Gostaríamos de agradecer a Patrick Hayden (Mattek) para discussões úteis, e Robert Smith e Libby Perry da Geórgia Health Sciences University por suas habilidades de EM. Este estudo foi financiado pela NIDCD conceder DC010187 de DAD

1. Preparando o gabinete de biossegurança para os tecidos EpiAirway <ol><li> Vestindo um casaco de laboratório dedicado, com o cabelo amarrado para trás e luvas, iniciar o fluxo laminar. Após 5 minutos, mover todas as ferramentas no armário (pipetadores, dicas, tubos de centrífuga, etc) para um lado, pulverizar o interior do armário de biossegurança ea faixa com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pulverizar o interior limpo novamente com etanol 70% e deixar secar. Mover as ferramentas para o lado limpo e repita o procedimento de etanol. </li><li> Use dicas barreira de aerossol pipeta e pipetadores no gabinete. Para utilizar individualmente embrulhados estéril pipetas sorológicas, passar o fim conectado através do fluxo laminar, quebrar, e deslize a pipeta no gabinete, descartando a parte externa da embalagem. </li><li> As pastilhas EpiAirway devem ser manipulados com pinças esterilizadas. Lugar de 6 polegadas ponta fina curva dissecar forceps em bolsas auto-selante de esterilização e autoclave. Prepare o suficiente para ter, pelo menos, seis dias por pronto para uso. </li></ol> 2. Desembalar os tecidos EpiAirway <ol><li> Pulverizar a superfície de trabalho no gabinete de biossegurança com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pintar novamente e deixe a superfície secar antes de usar. Abrir a caixa de EpiAirway e descartar o isopor e material de embalagem. </li><li> O EpiAirway mídia livre de antibióticos, manutenção AIR-100-MM ABF (MM), é propriedade da Mattek e é enviado no kit com as inserções. No armário de biossegurança, etiqueta seis tubos de centrífuga estéreis 50 ml com o tipo de mídia e data, e afrouxar as tampas. Pulverizar a garrafa de mídia com etanol 70% e abrir dentro do armário. Alíquota de 25 ml de MM em cada tubo utilizando uma pipeta estéril nova sorológicos para cada tubo, aperte as tampas, e armazenar a 4 ° C. Use uma nova porção da MM a cada dia. </li><li> Repita 2.2 usando uma garrafa fresca de 1 X Dulbecco tampão fosfato (D-PBS) com cálcio e magnésio. Repita novamente usando D-PBS sem cálcio e magnésio. Armazenar todas as alíquotas a 4 ° C. </li><li> As pastilhas EpiAirway AIR-100 chegar em uma placa de 24 poços a 4 ° C em meios contendo sólidos agarose, e deve ser colocado em 6 bem-placas para uso. Etiquetar cada placa com a data ea descrição usando um marcador de etanol-resistente. Mililitro coloque 1 de 4 MM EpiAirway ° C em cada poço. Remova a placa de transporte de sua embalagem, spray com etanol 70%, e colocar no gabinete de biossegurança. Remova a fita e abra a placa. Utilizando uma pinça esterilizada, retire a gaze umedecida sobre as inserções EpiAirway. </li><li> Pegue uma inserção com uma pinça autoclavado usando um movimento de torção para ajudar na liberá-lo do agarose, e coloque em um poço de uma placa de 6 poços. Alguns agarose podem aderir ao inserir, particularmente quando a temperatura da placa de transporte aumenta a temperatura ambiente. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente a agarose a partir da inserção. Evite tocar a membrana, e verifique se não existem bolhas de ar ficam presos embaixo da inserts. Coloque a placa em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. </li><li> Permitir que pelo menos 24 horas para os tecidos para equilibrar na incubadora antes de iniciar co-culturas. </li></ol> 3. Manutenção dos tecidos EpiAirway <ol><li> Utilizando uma pinça esterilizada, pegar uma inserção e gentilmente pipeta 200 microlitros de pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para o tecido e rock a inserção. Incline a inserir em um ângulo e coloque a ponta da pipeta estéril P1000 contra o anel de plástico que contém a membrana na parte inferior da pastilha. Não toque no tecido. Aspirar o D-PBS lavar e colocar em um cryovial rotulados estéril. As amostras podem ser congeladas a -20 ° C e analisadas para mucina e / ou expressão de citocinas em uma data posterior. </li><li> Mudar o MM basal diariamente por aspiração e substituir por um mililitro de MM fresco. Use uma ponteira de pipeta nova barreira para cada poço. Tratar o material usado com água sanitária a 10% durante a noite e de descarte. </li></ol> 4. Inoculação de tecidos EpiAirway <ol><li> Expelido de uma cultura fresca de Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) do estoque de glicerol congelados em ágar chocolate. Crescer durante a noite em um umidificado 5% incubadora de CO 2. </li><li> No dia seguinte, ressuspender colônias única de NTHi em pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para um OD (600 nm) de aproximadamente 0,7. Vortex vigorosamente antes de medir a densidade óptica. A relação da densidade óptica de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC / ml) de NTHi é que um OD (600 nm) de 0,2 é aproximadamente igual 1,0 x 10 8 UFC / ml. Portanto, um OD (600 nm) de 0,7 é cerca de 3,5 x 10 8 UFC / ml. Este algoritmo deve ser validado para cada cepa NTHi antes da inoculação. </li><li> Os tecidos EpiAirway AIR-100 são cultivadas em inserções com uma superfície de 0,6 cm 2 e 0,4 micron uma membrana. Os tecidos são compostos de aproximadamente 8,0 x 10 5 a ~ 1,0 x 10 6 &lt;/ Sup células&gt;. Portanto, uma inoculação de 1,0 x 10 7 UFC corresponde a uma multiplicidade de infecção de cerca de 10 - 12. Para inocular, lavar cada inserção EpiAirway como no 3.1, em seguida, adicionar 28 microlitros da suspensão bacteriana preparada em 4.2 para a superfície apical de cada inserção EpiAirway no gabinete de biossegurança. Não inocular o MM basal. Retorno de cada placa para a incubadora. </li></ol> 5. Quantificação do inóculo NTHi <ol><li> Preparar um tampão fosfato solução (PBS) com 0,1% de gelatina (PBS-G) autoclave, para esterilizar. Rótulo estéril de 1,5 ml tubos Eppendorf com as diluições 1:10 desejado baseado no OD (600 nm) do inóculo e alíquota 900 microlitros da PBS estéril-G em cada tubo. </li><li> Determinar o número de placas de chocolate agar necessário para enumerar os NTHi inoculados. Colocar essas placas em uma incubadora de ar de cabeça para baixo com a parte inferior da placa de descanso na metade da parte superior de uma hora. Isso permitirá que a placa para tanto quente a 37 ° C e secar a superfície, facilitando a queda de placas de NTHi. </li><li> Iniciar a diluições em série 1:10 do inóculo adicionando 100 microlitros da suspensão bacteriana de 4,2 para o primeiro tubo. Vortex cada diluição vigorosamente durante 5 segundos antes de fazer o próximo. Queda de 10 alíquotas microlitro sobre os pratos de agar pré-aquecido e superfície seca chocolate, usando a metade da placa para cada diluição. Cinco a seis alíquotas de 10 microlitros pode caber em uma metade de cada placa de 100 mm sem correr juntos. Ao local seco, de cabeça para baixo em um 37 ° C umidificado incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> No dia seguinte, determinar o UFC / ml, contando as diluições que têm 15-30 colônias distintas em cada gota e cálculo de volta ao seu real inóculo viável de NTHi. </li></ol> 6. Longo prazo co-cultura com NTHi <ol><li> A cada 24 horas, lavar as inserções como em 3.1, então o pool de lavagens de cada tecido que tenha sido inoculados com a mesma cepa de bactérias e congelar a -20 ° C em um cryovial rotulados para análise futura. Essas amostras podem ser analisadas para a presença de mucina por dot blots ou para a expressão de citocinas por ELISA. Alternativamente, os tecidos podem ser colhidas para mRNA e qPCR pode ser executada em genes de interesse. Mudar o MM basal diária como em 3.2. Continue para a duração da co-cultura. </li></ol> 7. Colheita de tecidos EpiAirway <ol><li> Prepare uma nova solução de 1% de saponina em D-PBS sem cálcio e magnésio, filtro de esterilizar e quente a 37 ° C. </li><li> Aquecer um tubo de 50 ml de MM e outro de D-PBS sem cálcio e magnésio a 37 ° C. </li><li> Prepare os tubos de diluição como em 5.1, bem como um vazio estéril de 1,5 ml por tubo Eppendorf de inserção, marcado com o número de inserção e tensão NTHi. </li><li> O EpiAirways podem ser colhidas para qualquer total de associados a células de bactérias, que inclui tanto os organismos aderentes e internalizada, ou para as bactérias internalizadas apenas. </li><li> Determinar o número de placas de ágar chocolate necessária para soltar placa da célula associada ou invadido NTHi, rotular e secar por uma hora em uma incubadora de ar como em 5.2. </li><li> A colheita total associados a células de bactérias, lavar a superfície apical da EpiAirways três vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio, em seguida, incline a inserção e enxaguar qualquer MM remanescentes da membrana basal. A primeira lavagem pode ser congelado para posterior análise; descartar as lavagens seguintes. </li><li> Coloque a inserção lavados em uma placa de 6-bem fresca sem MM, e pipetar 250 microlitros da solução de 1% estéril saponina de 7,1 sobre a superfície apical de cada tecido. Voltar para a incubadora por 10 minutos. </li><li> Remover da incubadora, e usando uma ponteira de pipeta estéril P1000, esfrega os tecidos da membrana usando um back-e-vem, seguido por um movimento circular para remover o tecido das bordas da pastilha. Usando um grande furo ponteira estéril P1000, coloque a suspensão no tubo vazio marcado preparadas em 7.3. Adicione 250 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio na superfície apical da inserção. </li><li> Examinar a inserção utilizando um microscópio de contraste de fase invertido para determinar se há qualquer tecido remanescente a ser colhida. Se necessário, esfregue novamente com outra ponta da pipeta estéril P1000, em seguida, adicione esta suspensão para o tubo de 7,8 usando um grande furo ponteira estéril P1000. Trazer o volume total do tubo para 1 mililitro usando D-PBS sem cálcio ou magnésio. </li><li> Vortex vigorosamente a suspensão de células em alta velocidade por um minuto. Usando uma seringa estéril 1 ml com agulha calibre 26, aspirar a suspensão para a seringa através da agulha. Lentamente passa a suspensão através da agulha 3 vezes, tomando cuidado para não criar bolhas. Vortex vigorosamente de novo durante um minuto. </li><li> Usando um grande furo ponta da pipeta, coloque 100 microlitros da suspensão para dentro do tubo de diluição preparado pela primeira vez em 7.3. Vortex vigorosamente durante cinco segundos, em seguida, fazer diluições em série 1:10. Queda da placa-as diluições desejadas sobre a superfície seca placas de ágar-chocolate. </li><li> Para colher as bactérias internalizadas apenas, lave cada inserção 3 vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio. Reter e congelar a primeira lavagem. Adicionar sulfato de gentamicina para pré-aquecido MM a uma concentração final de 100 microgramas / ml. Prepare 1,5 ml de mídia por inserir a ser colhida. Substituir o MM basal com o MM contendo gentamicina, e adicionar 300 microlitros de gentamicina contendo MM na superfície apical. Coloque a placa de volta para a incubadora de CO 2 por uma hora. </li><li> Remover o MM gentamicina contendo a partir da superfície apical e lavar a superfície apical ea membrana basal da inserção extensivamente com pré-aquecido D-PBS sem cálcio e magnésio. Proceder como no 7,7-7,11. </li></ol> 8. Resultados representativos: Eletromicrografias de varredura da (A.) tecido EpiAirway não infectados e (B.) tecido após a 5 dias de co-cultura com NTHi são mostrados na Figura 1. Longo prazo co-cultura com NTHi não resulta em danos significativos à apical tecidos, ressaltando a utilidade do modelo EpiAirway. Um gráfico mostrando o número de bactérias internalizadas quantificados ao longo do tempo dentro de tecidos é mostrado na Figura 2. Ambos os resultados são bastante reprodutível, tornando os tecidos EpiAirway uma consistente e biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos para estudar NTHi Hospedeiro-Patógeno interações. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de tecidos EpiAirway. A. tecido controle não infectado. B. Tissue após cinco dias de co-cultura com NTHi. Sem danos significativos à superfície apical é observada nos tecidos infectados. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Número de NTHi internalizadas ao longo do tempo durante EpiAirway co-cultura. Strain R2866 foi inoculado em aproximadamente 1,0 x 10 7 UFC / insert (Dia 0), então colhidas para as bactérias internalizadas em cada momento indicado. Barras representam n = 3 repetições em pelo menos duplicado. Barras de erro são SD.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este método permite a investigação de longo prazo interações patógeno-hospedeiro em um fundo biologicamente relevantes do ensino primário humana tecidos respiratórios na interface ar-líquido. Aqui nós temos utilizado NTHi como o organismo infectante, mas a interação de qualquer bactéria que não apresenta citotoxicidade inaceitáveis ​​ao longo do tempo pode ser quantificado com este método. O modelo EpiAirway também pode ser usado para o estudo de vírus, drogas ou produtos químicos que afetam as vi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo # </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Saponina </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% em D-PBS sem cálcio ou magnésio, filtro de esterilizar </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco tampão fosfato com cálcio e magnésio </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco tampão fosfato sem cálcio ou magnésio </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway livre de antibióticos tecidos </td><td> Mattek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibióticos de mídia livre de manutenção </td><td> Mattek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Fornecido com kit </td></tr><tr><td> Tampão fosfato 10X solução salina </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Diluir para 1X antes de usar </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Adicionar a uma concentração final de 0,1% em PBS 1 X e autoclave </td></tr><tr><td> Difco Base de Dados de Medium GC (ágar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave 36 g em 500 ml DDH 2 O e arrefecer a 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL Hemoglobina (ágar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave 10 g em 500 ml 2 O DDH, arrefecer até 60 ° C e misturar com a base média GC acima </td></tr><tr><td> BD BBL enriquecimento IsoVitaleX (ágar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Esfriar a mistura de GC base de médio e hemoglobina para 55 ° C e adicionar 10 ml de IsoVitaleX reidratados, despeje o chocolate placas de ágar </td></tr><tr><td> Pinças de dissecação, ponta fina, curvada </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-selante malotes da esterilização </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina, sulfato 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Adicionar 10 microlitros / ml para MM EpiAirway para o matar gentamicina </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Haemophilus influenzae não tipáveis ​​(NTHi) são adaptadas aos humanos bactérias Gram-negativas que podem causar infecções recorrentes e crônica da mucosa respiratória 1, 2. Para estudar os mecanismos pelos quais estes organismos sobrevivem e no interior dos tecidos respiratórios, um modelo no qual sucesso a longo prazo co-cultura de bactérias e células humanas pode ser realizado é necessária. Usamos principal respiratório humano tecidos epiteliais elevado à interface ar-líquido, o modelo EpiAirway (Mattek, Ashland, MA). Estes não são imortalizados, bem diferenciado, 3-dimensional tecidos que contêm tight junctions, células ciliadas e nonciliated, células caliciformes que produzem mucina, e manter a capacidade de produzir citocinas em resposta à infecção. Este biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos, pode ser usado em uma série de maneiras, o objetivo geral deste método é a realização de longo prazo co-cultura de tecidos EpiAirway com NTHi e quantificar células associadas bactérias e internalizado ao longo do tempo . Assim, a produção de mucina e do perfil de citocinas dos infectados co-culturas pode ser determinada. Esta abordagem melhora a métodos existentes, em que muitos protocolos atuais usam culturas submersas monocamada ou Transwell de células humanas, que não são capazes de suportar as infecções bacterianas durante longos períodos 3. Por exemplo, se um organismo pode replicar na mídia sobrejacente, isso pode resultar em níveis inaceitáveis ​​de citotoxicidade e perda de células do hospedeiro, prendendo o experimento. O modelo EpiAirway permite a caracterização de longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno. Além disso, desde a origem para a EpiAirway é humano normal tráqueo-brônquica células, em vez de uma linha imortalizada, cada um é uma excelente representação do real tecidos do trato respiratório superior humano, tanto na estrutura como na função 4. Para este método, os tecidos são desmamados EpiAirway off de compostos anti-microbial e anti-fúngicos por 2 dias antes da entrega, e todos os procedimentos são realizados sob condições livre de antibióticos. Isto requer considerações especiais, já que ambas as bactérias e primário tecidos humanos são usados ​​na cabine de segurança biológica mesmo, e são co-cultivadas por longos períodos.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes<em&gt; In vitro</emModelo&gt;. A abordagem pode ser usada com qualquer micróbio que é passível de longo prazo co-cultura.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K visualizações.  Mercer University School of Medicine. Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes In vitro. A abordagem pode ser usada com qualquer micróbio que é passível de longo prazo co-cultura.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...