The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).

O protocolo segue as diretrizes do cuidado com os animais institucional e uso comissão (IACUC) da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel, uma instalação AAALAC aprovado (Request MD-12-13524-4 No.), e pelos Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). Os animais foram tratados de adesão estrita às diretrizes do NIH. 1. Preparação de aloenxertos de osso <ol><li> Eutanásia de 7 a 8 semanas de idade, os ratinhos Balb / C, ou qualquer outra estirpe do receptor, utilizando o método padrão de CO 2 inalação ou injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirmar a ausência de um piscar de olhos e executar deslocamento cervical. Como alternativa, colher os enxertos de cadáveres que foram mantidos em temperatura de -20 ° C e descongeladas antes da colheita. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-o contra a direção do crescimento do cabelo. Desinfectar a cabeça da carcaça através da aplicação de 70% isopropanoeu. Corte a pele do couro cabeludo utilizando um bisturi nº 11 e remover o periósteo. </li><li> Usando uma broca de dentista e uma trefina de diâmetro interno de 4,5 mm, retirar um fragmento circular do osso calvarial. Transferir o fragmento de osso a um prato de plástico de 100 mm contendo solução salina estéril. Neste ponto, observar sangue e do tecido macio ligado ao fragmento de osso (Figura 1A). Obter fragmentos de ossos deste modo a partir 22 dadores. </li><li> Segure fragmento de um osso de cada vez, usando uma pinça curvas. Swab-lo cuidadosamente, com algodão aplicador derrubado e remover qualquer tecido cerebral, tecidos moles, e de sangue (Figura 1B). Suavemente cortar as lascas de osso que permanecem ligados ao enxerto utilizando uma tesoura fina de modo que o enxerto vai ter uma forma arredondada perfeito. </li><li> Mergulhar uma vez cada enxerto em um tubo de 15 ml contendo 70% de etanol e duas vezes em tubos de 15 ml contendo solução salina tamponada com fosfato para lavar o etanol. </li><li> Congelar os aloenxertos num -80 ° C em tubos criogénicos frigorífico durante pelomenos 1 semana. Neste ponto, certifique-se os enxertos parecem transparentes (Figura 1C). </li></ol> Cirurgia 2. calvarial Defeito <ol><li> Para usar receptores ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina 6. </li><li> Esterilizar as pontas dos instrumentos cirúrgicos usando um aquecedor de esferas de vidro durante 30 segundos. Transferir as ferramentas para um frasco contendo 70% de isopropanol para manter as condições estéreis. Use luvas estéreis. </li><li> Anestesiar uma de 7 a 8 semanas de idade, fêmea de ratinho por injecção intraperitoneal de uma mistura ketamine- medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente). Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-a contra a direção do crescimento do cabelo. Aplique o creme de depilação para remover quaisquer vestígios de pele e limpe-after não mais do que 2 minutos utilizando uma gaze seca seguido por solução salina gaze embebida. Cuidados devem ser tomados para evitar que ele nos olhos. Alternativamente, a pomada veterinário olho pode ser aplicado antes da remoção do cabelo como uma camada extra de proteção para os olhos. É imperativo que todos os vestígios do creme depilatório ser removida, a fim de evitar uma possível irritação da exposição excessiva ao agente químico. Desinfectar o couro cabeludo pela aplicação de 5% de clorexidina (Figura 1D). </li><li> Injectar por via subcutânea de 5 mg / kg carprofeno diluída em 200 ul de solução salina. Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e manter o animal sobre uma almofada térmica em todos os momentos. Posicione o animal sob os binóculos que operam. </li><li> Faça um corte oval de 1 cm de comprimento na pele do couro cabeludo usando tesoura fina e pinças (Figura 1E). Segure o periósteo, usando uma pinça curvas e cortar com uma tesoura fina. </li><li> Perfurar o calvarial defeito 2 milímetros anterior à sutura lambdoid usando uma broca dental umnd um trephine exterior diâmetro de 5 mm (Figura 1F e G). Para evitar a penetração da dura-máter, perfurar três quartos do caminho para o osso e retire o fragmento ósseo usando uma espátula. </li><li> Para implantar um auto-enxerto, recuperar o fragmento ósseo e lavá-lo em uma placa de plástico 10 milímetros contendo 10 ml de solução salina estéril para remover detritos. Não remova os tecidos moles. Para implantar um aloenxerto, descongelar previamente um aloenxerto e normalizar para a TA, e, em seguida, lavá-lo. </li><li> Coloque o enxerto ósseo no defeito, usando uma pinça curvas para que ele não toque nas margens do defeito (Figura 1H). Cole o enxerto ao osso hospedeiro, utilizando gel de fibrina (5 ul de 46 mg / ml de fibrinogénio misturados com 5 ul de 25 U / ml de trombina). </li><li> Suturar a pele usando 4-0 vicryl sutura (Figura 1I). Aplicar iodopovidona para o corte cirúrgico. Cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação da sutura por pele. Marque a orelha de rato e injetar 0,25 mg / kg Antisedan to reverter o efeito anestésico da medetomidina. </li><li> Se o animal não acordar de 10 min, verifique se ele está situado em uma almofada aquecida. Injectar 200 ul de soro fisiológico estéril, e, se necessário Injectar 0,1 mg / kg Antisedan. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado. </li><li> Manter os animais em gaiolas separadas por uma semana, para evitar que as suturas de abertura. Coloque comida do mouse embebido em água em uma placa de Petri no chão da gaiola por alguns dias de pós-operatório. Injectar por via subcutânea de 200 ul / ml de solução de 1 mg carprofeno diluída em solução salina estéril, uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para tratar a dor pós-cirúrgica. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de calvária aloenxerto e calvárias Defeito cirurgia. O fragmento de osso é isolado a partir da região de calvária (A). Tecido macio, Medula óssea, e sangue são esfregadas (B), e o enxerto é lavado em etanol a 70%, seguido de duas lavagens em salina tamponizada com fosfato (C, AG = aloenxerto). O mouse destinatário está preparado para a cirurgia pelo barbear e desinfecção da pele na região calvarial (D). Um corte de forma oval é criada na pele do couro cabeludo, e do periósteo é removido (E). Em seguida, o defeito de calvária é perfurado utilizando um trépano de 5 mm de diâmetro (F). O fragmento de osso é separada usando uma espátula em forma de colher, deixando o seio sagital superior intacta (L). O aloenxerto é então colocado no defeito e protegidas utilizando gel de fibrina (H). Finalmente, a pele é suturada (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Micro-Tomografia Computadorizada para Caracterização deÁrvore Vascular <ol><li> Preparar solução salina heparinizada. Peso 2.000 U de heparina sódica e coloque-o no tubo de 50ml de plástico. Adicionar 20 ml de solução salina e agite bem o tubo. Encha a 20 ml seringa Luer lock com 15 ml aquecido salina heparinizada e conecte a seringa a um conjunto veia do couro cabeludo 23-G. Apor a seringa a uma bomba de seringa, e configurá-lo para bombear 10 ml a 1 ml / min. </li><li> Sedar um rato utilizando uma injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Comprima o membro do animal para se certificar de que está profundamente sedado. Prenda o mouse sobre a sua volta para uma placa de fixação envolvido com um revestimento de superfície absorvente (Figura 2A). Posicione o mouse fixado em um exaustor para evitar a exposição pessoal a fumaça. </li><li> Cortar a pele do abdômen ao pescoço com uma tesoura fina e pinças (Figura 2B). Corte a parede abdominal até o apêndice xifóide (Figura 2C). Corte as costelas ao longo da sua face lateral. Evitar ferir os pulmões umcoração d, e certifique-se o coração está totalmente exposta. Utilize uma pinça hemostática para retrair o esterno (Figura 2D). </li><li> Insira a agulha borboleta 3 mm para o ventrículo esquerdo (Figura 2E). Cole a agulha para o coração e da parede torácica, a utilização de cola 3-sec (Figura 2F). </li><li> Ative a bomba imediatamente. Depois de um minuto, dissecar a veia cava inferior, a fim de aliviar a pressão do sistema vascular (Figura 2G). Incline a placa para que os líquidos fluam longe da cabeça. Perfusão bem sucedida irá resultar na limpeza dos vasos do fígado e do sangue. </li><li> Quando a solução salina heparinizada de perfusão é completada, perfundir 10 ml de formaldeído a 4%. Evitar a penetração de bolhas de ar na vasculatura e evitar a exposição aos vapores de formaldeído. Perfusão formaldeído bem sucedido irá resultar no endurecimento da cauda. Lave o formaldeído com 10 ml heparinizados salina. </li><li> Prepara-se o agente de contraste rádio-opaco de acordo com Manufactinstruções Urer. Tipicamente, isso irá exigir mistura do composto, diluente, e um agente de cura. Use pipetas serológicas e misturar a solução em um tubo de plástico de 15 ml. </li><li> Perfundir o animal com a mistura de agente de contraste a uma taxa de 1 mL / min. Observe os vasos sanguíneos coronárias, hepáticas e intestinais e verifique se eles estão transformando amarelo depois de perfusão de 2 - 3 ml, indicando perfusão sucesso (Figura 2H). Após a conclusão da perfusão, cortar a tubulação da agulha borboleta, obter a carcaça sozinho e envolvê-lo com papel higiênico para evitar o vazamento da solução para a região calvarial. Permitir que a polimerização em 4 ° CO / N. </li><li> Dissecar a região calvarial (Figura 2I); Primeiro usar um bisturi para cortar a pele como lateral, como possível, evitar danificar a região craniana de interesse. Localizar o enxerto de osso e, em seguida, utilizar tesouras finas para cortar o osso craniano 10 mm de distância a partir do enxerto. </li><li> Digitalizar o vitelo isoladoamostra de osso arial usando um scanner μCT; campo de visão definido para 20,5 milímetros, a energia de raios-X de 55 kVp, Intensidade de 145 mA, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms. Ajustar os parâmetros μCT 7 para a imagem outros modelos defeito ósseo. </li><li> Observe as fatias 2D reconstruídos que foram geradas pelo software μCT. Certifique-se de fazer a varredura da região de interesse é adequada e, em seguida, localizar o defeito calvarial. Avaliar a qualidade da perfusão. Após a identificação bem sucedida dos vasos sanguíneos (Figura 2J), continuar e descalcificação o exemplo usando 6% de ácido tricloroacético (TCA) diluído em água bidestilada (DDW). </li><li> Redigitalize a amostra usando os parâmetros indicados na Seção 3.10. Localize a sutura lambdóide nos cortes 2D reconstruídos. Definir um volume cilíndrico de interesse (VOI) de altura de 2 mm e 8 mm de diâmetro, que é tangente à sutura - este é o local anatômico de defeito. </li><li> Th Segmentotecido ósseo e dos tecidos moles utilizando um procedimento de limiar global; definir o limiar inferior a 130, e aplicar um filtro gaussiano 3D constrangidos (Sigma [σ] = 2,0 e apoio = 2) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Gerar uma reconstrução 3D e certifique-se a VOI está posicionada corretamente (Figura 2K). </li><li> Gerar um mapa de espessura utilizando o software IPL e da função &quot;dt_object_param&quot; (Figura 2L). NOTA: Esta função descreve o volume do reservatório para cada diâmetro do vaso. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig2.jpg" /> Figura 2. perfusão com um agente radiopaco através da abordagem cardíaca. O rato é afixada à placa de fixação (A), e a pele é cortada ao longo do abdómen até ao pescoço (B). A parede abdominal é cortada ao longo da linha medial até à procedi xifóideSS (C), e a caixa torácica é cortada lateralmente (D). Uma agulha de borboleta é inserido no ventrículo esquerdo, evitando a inserção no ventrículo direito, que é nitidamente mais escuro (E, o ventrículo direito é indicado pela linha tracejada branco), e a agulha é fixada à parede do coração e do peito (F) . Solução salina heparinizada (2-3 ml) é bombeado para o coração e a veia cava inferior é dissecado (L, seta branca indica a veia cava inferior). Formaldeído (4%) é perfundido e lavado para fora; isto é seguido por uma perfusão do agente de contraste amarelo-tingido rádio-opaco. Perfusão sucesso será evidente pela depuração dos vasos sanguíneos, que mudam de cor para amarelo (H). Após a polimerização, a região de calvária é isolado (I, AG = aloenxerto) e visualizados utilizando um scanner μCT para confirmar perfusão adequada (J, o volume de interesse é marcado com laranja). oamostra é descalcificados e examinados novamente (K), seguido pela geração de um mapa de espessura colorida (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. imagens de fluorescência de mineralização óssea e sangue Perfusão <ol><li> Reconstituir sondas a uma concentração de 2 nmol / 100 ul de PBS num tubo de 1,5 ml (usar uma sonda fluorescente conjugada bisfosfonato para monitorar a mineralização óssea e um agente fluorescente à base de sangue para medir a perfusão de sangue). Pipeta suavemente várias vezes para garantir dissolução homogénea da sonda. </li><li> 24 horas antes da sessão de imagem designado tomar imagem tempo de zero a; anestesiar 3 ratos utilizando 2 L / min a inalação de oxigênio a 100% de grau médico suplementado com 3% de isoflurano em uma câmara de indução. Depois de anestesia adequada tiver sido estabelecida, diminuir a concentração de isoflurano a 1,5% - 2%. </li><li> Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e certificar-se de almofada térmica é ligado em todos os momentos. Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo de aplicá-lo contra a direção do crescimento do cabelo. Remover restos de pele usando creme de depilação. Qualquer remanescente pele irá interferir com imagens ópticas. Remover suturas usando tesoura fina e pinças. </li><li> Coloque três animais na fase IVIS aquecida a 37 ° C durante cada sessão de imagem. Definir o tempo de exposição ao auto, visualizar campo para C, e ajustar filtros. Por exemplo, por uma sonda fluorescente bisfosfonato conjugado caracterizado com excitação máxima no comprimento de onda de luz de 680 nm, use um filtro de excitação de 675 nm e um filtro de emissão de Cy5.5 . Da mesma forma, quando se utiliza um agente fluorescente transmitida pelo sangue, com pico de excitação a comprimentos de onda de luz 750 nmusar um filtro de excitação de 710 nm e um filtro de emissão de 780 nm. </li><li> Imagem a ratos através Viver software imagem, premindo o botão &quot;Acquire&quot;. Certifique-se a região calvarial é completamente visível (Figura 3B) Para uma abrangente guia de aconselhar Lim et al 2009 8. </li><li> Permitir que os ratos para despertar a inalação de oxigênio a 100%. </li><li> Injectar a sonda fluorescente 2-nmol através de uma injecção intravenosa cauda. Na sessão de imagem designado, realizar imagem tal como descrito acima. </li></ol> 5. Micro-Tomografia Computadorizada para regeneração óssea <ol><li> Para a quantificação da formação de osso, anestesiar o rato por inalação de isoflurano a 3%, como descrito no passo 4.2 - 4.3. Transferir o mouse para o scanner μCT, e colocá-lo no scanner. </li><li> Definir tubo de raio-x de energia potencial do scanner μCT a 55 kVp e intensidade de 145 mA média resolução. Usando um campo de visão de 20,5 mm, executarum olheiro (raio-x simples) digitalizar e definir uma região de interesse que se estende desde os olhos do rato para a parte de trás do seu crânio. Realizar tomografia computadorizada, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms. </li><li> Reconstruir as fatias 2D utilizando uma resolução espacial nominal de 20 mm. Alinhe as margens do defeito para uma posição padronizada usando software μCT 9. </li><li> Semelhante ao passo 3.20, definir um volume cilíndrico de interesse e aplicar o filtro Gaussian 3D restrita (σ = 0,8 e apoio = 1) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Segmento do tecido ósseo a partir de tecidos moles usando um procedimento de limiar global. </li><li> Determinar o volume de tecido mineralizado do osso no volume de interesse. </li></ol> 6. A bioluminescência imagem de Recrutamento e Diferenciação de Células-Tronco <ol><li> Prepare o mouse para imagens como descrito nas secções 4,2-4,4 e despertar os ratos por inalação de oxigênio a 100%. </li><li> Administrar 126 mg / kg de luciferina de escaravelho para cada ratinho através de injecção intraperitoneal, e retornar o animal à câmara de indução. Após 2 min, anestesiar o animal utilizando 3% de isoflurano. Coloque os ratos na IVIS aquecido palco. </li><li> Via Viver software de imagem, definir o tempo de exposição a &quot;auto&quot;, eo campo de visão para C. Imagem ratos 5 min após a administração luciferina. Imagem os animais como descrito no passo 4.6, utilizando a modalidade &quot;bioluminescência&quot; Definir as regiões de interesse, porque a expressão do transgene varia entre ratinhos. Normalizar o sinal calvarial à cauda. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calvarial+burring+on+resorption+of+onlay+cranial+bone+graft.">Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft.</a> J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).</li><li>Yin, J., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completely+resorption+of+autologous+skull+flap+after+orthotopic+transplantation:+a+case+report.">Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report.</a> Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).</li><li>Schuss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+flap+resorption:+risk+factors+for+the+development+of+a+long-term+complication+following+cranioplasty+after+decompressive+craniectomy.">Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy.</a> J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).</li><li>Ben Arav, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-coated+allografts:+a+novel+approach+for+cranioplasty.">Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty.</a> J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).</li><li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+cortical+bone+allografts+mediated+by+adherent+rAAV-RANKL+and+VEGF+gene+therapy.">Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy.</a> Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+allograft+integration+in+a+calvarial+bone+defect.">PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect.</a> Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vessel+maturation.">Molecular regulation of vessel maturation.</a> Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).</li><li>Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+of+the+wild+vessel:+promoting+vessel+stabilization+for+safe+therapeutic+angiogenesis.">Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis.</a> Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).</li><li>Moutsatsos, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenously+regulated+stem+cell-mediated+gene+therapy+for+bone+regeneration.">Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration.</a> Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).</li><li>Deckers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+stimulate+angiogenesis+through+osteoblast-derived+vascular+endothelial+growth+factor.">Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor.</a> A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).</li><li>Cornejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+adipose+tissue-derived+osteogenic+and+endothelial+cells+on+bone+allograft+osteogenesis+and+vascularization+in+critical-sized+calvarial+defects.">Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O objectivo das abordagens de imagem multimodais aqui descritas é permitir meticulosa investigação do eixo angiogénese-osteogénese no contexto de enxerto de osso craniano. A neovascularização foi fotografada utilizando um protocolo μCT, o que permitiu uma alta-resolução demonstração 3D exacta da árvore vascular que alimenta todo o defeito craniano. μCT dados podem ser facilmente analisados ​​utilizando ferramentas avançadas como software IPL. Por exemplo, a análise de espessura mostrado na</s...

Perda óssea devido ao trauma craniofacial, a ressecção do tumor, craniotomia descompressiva, e defeito congênito raramente cura por si só e apresenta uma necessidade clínica não satisfeitas clara. Enxertos ósseos autólogos e alogênicos enxertos ósseos são amplamente utilizados para tratar estas condições 1. É amplamente aceito que osteogênese é intimamente ligado com a angiogênese 2,3. Assim, o estudo completo de uma terapia proposta para regeneração óssea deve incluir uma investigação exaustiva da árvore vascular formando ao longo do sítio do defeito completo. Existem vários métodos disponíveis para caracterizar a vascularização em modelos de pesquisa. A árvore vascular pode ser investigado por análise histológica. Desde histologia depende de seccionamento de tecidos, existe uma alta probabilidade de que a imagem resultante será distorcida. Para resolver este problema, microscopia intravital pode ser realizada para vasos sanguíneos imagem intacta 4; No entanto, este método élimitado a um plano de imagem. μCT digitalização de espécimes provenientes de um animal perfusão com agente de contraste permite imagens em 3D da rede vascular que alimenta o local de regeneração 5. Esta abordagem permite uma demonstração altamente detalhada da vasculatura de um órgão como um todo, assim como uma análise minuciosa de distribuição dos vasos sanguíneos. Além disso, permite a diferenciação entre μCT diâmetros variados de vasos sanguíneos, que caracterizam os diferentes subtipos de vasos sanguíneos. Nossa hipótese é que a implantação de um auto-enxerto calvarial irá induzir maior neovascularização do que a implantação de um aloenxerto, e este aumento da neovascularização levará, por sua vez, para o reforço da osso formation.To perseguir essa hipótese nós empregamos uma variedade de técnicas. Foram investigados os padrões da árvore vascular recém-formada através da realização de uma análise baseada em μCT. Medimos perfusão sanguínea utilizando uma sonda fluorescente sangue-piscina. Em seguida, nós burrosmineralização do tecido ósseo sed por FLI de uma sonda dirigida por hidroxiapatita e análise μCT. Finalmente, monitorizada recrutamento de células estaminais e diferenciação, realizando BLI em ratinhos transgénicos em que a luciferase é expressa em células de osteocalcina-positiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/C&#160; Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FVB/n Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenobarbital</td>
			<td style="width:112px;">West waro</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0641-0477-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rodent hair clipper</td>
			<td style="width:112px;">Wahl animal</td>
			<td style="width:119px;">8786-451A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel 11</td>
			<td style="width:112px;">Miltex</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27111504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dental micro motor</td>
			<td style="width:112px;">marathon III</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5mm trephine</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">18004-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hair removing cream</td>
			<td style="width:112px;">Veet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KetaVed (Ketamine)</td>
			<td style="width:112px;">Vedco</td>
			<td style="width:119px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Domitor</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA 141-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">carprofen</td>
			<td style="width:112px;">Norbrook</td>
			<td style="width:119px;">02000/4229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:112px;">Puralube</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating binocular</td>
			<td style="width:112px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Curve tweezers</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spoon shaped spatula</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tisseel Fibin gel kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">718971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needle holder</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vicryl suture 4-0</td>
			<td style="width:112px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">J392H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antisedan</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA#141033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20ml luerlock&#160;</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">23G scalp vein set (butterfly needle)</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">367342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemostat</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:112px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:119px;">PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3sec gel glue&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Scotch</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rodent dissection board</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">38DI02313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfil MV-122</td>
			<td style="width:112px;">flow-tech</td>
			<td style="width:119px;">MV-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">uCT40 scanner</td>
			<td style="width:112px;">Scanco</td>
			<td style="width:119px;">uCT40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCA6%</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osteosense 680</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Angiosense750</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxigen 100% medical grade</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane (furane)</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS kinetics</td>
			<td style="width:112px;">Xenogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beetle luciferin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E160A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computed tomography and optical imaging of osteogenesis-angiogenesis coupling to assess integration of cranial bone autografts and allografts

Um parâmetro importante que determina o sucesso de um procedimento de enxerto ósseo é vascularização da área circundante ao enxerto. Nossa hipótese é que a implantação de um enxerto ósseo induziria maior regeneração óssea por formação de vasos sanguíneos abundante. Para investigar o efeito do enxerto sobre a neovascularização no local do defeito, desenvolvemos uma tomografia (μCT) abordagem computadorizada de micro para caracterizar recém-formando vasos sanguíneos, o que envolve a perfusão sistêmica do animal com um agente de contraste de polimerização. Este método permite uma análise detalhada vascular de um órgão na sua totalidade. Além disso, a perfusão de sangue foi avaliado usando imagiologia de fluorescência (ILF) de um agente fluorescente transmitida pelo sangue. A formação óssea foi quantificada por FLI usando uma sonda segmentadas por hidroxiapatita e análise μCT. O recrutamento de células estaminais foi monitorizada por meio de imagem de bioluminescência (BLI) de ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina.Aqui descrevemos e demonstrar a preparação de aloenxerto, cirurgia defeito calvária, protocolos de digitalização μCT para o estudo neovascularização e análise da formação óssea (incluindo a perfusão in vivo de agente de contraste), e o protocolo para a análise de dados. A análise de alta resolução da vasculatura 3D demonstraram significativamente maior a angiogénese em animais implantados com autoenxertos, especialmente no que diz respeito à formação das arteríolas. Assim, a perfusão de sangue foi significativamente maior no grupo de auto-enxerto pelo 7º dia após a cirurgia. Observou-se a mineralização do osso superior e formação óssea maior medido em animais que receberam autoenxertos. Implantação autotransplante residente induzido recrutamento de células-tronco para a sutura do enxerto ósseo-hospedeiro, em que as células diferenciadas em células formadoras de osso entre o 7º e 10º dia pós-operatório. Esta descoberta significa que a formação óssea aumentada pode ser atribuída aa alimentação vascular aumentada, que caracteriza o implante auto-enxerto. Os métodos apresentados poderão servir como uma ferramenta ideal para estudar a regeneração óssea em termos de formação de osso bem delimitada e neovascularização.

A neovascularização foi avaliada através da análise volumétrica μCT e por ILF, utilizando um agente fluorescente transmitida pelo sangue para quantificar a perfusão sanguínea. Sete dias após a cirurgia, μCT varrimento demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de pequeno e médio Diâmetro em ratos que tinham recebido autoenxertos do que em ratinhos que receberam aloenxertos colhidas a partir de ratinhos C57BL / 6 (Figura 3A). Interessantemente, no grupo de auto-enxerto...

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Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

computed-tomography-optical-imaging-osteogenesis-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K visualizações.  The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine.  Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto. 

Vídeo: Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Oftalmoscopia Fotoacústica integrada e Spectral-domínio Tomografia de Coerência Óptica

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Detector óptico de ultra-som para aplicações Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a nano-scale. As such, traditional methods of describing implant surfaces -&#160;namely numerical determinants of surface roughness -&#160;are inadequate for predicting in vivo performance. Biomechanical testing provides an accurate and comparative platform to analyze the performance of biomaterial surfaces. An improved mechanical testing method to test the anchorage of bone to candidate implant surfaces is presented. The method is applicable to both early and later stages of healing and can be employed for any range of chemically or mechanically modified surfaces -&#160;but not smooth surfaces. Custom rectangular implants are placed bilaterally in the distal femora of male Wistar rats and collected with the surrounding bone. Test specimens are prepared and potted using a novel breakaway mold and the disruption test is conducted using a mechanical testing machine. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate and reproducible means for isolating an exact peri-implant region for testing.

An improved method to mechanically test bone anchorage to candidate implant surfaces is presented. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate means to direct the disruption forces to an exact peri-implant region.

Um método melhorado Ensaios Mecânicos para Avaliar osso-implante Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

Multimodal volumétrico Retinal Imaging pelo oblíquo digitalização Laser Oftalmoscopia (oSLO) e a tomografia de coerência óptica (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate structures&#160;while processing and histological observation provide limited information through cross-sectional imaging. Micro X-ray computed tomography (microCT) is an effective tool for obtaining three-dimensional information without damaging specimens. However, it shows limited efficiency in differentiating soft tissue parts. Use of contrast-enhancing agents, like phosphotungstic acid (PTA), can solve this problem by improving soft tissue contrast. We implemented microCT with PTA to investigate the human orbicularis retaining ligament (ORL), which is a delicate structure in the orbit area. In this method, harvested specimens are fixed in formalin, dehydrated in serial ethanol solutions, and stained with a PTA solution. After staining, microCT scanning, 3D reconstruction, and analysis are performed. Skin, ligaments, and muscles can be clearly visualized using this method. The specimen size and duration of staining are essential features of the method. The suitable specimen thickness was about 5&#8211;7 mm, above which the process was slowed, and the optimum duration was 5&#8211;7 days, below which an empty hole in the central area occasionally occurred. To maintain the location and direction of small pieces during cutting, sewing on the same region of each part is recommended. Furthermore, preliminary analyses of the anatomical structure are needed to correctly identify each piece. Parafilm can be used to prevent drying, but care should be taken to prevent specimen distortion. Our multidirectional observation showed that the ORL is composed of a multilayered meshwork of continuous plates, rather than thread-like fibers, as reported previously. These results suggest that microCT scanning with PTA is useful for examining specific compartments within complex structures of human tissue. It may be helpful in the analyses of cancer tissues, nerve tissues, and various organs, like the heart and liver.

Micro X-ray computed tomography is effective in obtaining three-dimensional information from undamaged human specimens but has limited success in observing soft tissues. The use of phosphotungstic acid contrast agent can resolve this issue. We implemented this contrast agent to examine human delicate fibromuscular tissues (the orbicularis retaining ligament).

Uso do micro tomography computado do raio X com preparação ácida phosphotungstic para visualizar o tecido fibromuscular humano

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...