP (alendronato). </li><li> Remover cuidadosamente a forma de peixe, usando uma pipeta de plástico limpo e adicionar um pequeno volume (aprox. 0,5 mL) de uma solução de alendronato a cada poço. </li><li> Evite médio de peixe de sobra, como a solução BP acrescentou pode ser diluído, o que é especialmente crítico para soluções de alendronato menos concentradas. </li><li> Retirar uma pequena quantidade da solução de alendronato (até 0,5 ml) de cada poço com uma pipeta de plástico limpo e substituí-la com um volu maior-me (4 mL) de uma solução de alendronato. </li><li> Alterar média diária para assegurar o desenvolvimento normal embriões. </li></ol> 4. Coloração ao vivo de matriz mineralizada-bone <ol><li> Dissolve-se 0,5 g de Alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) ou 0,05 g de calceína em 50 mL de meio de peixe para preparar 1% e 0,1% de soluções de reserva, respectivamente. Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. NOTA: médio dos peixes sem a adição de azul de metileno é utilizado neste e nos passos subsequentes para reduzir autofluorescência nas larvas. </li><li> Usar um filtro de seringa e de utilização única (0,2 uM) para filtrar a solução de coloração. Guardar a solução filtrada no escuro à temperatura ambiente. NOTA: A cor da solução de coloração filtrada, claro ALC é amarelo escuro ao laranja. A cor da solução filtrada calceína, é claro amarelo brilhante. As soluções podem ser utilizadas para vários meses. </li><li> Diluir a ALC ou estoque calceína solução filtrada 1:10 em meio peixese incubar as larvas Medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solução de ALC) ou 2 - 2,5 h (solução calceína 0,01%) numa incubadora de 28 ° C se larvas entre 9 e 17 são utilizados DPF. Manter as amostras no escuro. </li><li> Transferir as larvas e médio peixe fresco com uma pipeta de plástico limpo. </li><li> Remover o meio peixe com uma pipeta de plástico limpo e adicionar meio de peixe fresco. Repita este passo para 3 - 4 vezes até que nenhuma solução vermelhos ou amarelo-manchado (ALC ou calceína, respectivamente) é mais de esquerda. Deixar as larvas de peixe no meio durante 30 - 60 minutos antes da sua montagem para evitar a imagiologia de epifluorescência a partir do meio. NOTA: 0,1% de solução de coloração ALC é prejudicial para as larvas medaka para tempos de exposição prolongados. Os tempos de incubação de 2 h mais longo do que afectam a sobrevivência das larvas. A concentração e o tempo de coloração, por conseguinte, precisa de ser optimizada para diferentes fases de modo a atingir óptimos de sobrevivência de embriões de coloração e resultados. </li></ol> 5. Ao vivo Fluorescência de imagem </<html> p&gt; <ol><li> Anestesiar as larvas Medaka com 0,01% tricaina (acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo) em forma de peixe. NOTA: Anestesiados larvas ficam imobilizados após 5 - 10 min em solução tricaina e, geralmente, estão encontrando-se tanto em seus lados ou as costas. </li><li> Usar um microloader plástico para orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral. </li><li> Use uma lupa com iluminação de fluorescência para imagiologia. Use ampliação alta quando tirar fotografias, com foco em diferentes partes do larvas (cabeça, tronco anterior, posterior do tronco e cauda). Costure imagens individuais juntos em regiões de sobreposição usando um software de processamento de imagem adequado (inserções na Figura 3G). NOTA: Isso ajuda a melhorar a qualidade de imagem de todas as partes do corpo relevantes no plano focal correto. </li><li> Retornar as larvas para o meio dos peixes para a recuperação após Imaging. </li></ol>TLE &quot;&gt; 6. Viva Imagem Confocal <ol><li> Anestesiar as larvas com 0,01% tricaina em meio peixe para 5 - 10 min até que eles ficam imobilizados. </li><li> Dissolver baixo ponto de fusão de agarose a 1,5% em meio de peixe por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer esta solução a aproximadamente 30 ° C. </li><li> Adicionar 0,5-1 mL de líquido de 1,5% baixo ponto de fusão de agarose em meio peixe para uma placa de Petri com fundo de vidro. Transferir as larvas anestesiados para dentro da solução, utilizando uma pipeta de plástico limpo. NOTA: Tome precaução especial que a temperatura da agarose de baixo ponto de fusão líquida é suficientemente baixa para não prejudicar as larvas. </li><li> Antes de os solidifica agarose, usar um microloader plástico para empurrar as larvas para o fundo da placa de Petri e orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral. NOTA: As amostras estão prontas para geração de imagens ao vivo confocal após a agarose solidifica completamente. </li><li> Use um microscópio confocal para ACQimagens ùire. </li><li> Use uma linha de laser 543 nm para análises mCherry e ALC coloração. Use uma linha de laser 488 nm para nlGFP e analisa coloração calceína. </li><li> Após a imagiologia, adicionar meio de peixe para a placa de Petri e usar um par de agulhas finas de seringa (27 G x 1½ &quot;), para remover cuidadosamente as larvas da agarose. Transferência das larvas com residualmente ligado agarose para uma placa de Petri com meio de peixe para recuperar . </li><li> Processar as imagens usando uma imagem de software de análise 27. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou financeiras.

Passos críticos dentro do Protocolo É essencial que as condições para o tratamento de choque térmico são consistentes e estável quando se comparam amostras diferentes. Condições de temperatura estáveis garantir níveis semelhantes de indução RANKL nas larvas transgénicos e, consequentemente, a formação de osteoclastos comparável, que pode ser confirmada por rastreio para CTSK: nlGFP expressão. Em última análise, isso leva a um grau semelhante de reabsorção óssea i...

O esqueleto dos vertebrados proporciona um suporte estrutural e a protecção de órgãos, permite a mobilidade, e serve como uma fonte de cálcio. Ao longo da vida, a matriz óssea extracelular é continuamente virado para manter a estabilidade óssea e rigidez. Este processo requer a actividade fortemente coordenada e interacção de osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Os osteoblastos são derivados de células progenitoras mesenquimais multipotentes e produzir colagénio para formar o osteóide, a parte proteica da matriz óssea 10. Os osteoblastos interagir com osteoclastos para alcançar uma actividade equilibrada de ambos os tipos de células, que é necessária para controlar a homeostase óssea 7. Devido a essas interações reguladoras complexas, as respostas ao tratamento medicamentoso e homeostase óssea não pode ser plenamente examinadas usando estudos in vitro. Deste modo, existe uma forte procura de modelos animais. Em comparação com as configurações de cultura de células, em modelos in vivo pode fornecerinsights valiosos sobre as redes multicelulares dentro do ambiente de osso. Numerosos modelos de ratinho para existir uma variedade de perturbações ósseas, incluindo osteoporose humanos 16. No entanto, o tamanho ea acessibilidade de embriões de camundongos representam limitações significativas para geração de imagens ao vivo de processos esqueléticos. Peixes teleósteos pequeno, por outro lado, servir como uma alternativa atraente para imagiologia in vivo. Peixe-zebra (Danio rerio) e medaka (Oryzias latipes) tornaram-se modelos animais populares para pesquisa esquelética durante as últimas duas décadas 17, 19, 22, 24. Osso em peixes teleósteos e em mamíferos é muito semelhante, tanto em um estrutural como a nível fisiológico, e muitos dos genes reguladores-chave e as vias de sinalização são conservados 3. Como em mamíferos, peixes teleósteos regular cuidadosamente a actividade dos osteoblastos e osteoclastos para equilibrar a formação óssea e reabsorção 26. Mais importante ainda, a clareza óptica de fiSH larvas permite o uso de repórteres fluorescentes para marcar células ósseas e a matriz calcificada esquelético 8, 9, 12, 21, 23, o que facilita a observação de processos celulares em animais vivos. Além disso, uma série de ferramentas genéticas foi gerado para facilitar a pesquisa biomedicamente relevante em peixes. Para medaka em particular, métodos para mutação do gene alvo de CRISPR / Cas9 2, rastreamento de 6 células de linhagem, e site-specific transgênese 14 foram recentemente estabelecidas e são agora amplamente em uso 15. Larvas teleósteos pequena têm sido usadas com sucesso para as telas de químicos, o que levou à descoberta de várias drogas farmacologicamente relevantes 1, 18. Larvas de peixes são tolerantes a baixas concentrações de DMSO e são capazes de absorver compostos de seu ambiente aquático, através da pele ou através do tracto gastrointestinal de 1, 5. Nosso laboratório anteriormente reported medaka linhas transgénicas que expressam repórteres fluorescentes em células ósseas, sob o controlo de vários osteoblast- e promotores específicos de osteoclastos. Estes incluem osteoblastos prematuros (colágeno 10A1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclastos (catepsina K, CTSK) 24. Nós também gerou uma linha transgénica que expressa o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível por choque térmico-24. Indução de RANKL neste sistema resulta na formação ectópica de osteoclastos activos. Isto leva a um aumento da reabsorção óssea e um fenótipo semelhante a osteoporose grave, com mineralização drasticamente reduzida nos corpos vertebrais. Recentemente, mostrou que a actividade dos osteoclastos neste modelo pode ser bloqueada pelo etidronato bisfosfonatos e alendronato, TWO drogas comumente usadas no tratamento da osteoporose humana, validando assim medaka como um sistema modelo adequado para a osteoporose 27. Devido ao seu grande tamanho de ninhada, o rápido desenvolvimento, e pequeno tamanho de embriões, larvas Medaka transgénicos são exclusivamente adequados para o rastreio em larga escala de drogas da osteoporose e para a análise in vivo de comportamento de células ósseas. Estudos em medaka, portanto, pode eficientemente complementar experiências em culturas de células e em camundongos que visam a descoberta de novos alvos terapêuticos e novas terapias para doenças ósseas humanas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para tratar larvas osso repórter medaka com a droga osteoporose comum, o alendronato. Nós também descrevem em detalhes como larvas tratadas estão montados e preparados para a imagens ao vivo da matriz óssea e células ósseas. Estes protocolos podem ser facilmente adaptada a outros compostos químicos pequenos, que tanto trabalho como anabolizante do tecido ósseo ou drogas anti-reabsorção. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Osso formando osteoblastos interagir com osteoclastos de reabsorção óssea para coordenar o volume de negócios da matriz óssea e para controlar a homeostase esquelética. Medaka e larvas de peixe-zebra são amplamente usadas para analisar o comportamento de células de osso durante a formação óssea, a degeneração, e reparação. A sua clareza óptica permite a visualização das células ósseas marcado fluorescentemente e corantes fluorescentes ligados à matriz óssea mineralizada. O nosso laboratório tem gerado Medaka peixes transgénicos que expressam o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível de choque de calor. A expressão ectópica de RANKL resulta na formação de excesso de osteoclastos activados, que podem ser visualizados em linhas com expressão repórter nlGFP sob o controlo do promotor K (CTSK) catepsina. indução RANKL e formação de osteoclastos ectópica leva a fenótipos osteoporose-like graves. Composto li medaka transgênicones que expressam CTSK: nlGFP em osteoclastos, assim como mCherry sob o controlo do osterix (OSX) promotor em osteoblastos prematuros, pode ser utilizado para estudar a interacção de ambos os tipos de células. Isto facilita a observação in vivo do comportamento celular sob condições de degeneração óssea e de reparação. Aqui, nós descrevemos a utilização deste sistema para testar um fármaco utilizada em terapia de osteoporose humana e descrever um protocolo de imagens ao vivo. O modelo Medaka complementa os estudos em cultura de células e ratinhos, e oferece um novo sistema para a análise in vivo da acção do fármaco no sistema esquelético.

Abundante número de ovos, bem como o pequeno tamanho das larvas, fazer Medaka um excelente modelo para o rastreio de drogas. Uma placa de seis poços único foi utilizada para a cultura até 36 larvas, o que foi suficiente para proporcionar dados estatisticamente significativos. Outra grande vantagem do uso de peixes para análise esquelético é a possibilidade de fazer imagens ao vivo. A transparência das larvas de peixes permite a utilização de proteínas fluorescentes para marcar as células ósseas, bem como a ...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.1K visualizações.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Biologia do Desenvolvimento

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tratamento de drogas e

Resumo

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