Este projecto foi financiado por doações do Ministério Singapore da Educação (MOE, número de concessão 2013-T2-2-126) e do Instituto Nacional de Saúde, EUA (NIH, conceda número 1R21AT008452-01A1). TY recebeu uma bolsa de pós-graduação do Departamento de Ciências Biológicas NUS. Agradecemos a unidade confocal do Centro de Ciências NUS bioimaging (CBIS) pelo seu apoio constante.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura (R14-293). 1. Os peixes Pecuária e à colheita de embriões <ol><li> Levante WT, CTSK: nlGFP 24, RANKL: HSE: PCP 24, e OSX: mCherry 21 simples ou peixe medaka composto transgénico a 26 ° C sob um ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h escuro) para induzir a desova. </li><li> desova diária ocorre durante os primeiros 30 minutos após a luz é ligado. Os ovos ficar juntos através de filamentos e anexar ao abdômen da fêmea por várias horas. Use uma rede de malha fina para pegar uma fêmea adulta que transporta um conjunto de ovo. Deixe o peixe descansar brevemente na rede e, em seguida, massageie suavemente o abdômen do peixe para retirar cuidadosamente o cluster óvulo fertilizado do abdome da fêmea. NOTA: Uma fêmea medaka saudávelpode produzir 10 - 20 ovos por dia durante cerca de 5 meses. </li><li> Coloque os ovos em uma 60 mm plástico placa de Petri. Usar uma pipeta de plástico para lavar os embriões com 5-10 ml de de 0,3x Danieau forma de solução (peixe; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, MgSO4 0,13 mM, Ca 0,2 mM (NO 3) 2, e 1,7 mM de HEPES, pH 7.0). Adicionar 1 ml de uma 0,25% (w / v) de solução azul de metileno estoque para 2,5 L de meio de peixes para prevenir o crescimento de fungos. </li><li> Rode ligeiramente aglomerado de ovo para formar um nó de filamentos de fixação. Use uma pinça para remover cuidadosamente os filamentos de fixação dos aglomerados de ovos fertilizados para obter embriões individuais (Figura 1A). </li><li> Estágio os embriões de acordo com Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embriões por 60 milímetros de plástico em placas de Petri de 28 ° C incubadora. Alterar a média diária para assegurar o desenvolvimento normal dos embriões. NOTA: O tempo em volta do palco para incubação (8-9 d pós-fertilização,DPF) é especialmente crítica para a sobrevivência. Remover córions de livre flutuação para manter o meio limpo e para garantir boas taxas de sobrevivência das larvas. </li></ol> 2. Rastreio Embryo Transgenic <ol><li> Use um estereomicroscópio equipado com uma lâmpada de mercúrio para imagens de fluorescência e GFP, RFP, e os filtros da PCP para a tela embriões transgênicos para a expressão repórter fluorescente utilizando 40X. </li><li> Identificar visualmente OSX: embriões mCherry por expressão repórter mCherry no início de formação de ossos cranianos, tais como o cleitro, em ambos os lados da cabeça posterior (Figura 1B, seta), e o parasphenoide, numa posição central no crânio ventral ( Figura 1B, cabeça de seta). NOTA: expressão Reporter começa a partir de 5 DPF em diante 21. </li><li> Identificar CTSK: embriões nlGFP por expressão nlGFP forte na cabeça (Figura 1C, seta) e uma cauda (Figura 1C, seta), a partir de6 DPF. NOTA: osteoclastos endógenos formam apenas depois de 21 DPF. células neste estágio inicial (6 DPF) nlGFP expressando não são osteoclastos, mas outra, até agora não caracterizada, CTSK células -positivas 24. </li><li> Identificar RANKL: HSE: PCP embriões transgénicos por expressão ubíqua PCP depois de um tratamento a curto choque térmico durante 20 min a 39 ° C, conduzida em duas DPF ou posterior para fins de rastreio. NOTA: A RANKL e PCP transgenes estão sob o controle do mesmo bidirecional Choque elemento térmico (HSE). Expressão PCP indica indução bem-sucedida RANKL 24. </li><li> Executar uma 1,5-2 h tratamento de choque térmico a 9 DPF ou mais tarde, para induzir um grande número de osteoclastos ectópica na região do tronco, o que consequentemente resulta em um fenótipo osteoporose-like 24. NOTA: expressão RANKL Transgenic induzida em 9 resultados da DPF em uma ativação ectópica de células progenitoras osteoclastos dormentes, que endogenamente não é acionadoantes de 21 de DPF. Usar um banho de água para se obter condições estáveis ​​a 39 ° C. Deixe as placas de Petri contendo embriões medaka flutuar na superfície da água. Certifique-se a tampa da placa de petri é seco, para impedir o afundamento do prato. </li><li> Embriões de tela de linhas compostas, tais como RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP double-transgênica e OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP triple-transgênica, de acordo com o padrão de cada transgene indivíduo expressão. NOTA: embriões transgênicos hemizygous e homozigotos foram distinguidos por diferentes níveis de fluorescência do transgene repórter. embriões homozigóticos tinham uma intensidade de fluorescência que aproximadamente duplicou em comparação com a de transgênicos hemizigóticas. Linhas de compostos que eram homozigotos para ambos RANKL: HSE: PCP e CTSK: nlGFP foram obtidos por incrossing repetido ao longo de várias gerações. Para triple-transgênica OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP,<html> RANKL homozigoto: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP foram cruzados com OSX homozigoto: portadores mCherry. A progênie triple-transgênico heterozigoto resultante foram levantadas e incrossed obter embriões homozigotos para RANKL: HSE: PCP. O RANKL: HSE: PCP transgene deve ser homozigótica, a fim de obter a indução eficiente de osteoclastos ectópicas. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT e Transgenic Medaka embriões em 7 D pós-fertilização (DPF). Uma. embriões WT observado com iluminação de campo claro. B. Embriões transgênicos mostrando OSX: Expressão mCherry em torno do cleithrum (seta) e paresfenóide (ponta de seta). C. Embriões transgênicos mostrando CTSK: Expressão nlGFP na cabeça (seta) ea cauda (ponta de seta). Barras de escala: 500 mm.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Tratamento com bisfosfonatos de Medaka Larvas <ol><li> Prepare soluções contendo concentrações diferentes de bisfosfonatos (BPS) para os estudos de dose-resposta. NOTA: A BP exemplar utilizado neste protocolo é alendronato. <ol><li> Dissolve-se o alendronato em forma de peixe a uma concentração de 100 ug / mL para preparar uma solução de reserva. </li><li> Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Guardar a solução estoque a 4 ° C. </li><li> Preparar soluções de trabalho diferentes por diluição da solução de estoque com meio peixes a uma série de concentrações (isto é, 25, 37,5, 50, 62,5, e 75 ug / mL). NOTA: Diferentes drogas podem ter diferentes absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) parâmetros, que devem ser considerados durante o teste usando este sistema larvas medaka. Além disso, a solubilidade do fármaco e a estabilidade pode variar quandoaplicado como uma solução aquosa. compostos menos solúveis em água pode ser necessário primeiro ser dissolvido em solventes orgânicos, tais como DMSO. Neste caso, uma solução de reserva é preparada em DMSO, que é, em seguida, diluídas em meio de peixe. Note-se que as soluções de trabalho em água (meio de peixe) podem ser armazenadas no frigorífico durante várias semanas. No entanto, as soluções contendo DMSO deve ser armazenado à temperatura ambiente para evitar a cristalização. </li></ol></li><li> Transferência larvas Medaka em placas de seis poços (seis larvas / poço) para o tratamento subsequente BP (alendronato). </li><li> Remover cuidadosamente a forma de peixe, usando uma pipeta de plástico limpo e adicionar um pequeno volume (aprox. 0,5 mL) de uma solução de alendronato a cada poço. </li><li> Evite médio de peixe de sobra, como a solução BP acrescentou pode ser diluído, o que é especialmente crítico para soluções de alendronato menos concentradas. </li><li> Retirar uma pequena quantidade da solução de alendronato (até 0,5 ml) de cada poço com uma pipeta de plástico limpo e substituí-la com um volu maior-me (4 mL) de uma solução de alendronato. </li><li> Alterar média diária para assegurar o desenvolvimento normal embriões. </li></ol> 4. Coloração ao vivo de matriz mineralizada-bone <ol><li> Dissolve-se 0,5 g de Alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) ou 0,05 g de calceína em 50 mL de meio de peixe para preparar 1% e 0,1% de soluções de reserva, respectivamente. Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. NOTA: médio dos peixes sem a adição de azul de metileno é utilizado neste e nos passos subsequentes para reduzir autofluorescência nas larvas. </li><li> Usar um filtro de seringa e de utilização única (0,2 uM) para filtrar a solução de coloração. Guardar a solução filtrada no escuro à temperatura ambiente. NOTA: A cor da solução de coloração filtrada, claro ALC é amarelo escuro ao laranja. A cor da solução filtrada calceína, é claro amarelo brilhante. As soluções podem ser utilizadas para vários meses. </li><li> Diluir a ALC ou estoque calceína solução filtrada 1:10 em meio peixese incubar as larvas Medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solução de ALC) ou 2 - 2,5 h (solução calceína 0,01%) numa incubadora de 28 ° C se larvas entre 9 e 17 são utilizados DPF. Manter as amostras no escuro. </li><li> Transferir as larvas e médio peixe fresco com uma pipeta de plástico limpo. </li><li> Remover o meio peixe com uma pipeta de plástico limpo e adicionar meio de peixe fresco. Repita este passo para 3 - 4 vezes até que nenhuma solução vermelhos ou amarelo-manchado (ALC ou calceína, respectivamente) é mais de esquerda. Deixar as larvas de peixe no meio durante 30 - 60 minutos antes da sua montagem para evitar a imagiologia de epifluorescência a partir do meio. NOTA: 0,1% de solução de coloração ALC é prejudicial para as larvas medaka para tempos de exposição prolongados. Os tempos de incubação de 2 h mais longo do que afectam a sobrevivência das larvas. A concentração e o tempo de coloração, por conseguinte, precisa de ser optimizada para diferentes fases de modo a atingir óptimos de sobrevivência de embriões de coloração e resultados. </li></ol> 5. Ao vivo Fluorescência de imagem </<html> p&gt; <ol><li> Anestesiar as larvas Medaka com 0,01% tricaina (acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo) em forma de peixe. NOTA: Anestesiados larvas ficam imobilizados após 5 - 10 min em solução tricaina e, geralmente, estão encontrando-se tanto em seus lados ou as costas. </li><li> Usar um microloader plástico para orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral. </li><li> Use uma lupa com iluminação de fluorescência para imagiologia. Use ampliação alta quando tirar fotografias, com foco em diferentes partes do larvas (cabeça, tronco anterior, posterior do tronco e cauda). Costure imagens individuais juntos em regiões de sobreposição usando um software de processamento de imagem adequado (inserções na Figura 3G). NOTA: Isso ajuda a melhorar a qualidade de imagem de todas as partes do corpo relevantes no plano focal correto. </li><li> Retornar as larvas para o meio dos peixes para a recuperação após Imaging. </li></ol>TLE &quot;&gt; 6. Viva Imagem Confocal <ol><li> Anestesiar as larvas com 0,01% tricaina em meio peixe para 5 - 10 min até que eles ficam imobilizados. </li><li> Dissolver baixo ponto de fusão de agarose a 1,5% em meio de peixe por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer esta solução a aproximadamente 30 ° C. </li><li> Adicionar 0,5-1 mL de líquido de 1,5% baixo ponto de fusão de agarose em meio peixe para uma placa de Petri com fundo de vidro. Transferir as larvas anestesiados para dentro da solução, utilizando uma pipeta de plástico limpo. NOTA: Tome precaução especial que a temperatura da agarose de baixo ponto de fusão líquida é suficientemente baixa para não prejudicar as larvas. </li><li> Antes de os solidifica agarose, usar um microloader plástico para empurrar as larvas para o fundo da placa de Petri e orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral. NOTA: As amostras estão prontas para geração de imagens ao vivo confocal após a agarose solidifica completamente. </li><li> Use um microscópio confocal para ACQimagens ùire. </li><li> Use uma linha de laser 543 nm para análises mCherry e ALC coloração. Use uma linha de laser 488 nm para nlGFP e analisa coloração calceína. </li><li> Após a imagiologia, adicionar meio de peixe para a placa de Petri e usar um par de agulhas finas de seringa (27 G x 1½ &quot;), para remover cuidadosamente as larvas da agarose. Transferência das larvas com residualmente ligado agarose para uma placa de Petri com meio de peixe para recuperar . </li><li> Processar as imagens usando uma imagem de software de análise 27. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou financeiras.

Passos críticos dentro do Protocolo É essencial que as condições para o tratamento de choque térmico são consistentes e estável quando se comparam amostras diferentes. Condições de temperatura estáveis garantir níveis semelhantes de indução RANKL nas larvas transgénicos e, consequentemente, a formação de osteoclastos comparável, que pode ser confirmada por rastreio para CTSK: nlGFP expressão. Em última análise, isso leva a um grau semelhante de reabsorção óssea i...

O esqueleto dos vertebrados proporciona um suporte estrutural e a protecção de órgãos, permite a mobilidade, e serve como uma fonte de cálcio. Ao longo da vida, a matriz óssea extracelular é continuamente virado para manter a estabilidade óssea e rigidez. Este processo requer a actividade fortemente coordenada e interacção de osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Os osteoblastos são derivados de células progenitoras mesenquimais multipotentes e produzir colagénio para formar o osteóide, a parte proteica da matriz óssea 10. Os osteoblastos interagir com osteoclastos para alcançar uma actividade equilibrada de ambos os tipos de células, que é necessária para controlar a homeostase óssea 7. Devido a essas interações reguladoras complexas, as respostas ao tratamento medicamentoso e homeostase óssea não pode ser plenamente examinadas usando estudos in vitro. Deste modo, existe uma forte procura de modelos animais. Em comparação com as configurações de cultura de células, em modelos in vivo pode fornecerinsights valiosos sobre as redes multicelulares dentro do ambiente de osso. Numerosos modelos de ratinho para existir uma variedade de perturbações ósseas, incluindo osteoporose humanos 16. No entanto, o tamanho ea acessibilidade de embriões de camundongos representam limitações significativas para geração de imagens ao vivo de processos esqueléticos. Peixes teleósteos pequeno, por outro lado, servir como uma alternativa atraente para imagiologia in vivo. Peixe-zebra (Danio rerio) e medaka (Oryzias latipes) tornaram-se modelos animais populares para pesquisa esquelética durante as últimas duas décadas 17, 19, 22, 24. Osso em peixes teleósteos e em mamíferos é muito semelhante, tanto em um estrutural como a nível fisiológico, e muitos dos genes reguladores-chave e as vias de sinalização são conservados 3. Como em mamíferos, peixes teleósteos regular cuidadosamente a actividade dos osteoblastos e osteoclastos para equilibrar a formação óssea e reabsorção 26. Mais importante ainda, a clareza óptica de fiSH larvas permite o uso de repórteres fluorescentes para marcar células ósseas e a matriz calcificada esquelético 8, 9, 12, 21, 23, o que facilita a observação de processos celulares em animais vivos. Além disso, uma série de ferramentas genéticas foi gerado para facilitar a pesquisa biomedicamente relevante em peixes. Para medaka em particular, métodos para mutação do gene alvo de CRISPR / Cas9 2, rastreamento de 6 células de linhagem, e site-specific transgênese 14 foram recentemente estabelecidas e são agora amplamente em uso 15. Larvas teleósteos pequena têm sido usadas com sucesso para as telas de químicos, o que levou à descoberta de várias drogas farmacologicamente relevantes 1, 18. Larvas de peixes são tolerantes a baixas concentrações de DMSO e são capazes de absorver compostos de seu ambiente aquático, através da pele ou através do tracto gastrointestinal de 1, 5. Nosso laboratório anteriormente reported medaka linhas transgénicas que expressam repórteres fluorescentes em células ósseas, sob o controlo de vários osteoblast- e promotores específicos de osteoclastos. Estes incluem osteoblastos prematuros (colágeno 10A1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclastos (catepsina K, CTSK) 24. Nós também gerou uma linha transgénica que expressa o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível por choque térmico-24. Indução de RANKL neste sistema resulta na formação ectópica de osteoclastos activos. Isto leva a um aumento da reabsorção óssea e um fenótipo semelhante a osteoporose grave, com mineralização drasticamente reduzida nos corpos vertebrais. Recentemente, mostrou que a actividade dos osteoclastos neste modelo pode ser bloqueada pelo etidronato bisfosfonatos e alendronato, TWO drogas comumente usadas no tratamento da osteoporose humana, validando assim medaka como um sistema modelo adequado para a osteoporose 27. Devido ao seu grande tamanho de ninhada, o rápido desenvolvimento, e pequeno tamanho de embriões, larvas Medaka transgénicos são exclusivamente adequados para o rastreio em larga escala de drogas da osteoporose e para a análise in vivo de comportamento de células ósseas. Estudos em medaka, portanto, pode eficientemente complementar experiências em culturas de células e em camundongos que visam a descoberta de novos alvos terapêuticos e novas terapias para doenças ósseas humanas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para tratar larvas osso repórter medaka com a droga osteoporose comum, o alendronato. Nós também descrevem em detalhes como larvas tratadas estão montados e preparados para a imagens ao vivo da matriz óssea e células ósseas. Estes protocolos podem ser facilmente adaptada a outros compostos químicos pequenos, que tanto trabalho como anabolizante do tecido ósseo ou drogas anti-reabsorção. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Osso formando osteoblastos interagir com osteoclastos de reabsorção óssea para coordenar o volume de negócios da matriz óssea e para controlar a homeostase esquelética. Medaka e larvas de peixe-zebra são amplamente usadas para analisar o comportamento de células de osso durante a formação óssea, a degeneração, e reparação. A sua clareza óptica permite a visualização das células ósseas marcado fluorescentemente e corantes fluorescentes ligados à matriz óssea mineralizada. O nosso laboratório tem gerado Medaka peixes transgénicos que expressam o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível de choque de calor. A expressão ectópica de RANKL resulta na formação de excesso de osteoclastos activados, que podem ser visualizados em linhas com expressão repórter nlGFP sob o controlo do promotor K (CTSK) catepsina. indução RANKL e formação de osteoclastos ectópica leva a fenótipos osteoporose-like graves. Composto li medaka transgênicones que expressam CTSK: nlGFP em osteoclastos, assim como mCherry sob o controlo do osterix (OSX) promotor em osteoblastos prematuros, pode ser utilizado para estudar a interacção de ambos os tipos de células. Isto facilita a observação in vivo do comportamento celular sob condições de degeneração óssea e de reparação. Aqui, nós descrevemos a utilização deste sistema para testar um fármaco utilizada em terapia de osteoporose humana e descrever um protocolo de imagens ao vivo. O modelo Medaka complementa os estudos em cultura de células e ratinhos, e oferece um novo sistema para a análise in vivo da acção do fármaco no sistema esquelético.

Abundante número de ovos, bem como o pequeno tamanho das larvas, fazer Medaka um excelente modelo para o rastreio de drogas. Uma placa de seis poços único foi utilizada para a cultura até 36 larvas, o que foi suficiente para proporcionar dados estatisticamente significativos. Outra grande vantagem do uso de peixes para análise esquelético é a possibilidade de fazer imagens ao vivo. A transparência das larvas de peixes permite a utilização de proteínas fluorescentes para marcar as células ósseas, bem como a ...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K visualizações.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Pesquisa do câncer

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Biologia do Desenvolvimento

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicina

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Bioengenharia

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica Gene Transferência e<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomated Longitudinal baseados em Microcomputed tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural de um modelo de fratura Vertebral relacionadas com osteoporose rato Nude

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Método de ablação a laser para estudar a regeneração óssea em larvas de peixe-zebra

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Regeneração óssea imunomediada - o papel crítico dos macrófagos e imunomodulação controlada em processos restauradores

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

Tratamento de drogas e

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Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Seqüente

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

A Novel

Semiautomated Longitudinal baseados em Microcomputed tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural de um modelo de fratura Vertebral relacionadas com osteoporose rato Nude

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento