Os autores gostariam de agradecer Vertex Pharmaceuticals e o Prêmio Inovação Tecnológica em Fibrose Cística para financiar R. Quinn e do NIH / NIAID para o financiamento da concessão 1 U01 AI124316-01, uma abordagem de biologia de sistemas para tratamento de patógenos resistentes a múltiplas drogas. Gostaríamos também de agradecer ao Departamento de Engenharia Mecânica e Aeroespacial no curso de design sênior de engenharia mecânica de graduação da UCSD para facilitar a colaboração com os aspectos de engenharia deste trabalho.

1. Preparação de Stocks para o Artificial escarro mídia <ol><li> Crie uma solução de mucina 5%. Adicionar 1,0 g de estômago de porco desidratado mucina a 20 ml de água desionizada. Autoclavar a soluo resultante. NOTA: A esterilização mucina irá destruir a sua estrutura inerente; outros métodos para esterilizar a mucina na sua forma seca incluem a esterilização de UV e a irradiação. Estes métodos não têm sido extensivamente usados ​​para o sistema de WinCF no entanto. </li><li> Adicionar 2,2 g de KCl a 50 ml de água desionizada e permitir a dissolução. Adicionar 5,0 g de NaCl para 50 ml de água desionizada e permitir a dissolução. Autoclave estas duas soluções. </li><li> Adiciona-se 100 mg de ADN de esperma de salmão a 10 mL de água desionizada estéril. Aquecer esta solução para cerca de 85 ° C num banho de água durante algumas horas para assegurar a dissolução. </li><li> Adicionar 5,0 mg de ferritina de 5,0 ml de água desionizada estéril. </li></ol> 2. Preparação do Artificial escarro Médio <ol><li> Combinaros seguintes componentes: 16 ml de solução de estoque de mucina, 2,0 mL de uma solução de estoque de KCl, 2,0 mL de uma solução de estoque de NaCl, 200 mL de emulsão de gema de ovo, 5,6 mL de uma solução de estoque de DNA, 120 mL de solução de estoque de ferritina, 5,78 mL de essencial solução de ácido amino, 5,78 mL de solução de amino ácidos não-essenciais, e 2,44 mL de água estéril. <ol><li> Se pequenas quantidades de sedimentos aparecem, agitar suavemente para misturar. </li><li> Pipetar 5,0 ml de meio em oito tubos de centrifugação estéril de 15 mL. NOTA: As condições químicas de cada tubo podem ser manipuladas como desejado. Por exemplo, soluções tampão e indicadores de pH pode ser adicionado a cada tubo com a finalidade de comparar o comportamento microbiano a níveis de pH diferentes. Uma demonstração disto é mostrado na secção de resultados representativos com 8 níveis de pH diferentes, de 5,0 a 8,5 em incrementos de pH 0,5. </li></ol></li><li> Uma vez que as condições químicas da mídia são manipulados com sucesso, congelar para uso posterior. Os meios de comunicação permanecerá estável frozen a -20 ° C durante vários meses. Vortex após o descongelamento. </li></ol> 3. Preparação de um controlo da execução do capilar Tubes <ol><li> Numa biohood estéril, encher oito tubos de microcentrífuga estéreis com 250 ul de meio cada. </li><li> Adquirir mais oito estéreis tubos de 15 ml de centrífuga, cada um dos tubos que corresponde a um tubo de microcentrífuga mencionado no passo 3.1. <ol><li> Esterilizar uma toalha de papel com uma solução de etanol a 70% e deixar secar. Depois de seco, rasgar a toalha em pedaços de cerca de quatro polegadas quadradas cada, e amassar cada pedaço no fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL. Para tubos adicionais, spray e toalhas de papel adicionais secos, conforme necessário. </li><li> Com um grupo de papel na parte inferior de cada tubo de centrífuga, cada amortecer ligeiramente aglomerado papel com cerca de 1,0 mL de água estéril para criar um ambiente húmido. </li></ol></li><li> Obter três tubos capilares de vidro para cada tubo de microcentrífuga, preparado no passo 3.1 e um bloco de tubo capilar de vidraceiro sealant. </li><li> Para cada tubo de microcentrífuga, preencher três tubos capilares com meios para cerca de 5 mm de distância do marcador azul perto do topo do tubo. <ol><li> Encha segurando uma extremidade do tubo no tubo de microcentrífuga e inclinando no sentido de orientação horizontal, permitindo a acção capilar para guiar o meio para dentro do tubo (Ver Figura 1). </li><li> Pare o enchimento, colocando suavemente com um dedo enluvado sobre a extremidade aberta do tubo, e em seguida selar a outra extremidade do tubo, pressionando-a para baixo para dentro do bloco de vedante. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo pH Gradient, enchimento capilar tubo com Artificial escarro Médio. O meio é adicionada através da inserção de uma extremidade do tubo para dentro do líquido e a inclinação para facilitar a acção capilar. A coloração forma, neste exemplo, é devido ao indicador de pH adicionada para ajudar a demonPotenciais mudanças na acidez após incubação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="5"><li> Coloque cada conjunto de três tubos capilares em tubos de centrifugação de 15 mL cheios de toalhas de papel completamente umedecidas com água estéril, com vedação de vedação para baixo. Tampe o tubo ea etiqueta. Estes três tubos capilares são para a replicação de cada condição de controlo. </li><li> Quando todos os tubos de centrífuga de 15 mL estiverem cheios com os seus tubos capilares designados, coloque os tubos num suporte. Coloque o rack de modo que os tubos sejam incubados horizontalmente (para capturar as bolhas de gás) (ver Figura 2 ). Incubar os tubos capilares dentro dos tubos de centrífuga (contendo os agregados de papel umedecidos) a 37 ° C durante 48 h. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplo pH Gradient, tubos capilares Pronto para incubação. Uma vez que três tubos capilares foram cheios e selados, que são colocados num tubo de centrífuga com uma toalha de papel húmido no fundo. Este tubo é em seguida tapado e colocado num bastidor. A cremalheira deve ser orientada lateralmente durante a incubação, como mostrado aqui, de modo que a produção de gás pode ser observado, uma vez a incubação estar completa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. Imagem do Controle capilar tubos após incubação <ol><li> Remover o rack de tubos de centrífuga da incubadora, certificando-se de manter os tubos horizontal. Cuidadosamente deslizar os tubos capilares para fora dos tubos de centrífuga, mantendo-se cada conjunto de três separados de outros conjuntos. </li><li> Dispor os tubos capilares próximos uns dos outros sobre uma caixa de luz, todos alinhados de modo que os conteúdos dos tubos são visIluminado. Deixar um intervalo de três em três tubos para separar diferentes condições químicas. </li><li> Com os tubos alinhados e a caixa de luz ligada, fotografe diretamente acima. (Ver Figura 3 ) </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Figura 3: Exemplo de Gradiente de pH, Controlo Executado, Pré-incubação, Sem Escarro Adicionado. Meio de escarro artificial depois de ser adicionado aos tubos capilares em grupos de três, aumentando o pH da esquerda para a direita. A combinação de indicadores adicionados ao meio resultam em tubos mais ácidos aparecendo mais amarelos, enquanto que os tubos menos ácidos tornam-se mais roxos. Os tubos são dispostos horizontalmente e são iluminados a partir de baixo, fotografado de cima. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Descarte oMateriais de controlo em resíduos biodegradáveis. </li></ol> 5. Inoculação dos tubos capilares WinCF com uma amostra de escarro <ol><li> Numa biofundidade estéril, enche oito tubos de microcentrífuga estéril com 225 μL de meio cada. </li><li> Homogeneizar a amostra de escarro retirando e ejectando o escarro repetidamente com uma seringa de 3 mL (uma seringa de plástico sem a agulha). Faça isso até que o escarro tenha consistência suave. </li><li> Adicionar 25 μL de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (diluição 1/10 em meio ASM) preparado no passo 5.1. Em seguida, vortex os tubos por 30 s para misturar suficientemente. </li><li> Adicionar o meio aos tubos capilares seguindo o mesmo procedimento dos passos 3.2 a 3.5. </li></ol> 6. Imagiologia dos Tubos Capilares de Amostra após Incubação <ol><li> Após o tempo de incubação de 48 h, remova e faça a imagem dos tubos capilares seguindo o mesmo procedimento descrito nos passos 4.1 a 4.3. </li><li> Se houver bolhas nos tubos, façaAs fotografias tiradas representam claramente a delineação entre as bolhas e os meios nos tubos. Se o biofilme estiver presente, certifique-se de que as fotografias também podem representar claramente a sua presença. </li></ol> 7. Remoção de mídia para aplicativos downstream <ol><li> Para facilitar a análise a jusante, remova o meio dos tubos capilares após a imagem. As aplicações potenciais incluem a cultura e a sequenciação de ADN / ARN e perfis metabolómicos. Cuidado: Os tubos capilares de vidro cheios de agentes patogênicos são um risco biológico significativo, portanto, estes passos devem ser feitos com muito cuidado com equipamentos específicos. Se os tubos capilares quebrarem, descarte-os em recipientes adequados para perfurocortantes com risco biológico. </li><li> Use agulhas de ponta romba de calibre 25 e 0,5 polegadas de comprimento para remover a mídia. Insira a agulha de ponta romba na extremidade do tubo quebrada para quebrar o selo. </li><li> Depois de quebrar o selo, vire o tubo capilar de cabeça para baixo ea mídia vai escorrer para fora da parte superior. EuSe o meio não escorrer facilmente, use uma pipeta com uma ponta de 200 μL e expulse o meio para fora do tubo pressionando o êmbolo da pipeta quando inserido na extremidade do tubo capilar. Recolher o meio do tubo expelido num recipiente apropriado (tubo de centrífuga de 1,5 mL). NOTA: Para análise transcriptómica ou outra análise de ARN, o meio pode ser expelido directamente para tampões de estabilização de ARN. </li></ol> 8. O sistema WinCF FLUD NOTA: O Sistema de Utilitário de Carregamento de Fluidos WinCF (FLUD) é um conjunto opcional de dispositivos complementares projetados para otimizar o rendimento do Sistema WinCF. O sistema WinCF FLUD é composto principalmente por materiais 3D imprimíveis. A fabricação impressa 3D permite a substituição rápida e fácil de materiais para garantir o tempo de inatividade mínimo para os pesquisadores, bem como exigências mínimas de fabricação. Projetos, arquivos stl, instruções de impressão 3D e o manual WinCF FLUD estão disponíveis no suplemento on-lineNt. <ol><li> Preparação de meios para o carregamento de tubos capilares <ol><li> Numa biofundidade estéril, enche oito tubos de microcentrífuga estéril de 2 mL com 900 μL de meio cada. </li><li> Homogeneizar as amostras de escarro retirando e expelindo o escarro repetidamente com uma seringa de 3 mL (uma seringa de plástico sem a agulha). Faça isso até que o escarro tenha consistência suave. </li><li> Adicionar 100 μL de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (diluição 1/10 em meio) preparado no passo 8.1.1. Em seguida, vortex os tubos por 30 s para misturar suficientemente. </li><li> Encaixar os tubos de microcentrífuga cheios e abertos no suporte do tubo rotador orientado de modo que os tubos sejam verticais. </li></ol></li><li> Colocação de tubos capilares <ol><li> Recolher três tubos capilares para cada tubo de microcentrífuga no passo 8.1. </li><li> Introduza três tubos no suporte de borracha de forma que estejam alinhados com os tubos de microcentrífuga na outra extremidade do aparelho.Certifique-se de que as extremidades marcadas dos tubos fiquem afastadas dos tubos de microcentrífuga. Coloque os três furos na parte inferior do suporte corretamente sobre os três parafusos na base do berço. </li><li> Com os tubos capilares colocados em repouso nos seus canais guia no aparelho, coloque o tampão de borracha sobre os seus midsections com segurança para evitar deslocamento. (Ver Figura 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Figura 4: O sistema FLUD totalmente carregado com tubos capilares protegidos pela borracha Tamp sobre seus Midsections. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> Colocação da mídia nos tubos capilares <ol><li> Utilize cuidadosamente uma mão para agarrar a extremidade do aparelho onde os tubos capilares estãoaded, e utilizar a outra mão para segurar a cremalheira rotador em que os tubos de microcentrífuga são carregados. </li><li> Delicadamente rodar a cremalheira de microcentrífuga de modo que os tubos de microcentrífuga são quase horizontal e prosseguir para empurrar lentamente a cremalheira para os tubos capilares. (Ver Figura 5) </li><li> Quando as extremidades dos tubos capilares fazer contacto com os meios em tubos de microcentrífuga, assegurar que a acção capilar começa imediatamente o enchimento dos tubos capilares. Para ajustar a taxa de preenchimento e preencha nível, rode suavemente o aparelho como um todo. Enquanto isso, tenha cuidado para não derramar mídia para fora dos tubos de microcentrífuga. (Ver Figura 6) </li><li> Quando os tubos capilares estão cheios até níveis desejados, colocar o nível aparelho sobre uma superfície e cuidadosamente ainda rapidamente puxar a prateleira de tubos de microcentrífuga de fora das extremidades dos tubos capilares para cessar o enchimento. Os tubos de microcentrífuga pode ser agora retraída todo o caminho de volta para a posição vertical e fechado. </li><li> Selar as extremidades salientes dos tubos capilares, premindo um bloco de vedante em cada conjunto em triplicado, um conjunto de vedação de cada vez até que todos os conjuntos são selados. Para reduzir o risco de contaminação, pressionar uma parte diferente do bloco de vedante em cada conjunto em triplicado (Ver Figura 7). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Figura 5: O Sistema Flud com meio tubos implantados para uma orientação horizontal, pronto para fazer contato com tubos capilares. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Figura 6: O sistema Flud com Capilar Tubos Carregando com o Media via ação capilar. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Figura 7: Selando tubos capilares cheios no sistema FLUD Um conjunto de triplicado por vez utilizando um bloco de vedação. Este bloco de vedação tinha plástico ao longo dos bordos que foi cortado para evitar o contacto com conjuntos de triplicado vizinhos durante a vedação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Incubação <ol><li> Remova o tampão de borracha sobre o midsections tubo e levantar o berço de borracha fora do aparelho principal. Isso deve levar todos os tubos capilares com ele. Agora coloque o berço e os tubos sendo mantidos no rack de imagem. Esta rack tem três topos que se encaixam dentro do compartimento, bem como canais de guia pequenos para definir os tubos para. </li><li> Defina o rack de imagem como um todo em caixa de plástico de incubação claro. Soak pequenas quantidades de toalhas de papel estéril em água estéril e colocar ao longo dos dois lados mais curtos da caixa para fornecer humidade durante a incubação. (Ver Figura 8) </li><li> Fechar a caixa completamente e ajustado dentro de um 37 ° C incubadora, certificando-se de manter os tubos horizontais. Incubar durante 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Figura 8: Capilar Tubos em Borracha Cradle Transferido do Flud Sistema em uma cremalheira Imaging, que foi colocado em uma câmara de incubação Limpar Juntamente com papel toalha para fornecer umidade. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior do th</a>É a figura. <ol start="5"><li> Imaging e extração <ol><li> Remova o suporte de imagem que segura os tubos da caixa de incubação e coloque-o em uma caixa de luz, iluminada por baixo. Com os tubos já existentes no crivo de imagem, os conjuntos triplicados estarão devidamente espaçados e prontos para imagem imediatamente. </li><li> Focalize a câmera nos tubos de modo que todos sejam visíveis no campo de visão ea luz da caixa de luz fornece contraste e visualização suficientes da cor nos corantes de tubo. Fotografia de diretamente acima. </li><li> Para extrair o conteúdo dos tubos, retire os tubos capilares do suporte de borracha um conjunto de triplicados de cada vez. Levante suavemente os tubos para cima e fora do berço ou deslize-os para fora. </li><li> Para cada conjunto de triplicados, siga o procedimento de extração detalhado nos passos 7.1 a 7.3. </li></ol></li></ol>

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	<li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Winogradsky-based+culture+system+shows+an+association+between+microbial+fermentation+and+cystic+fibrosis+exacerbation.">A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation.</a> ISME J . 9, 1024-1038 (2015).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+of+the+cystic+fibrosis+lung.">Microbial ecology of the cystic fibrosis lung.</a> Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).</li><li>Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+lung+microbiome:+Opportunities+to+reconsider+management+of+airway+infection.">Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection.</a> Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).</li><li>Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+human+airway+microbial+ecology+reveals+a+pervasive+signature+for+cystic+fibrosis.">Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).</li><li>Willner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+microbial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung.</a> ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).</li><li>Delhaes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+microbiota+in+cystic+fibrosis:+a+complex+fungal+and+bacterial+community--implications+for+therapeutic+management.">The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management.</a> PloS one. 7 (4), e36313 (2012).</li><li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D.+Bacterial+diversity+in+cases+of+lung+infection+in+cystic+fibrosis+patients:+16S+ribosomal+DNA+(rDNA)+length+heterogeneity+PCR+and+16S+rDNA+terminal+restriction+fragment+length+polymorphism+profiling.">D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling.</a> J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).</li><li>Stenbit, A. E., Flume, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+exacerbations+in+cystic+fibrosis.">Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).</li><li>Twomey, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+metabolite+profiling+reveal+specific+alterations+in+bacterial+community+structure+and+environment+in+the+cystic+fibrosis+airway+during+exacerbation.">Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation.</a> PloS one. 8 (12), e82432 (2013).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cystic+fibrosis+airway+microbiota+at+pulmonary+exacerbation.">Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation.</a> Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li><li>Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+Cystic+Fibrosis+Sputum+Can+Be+Chemically+Dynamic,+Anoxic,+and+Extremely+Reduced+Due+to+Hydrogen+Sulfide+Formation.">Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation.</a> mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).</li><li>Sriramulu, D. D., L&#252;nsdorf, H., Lam, J. S., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).</li><li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+forces+shape+the+composition+and+physiology+of+polymicrobial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung.</a> mBio. 5 (2), (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A composição microbiológica de um pulmão com CF contém uma grande variedade de organismos, mas as condições dentro do pulmão provavelmente tem uma influência significativa sobre que tipos de micróbios podem sobreviver e prosperar 13, 15. mecanismos específicos através dos quais essas condições mudam e os efeitos exatos que têm sobre o microbioma pulmão são geralmente desconhecido até o momento. Neste método experimental, é apresentada uma an?...

O método descrito neste manuscrito é chamado de sistema WinCF 1 . O objetivo geral do WinCF é fornecer uma instalação experimental capaz de simular o ambiente de um bronquíolo pulmonar cheio de muco. Isto permitirá um sistema de tratamento para estudar patógenos microbianos de doenças pulmonares com um fenótipo de hipersecreção de muco incluindo fibrose cística (FC), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), asma e outros. O procedimento foi projetado especificamente para o estudo da FC, que é caracterizada por mutações que causam secreções pulmonares para tornar-se espessa e difícil de limpar, eventualmente enchimento bronquíolos e outras pequenas passagens com muco 2 . Tais bloqueios no pulmão inibem a troca de gases porque o ar inalado não é mais capaz de atingir muitos alvéolos e também proporcionar um habitat para colonização bacteriana 3 , 4 . A incapacidade de prevenir o crescimento microbianoO excesso de muco pulmonar leva eventualmente ao desenvolvimento de infecções crónicas complexas das vias aéreas. Estas comunidades contêm uma variedade de organismos, incluindo vírus, fungos e bactérias como Pseudomonas aeruginosa , todos interagindo uns com os outros 5 , 6 , 7 , 8 . Acredita-se que a atividade do microbioma pulmonar da FC esteja envolvida em crises de sintomas denominadas exacerbações pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite o estudo do comportamento da comunidade microbiana em torno dessas exacerbações e agora está sendo expandido para atuar como um sistema experimental de base para estudar a ecologia microbiana pulmonar. Tradicionalmente, as exacerbações foram estudadas através da análise direta de amostras retiradas do pulmão. Muitos fatores de confusão fazem análise direta do microbiano bComportamento no pulmão desafiando, com o sistema WinCF, muitos desses fatores são removidos eo comportamento do microbioma pulmonar pode ser estudado mais diretamente, permitindo uma análise mais fina da atividade bacteriana em um muco-plugged bronchiole. O sistema WinCF fornece um método para crescer e analisar as bactérias de uma forma que efetivamente imita o ambiente pulmonar. Os métodos tradicionais para o cultivo de bactérias pulmonares envolvem frequentemente a cultura de amostras em placas de agar tradicionais. Esses métodos deixam as amostras abertas ao oxigênio atmosférico, negligenciando a explicação das condições hipóxicas e muitas vezes anóxicas encontradas nos bronquíolos pulmonares obstruídos pelo muco 12,13 . A cultura em ágar sob condições aeróbicas não é nada como o ambiente do pulmão de FQ e pode induzir em erro os clínicos e pesquisadores quanto ao comportamento dos patógenos que eles estão tentando tratar. Além disso, os nutrientes disponíveis para bactérias em placas de ágarSão diferentes daquelas disponíveis no escarro real, o que é explicado no WinCF através da utilização de meios de escarro artificial (ASM). Tal como demonstrado pelas culturas de Pseudomonas em Sriramulu et al. 14 , ASM inclui um conjunto específico de componentes que imita os recursos disponíveis para os micróbios de expectoração e também reproduz a consistência física do escarro. Porque um pulmão doente tem um microbiome específico, o estudo de tais microorganisms deve ocorrer idealmente nas circunstâncias específicas do pulmão também. O sistema WinCF permite uma análise rápida e fácil manipulação das condições experimentais para observar alterações microbianas semelhantes à forma como elas ocorreriam em um bronquíolo pulmonar real. Esta técnica permite a inoculação de uma miríade de tipos de amostras relacionadas incluindo escarro, saliva, outras secreções corporais e culturas bacterianas puras ou misturadas. A natureza da configuração experimental permite uma interpretação visual imediataO comportamento da comunidade microbiana e é projetado para permitir a fácil aplicação a jusante de uma infinidade de procedimentos microbiológicos e ósmicos. Tais estudos são importantes porque a composição da comunidade bacteriana muda com base nas condições físico-químicas de seu ambiente. Com WinCF as condições químicas da mídia podem ser manipuladas para analisar os efeitos sobre a atividade bacteriana. Por exemplo, a acidez do meio pode ser alterada antes da inoculação com uma amostra. Após a incubação, a actividade bacteriana em cada uma destas condições pode ser directamente comparada, e as conclusões podem ser tiradas sobre como as bactérias nessas amostras de escarro se comportam em resposta ao pH variável. Aqui, descrevemos os procedimentos para aplicar o sistema WinCF e exemplos de como a química dos meios pode ser manipulada para estudar os efeitos sobre o microbioma pulmonar.

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	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

Muitas doenças crônicas das vias aéreas resultam em obstrução do muco das vias aéreas. Os pulmões de um indivíduo com fibrose cística são um caso exemplar onde seus bronquíolos obstruídos pelo muco criam um habitat favorável para a colonização microbiana. Vários agentes patogénicos prosperam neste ambiente interagindo uns com os outros e conduzindo muitos dos sintomas associados com doença de FC. Como qualquer comunidade microbiana, as condições químicas de seu habitat têm um impacto significativo na estrutura e dinâmica da comunidade. Por exemplo, diferentes microrganismos prosperam em diferentes níveis de oxigénio ou outras concentrações de soluto. Isto também é verdade no pulmão de FQ, onde se acredita que as concentrações de oxigênio conduzem a fisiologia e estrutura da comunidade. Os métodos descritos aqui são projetados para imitar o ambiente pulmonar e gerar patógenos de uma maneira mais semelhante àquela de que eles causam a doença. Manipulação do ambiente químico desses micróbios é então usado para estudar como o chemistry de infecções pulmonares regula a sua ecologia microbiana. O método, chamado o sistema WinCF, baseia-se em meio de expectoração artificial e tubos capilares estreitos destinam a proporcionar um gradiente de oxigénio similar ao que existe no bronquíolos ligado de muco. Manipulando as condições químicas, tais como o pH do meio da expectoração ou antibióticos pressão, permite a visualização das diferenças microbiológicos nas amostras utilizando indicadores coloridos, para observação de gás ou de biofilme de produção, ou extracção e sequenciando os teores de ácidos nucleicos de cada amostra.

crescimento microbiológico entre as várias condições químicas induzidas no interior das amostras variou dramaticamente em alguns casos, e mais subtilmente nos outros. Muitas mudanças na atividade eram de natureza visual, sendo facilmente perceptível assim que o período de incubação terminou. No exemplo de manipulação de pH, as amostras de todo o espectro de pH variado muito conforme mostrado por vários factores que se tornaram evidentes após incubação. Quando não há amo...

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The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas.

O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

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9.0K visualizações.  University of California, San Diego.  O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas. 

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...