Este protocolo fornece um modelo reprodutível de pneumonia que gera uma lesão pulmonar aguda robusta. Outras vantagens deste modelo é que pode ser usado para reproduzir SDRA infecciosa ou síndrome do desconforto respiratório agudo em camundongos. Como mencionei, este modelo é altamente reprodutível onde o nível de mortalidade e lesão pode ser facilmente titulado para avaliar as fases inicial e tardia da lesão pulmonar aguda e resolução, o que serve como uma plataforma para avaliar estratégias terapêuticas.
Embora este protocolo não forneça uma nova abordagem para o diagnóstico ou tratamento da lesão pulmonar, é um modelo confiável onde novas terapias podem ser testadas, o que é particularmente útil para áreas relacionadas à imunologia, doenças pulmonares e doenças infecciosas. Uma das vantagens dessa técnica é sua reprodutibilidade. No entanto, as pessoas que realizam essa técnica pela primeira vez podem ter dificuldades para inserir o cateter por via intratraqueal.
É por isso que, idealmente, as pessoas que aprendem essa técnica devem começar a praticar em animais sacrificados. Para começar, aqueça uma placa de ágar sangue por 10 minutos a 37 graus Celsius em uma coqueteleira ou incubadora aquecida. Pegue um novo frasco de estoque bacteriano do freezer e descongele-o por agitação suave em banho-maria a 37 graus Celsius até que o frasco esteja completamente descongelado.
Evite tocar no O-ring ou na tampa com água morna. Para contar manualmente as colônias bacterianas em uma placa, execute uma diluição de 1 vezes 10 elevado à sexta e coloque 200 microlitros a partir da última diluição em uma placa de ágar sangue pré-aquecida. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, determine a nova concentração bacteriana aplicando a fórmula fornecida. Coloque o mouse anestesiado em uma superfície limpa e esterilizada. Pendure o mouse pelos incisivos e prenda suavemente os membros anteriores.
Depile a região do pescoço e desinfete a área com clorexidina e álcool 70%. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão superficial de um centímetro no pescoço para visualizar a traqueia. Se uma abundância de tecido adiposo for observada, disseque cuidadosamente o tecido adiposo verticalmente para visualizar a traqueia.
Puxe a língua para fora suavemente e introduza um angiocateter de calibre 20 pela boca, avançando o cateter para dentro da traqueia. Aplique uma leve pressão sobre a traqueia para facilitar a intubação. Após a intubação, conecte o mouse a um respirador para confirmar a intubação.
Defina os parâmetros do ventilador para 200 microlitros de volume corrente e 200 golpes por minuto. Após confirmar a intubação, desconecte o mouse do respirador e instile cuidadosamente 50 microlitros do agente bacteriano através do cateter angio usando uma pipeta de 200 microlitros, ponta de carregamento de gel. Após a instalação, conecte o mouse ao respirador novamente para ajudar a reiniciar a respiração.
Deixe o mouse no respirador por 30 a 60 segundos para monitorar a respiração. Se um padrão de respiração lenta for observado, conecte o mouse ao respirador novamente. Feche a incisão adicionando uma gota de cola na pele.
Junte as dobras da pele e aplique uma leve pressão até que a cola seque. Coloque o camundongo sacrificado em decúbito dorsal em uma tábua cirúrgica limpa e pendure-o pelos incisivos. Depois de pulverizar a pele do camundongo com etanol a 70%, usando uma tesoura, faça uma pequena excisão superficial do pescoço na linha média para visualizar a traqueia.
Canule a traqueia com um cateter de calibre 20 e adicione cuidadosamente um mililitro de PBS livre de cálcio por via intratraqueal usando uma seringa de um mililitro. Permita a expansão pulmonar completa e, em seguida, aspire o fluido usando a mesma seringa. Repita o procedimento duas vezes para um total de dois mililitros.
Transfira a lavagem broncoalveolar, ou LBA, para uma alíquota de dois mililitros. Usando uma tesoura, abra a cavidade torácica para expor o pulmão, o coração e a traqueia. Disseque cuidadosamente o diafragma e remova a caixa torácica, certificando-se de não beliscar o tecido pulmonar.
Tranecte a aorta abdominal para permitir a exsanguinação. Perfundir o tecido pulmonar fazendo uma pequena incisão de aproximadamente um a dois milímetros no ventrículo direito usando uma tesoura e injetando cinco mililitros de PBS frio, usando um cateter de calibre 20. Após a perfusão bem-sucedida, o tecido pulmonar fica branco e pálido, e o PBS deixa o compartimento intravascular através da aorta abdominal.
Em seguida, extraia cuidadosamente o pulmão e disseque-o da traqueia. Alternativamente, se o pulmão estiver sendo usado para histologia, insira cuidadosamente um cateter de calibre 20 para inflar os pulmões até 25 centímetros com solução de formalina. Assim que os pulmões forem insuflados, passe um fio de sutura 3/O com cerca de cinco centímetros de comprimento abaixo da traqueia e amarre-o firmemente duas vezes para garantir que a formalina permaneça no tecido pulmonar.
Disseque suavemente o pulmão do resto dos tecidos e coloque-o em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução de formalina. Centrifugar o LBA a 500 G a quatro graus Celsius durante cinco minutos e remover o sobrenadante sem células num tubo separado. Lise os glóbulos vermelhos adicionando 100 microlitros de tampão de lise por um minuto.
Neutralize a reação de lise adicionando um mililitro de PBS. Centrifugue o LBA e remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 100 a 300 microlitros de PBS. Em seguida, execute uma contagem de células com 0,4% de coloração azul de tripano por contagem automatizada de células.
Disseque suavemente o pulmão dos tecidos em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS frio. Após a dissecção, remova o pulmão do PBS e seque-o com uma toalha de papel. Disseque o pulmão direito e esquerdo de outros tecidos que também foram extraídos, como a traqueia.
Prepare um coquetel de digestão conforme descrito no manuscrito do texto e transfira o pulmão para um tubo C contendo um mililitro de coquetel de digestão. Transfira o tubo para o dissociador de tecido e siga o protocolo padronizado para processamento de tecido pulmonar. Após a dissociação, adicione 10 mililitros de PBS frio no tubo e misture bem.
Filtre a suspensão de célula única usando um filtro de célula de 70 mícrons em cima de um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Centrifugue a suspensão e remova o sobrenadante. Adicione um milímetro de tampão de lise por um minuto à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS frio para interromper a reação de lise e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em PBS e execute uma contagem de células com coloração azul de tripano por contagem automatizada de células. Após lesão pulmonar induzida por pneumonia bacteriana em camundongos, os grupos infectados apresentaram menor peso corporal em comparação com o controle não infectado.
O grupo Streptococcus pneumoniae ou Spn recuperou seu peso corporal em relação à linha de base, enquanto Klebsiella pneumoniae ou camundongos infectados com Kpn apresentaram recuperação lenta após seis dias de infecção. A concentração de proteína LBA e a contagem total de células para o LBA e os pulmões foram marcadamente maiores nos grupos infectados. Cortes histológicos representativos exibindo o processo inflamatório em ambos os modelos foram obtidos nos dias dois, quatro e seis pós-inoculações, mostrando evidências de inflamação alveolar persistente nos camundongos infectados com Kpn, mesmo no dia 10.
Os camundongos infectados com Kpn continuaram a lesão no dia 10, enquanto os camundongos infectados com Spn resolveram a inflamação pulmonar no sexto dia. A paisagem imunocelular por citometria de fluxo multicolorida após seis dias de infecção por Spn mostrou um número aumentado de granulócitos, macrófagos intersticiais, monócitos, células B e células T, incluindo células natural killer. Ao tentar esse método, a inserção do cateter é a chave para ter infecções replicáveis.
Este é um método confiável que serve como plataforma para a identificação de alvos para o estudo da lesão pulmonar aguda e resolução.
