R.J.M. é suportado por uma bolsa de doutoramento de AMC. Esta pesquisa foi apoiada pela sociedade holandesa de câncer (grant KWF UVA 2014-6839). Os autores agradecer Dr. A. Jonker por sua ajuda com a escrita do protocolo.

Este protocolo segue as diretrizes sobre o uso do material humano do Conselho de revisão médica-ético do centro médico acadêmico.
1. preparação de células ou cortes de tecido
<ol><li>Células<ol>
<li>Trypsinize células de pratos de cultura usando 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA por 5 min a 37 ° C em uma placa de Petri de 10 mm e trazer as células em suspensão de 50.000-200.000 cels/mL, dependendo do tamanho das células de 37 ° C.</li>
		<li>Anexe a 200 µ l de suspensão de células em lâminas de microscopia usando cytospin funis em um cytocentrifuge a 20 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Secar ao ar livre o cytospins por 24 horas à temperatura ambiente. Isso não afeta a atividade de desidrogenase. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cortes de tecido<ol>
<li>Extraia o tecido de pacientes ou animais de acordo com autorizações de éticas. 10 mm3 de tecido é suficiente para várias experiências.</li>
		<li>Colocar as peças de tecido em frascos de plástico pequena 2ml exalada e snap-congelar os frascos contendo o pedaço de tecido em nitrogênio líquido.</li>
		<li>Armazene os frascos contendo pedaços de tecido −80 ° C até o processamento adicional.</li>
		<li>Use um meio gelatinosa denominado temperatura de corte ideal (OCT) para montar a amostra de tecido em um mandril que congela até-20 ° C a-25 ° C, rapidamente, para que a água não pode formar cristais.</li>
		<li>Use um criostato para corte e primeira guarnição do bloco para o nível desejado (idealmente de metade da largura de uma microscopia de vidro slide, por exemplo, 5 x 5 mm).</li>
		<li>Após o corte, use pincéis e uma placa anti-roll para impedir que as seções de ondulação para cima.</li>
		<li>Cortar amostras de tecido em seções de 6-10 µm de espessura em uma velocidade lenta mas constante (1 s por seção). Quando uma seção corretamente é cortada, permanece plana na faca micrótomo sob a placa anti-roll.</li>
		<li>Pegue 1-3 seções sobre lâminas de vidro microscópica e armazenar −80 ° C até o uso. O número de seções preparadas depende do tamanho da amostra de tecido e a espessura desejada das seções.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a enzima Histo/Citoquímica para desidrogenases solúveis
<ol><li>Preparar o amortecedor da reação.<ol>
<li>Preparar 100 mL de tampão fosfato do pH correto (ver tabela 1; cada enzima tem um pH ideal em que sua atividade é a mais alta). Por exemplo, misture soluções de 0,1 M KH2PO4 (ácido) e 0,1 M NA2HPO4 (básico) até que seja feita uma reserva com o pH correto.</li>
		<li>18 g de álcool polivinílico (PVA) pese o tampão fosfato sob uma coifa como PVA é empoeirada e tóxicos.<ol>
<li>Dissolver a 18% w/v PVA no tampão fosfato a 100 ° C pelo aquecimento do buffer au bain marie (Coloque a garrafa de vidro em água fervente) e mexendo até o PVA é completamente dissolvido. A solução será então, transparente com pequenas bolhas causadas pela agitação. Normalmente requer ~ 15 min para o PVA dissolver. Nota: A 18% w/v PVA em tampão fosfato é viscoso e podem ser transferido aos tubos de tampão de reação 15ml usando uma pipeta de largura. Armazenamento de curto prazo de 18% p/v PVA em tampão fosfato deve ocorrer no armazenamento a longo prazo (até 2 semanas) e ≥ 40 ° C em ≥ 60 ° C. 250 µ l de 18% p/v PVA em tampão fosfato é normalmente necessário para uma preparação de cytospin, enquanto 500 µ l é necessário para uma secção de tecido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare a solução de sal (nitroBT) de tetrazólio. Para cada 1 mL de meio de incubação, 40 µ l de solução de nitroBT é necessário, que consiste de 5 mg de nitroBT (um pó amarelo) dissolvido em uma mistura de 20 µ l dimetilformamida (DMF) e 20 µ l de etanol, que será uma solução transparente amarela clara. Nota: Porque a estabilidade do nitroBT é menor do que todos os reagentes necessários, é aconselhável preparar a solução de estoque nitroBT última e dissolver o nitroBT no meio de reação primeiro.<ol>
<li>Dissolver nitroBT em DMF e etanol aquecendo-o em um frasco de vidro durante um curto período de tempo (~ 10 s) usando um bico de Bunsen. Agitar o frasco durante o aquecimento e não deixe o frasco muito tempo na chama para evitar a evaporação.</li>
			<li>Faça 10% solução nitroBT extra para permitir a evaporação da DMF e etanol durante o processo de dissolução.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Escudo do elétron transportadoras Fenazina methosulfate (PMS) ou (1-metoxi)-mídia de methosulfate (mPMS) e incubação de Fenazina contendo m(PMS) de luz direta envolvendo papel alumínio ao redor do frasco de armazenamento de vidro.</li>
		<li>Preparar soluções reagentes de acordo com a tabela 1 , dissolvendo-os em água destilada H2O. Alguns reagentes perecer rapidamente, então, prepará-los tão pouco antes a experiência possível. Manter soluções reagente no gelo ou a 4 ° C até o uso.</li>
		<li>Preparar a mídia de incubação, conforme mostrado na tabela 1 e homogeneizar a solução depois de cada passo por agitação suave. Evite a geração de bolhas de ar no meio de incubação agitando continuamente e mantendo a espátula abaixo da superfície do meio de incubação, agitando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicação de meio de incubação para cortes de tecido<ol>
<li>Microscopia de pre-quente desliza com cytospins ou cortes histologicos anexados a 37 ° C em uma câmara de incubação de imuno-histoquímica de 15 min. Mergulhe a parte inferior da câmara de incubação de imuno-histoquímica com água morna para manter uma temperatura constante na incubadora.</li>
		<li>Cuidadosamente, quebre ou serrar pipetas Pasteur na transição do estreito para a parte mais larga. Pipetas de Pasteur regulares são demasiado estreitas para aspirar o meio de incubação viscoso, assim que este passo é necessário tornar Pasteur pipetas larga o suficiente para a aspiração do meio de incubação.</li>
		<li>Aplica 250-500 µ l do meio de incubação adequado a cada preparação da pilha ou a seção de tecido em lâminas de microscopia usando a parte mais larga de uma pipeta Pasteur.</li>
		<li>Use a ponta da pipeta para distribuída homogeneamente com o meio de incubação. Desconsidere as bolhas de ar pequeno no meio de incubação, porque estas flutuam à superfície e não irão interferir com a reação enzimática na seção preparação ou tecido celular do slide de microscopia.</li>
		<li>Incubar as preparações da pilha ou seções de tecido sobre as lâminas de microscopia em uma incubadora de 37 ° C (por exemplo, uma incubadora de cultura de tecido) para uma duração predeterminada, dependendo da cinética enzimática e sua expressão em preparação uma célula específica ou tecido (tabela 1). Manter a tampa da câmara de incubação de imuno-histoquímica fechada para manter um ambiente húmido para evitar que o amortecedor da reação da secagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar as lâminas de microscopia<ol>
<li>Toque fora meio de incubação em excesso em um lenço.</li>
		<li>Mecanicamente, enxague no meio de incubação, pelas lâminas de microscopia em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3, movendo as lâminas de microscopia, subindo e descendo no buffer. Isso interrompe a reação enzimática.</li>
		<li>Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3 por 20 min.</li>
		<li>Mecanicamente, lave as lâminas de microscopia na água da torneira de 60 ° C.</li>
		<li>Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em água de torneira de 60 ° C por 20 min.</li>
		<li>Deixe a água e slides arrefecer lentamente misturando temperatura água da torneira com água da torneira de 60 ° C ao longo de 1 minuto.</li>
		<li>Execute uma etapa de lavagem mecânica final na água da temperatura de água destilada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o Cytospins manchado ou cortes de tecido em lâminas de microscopia<ol>
<li>Pré-aquecer um slide mais quente em 50-60 ° C.</li>
		<li>Cuidadosamente, secar o lado posterior das lâminas de microscopia usando uma toalha de papel e colocá-los no slide mais quente para secar o lado superior do slide microscopia.</li>
		<li>Quando os slides estiverem secos, coloque preparações da pilha ou cortes de tecido em lâminas de microscopia utilizando as lamelas e o meio de montagem de geleia de glicerol.</li>
		<li>Salvar as preparações da pilha ou lâminas de microscopia de secções de tecido no escuro em um refrigerador a 4 ° C ou proceder imediatamente com a aquisição de imagens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aquisição de imagem
<ol><li>Ganho de gravar imagens com uma câmera de CCD monocromática científica com faixa dinâmica suficiente (pelo menos 8 bits, mas de preferência 10- ou 12 bits), fixadas e uma resposta linear.</li>
	<li>Selecione um objetivo adequado (20 X de X-63 para cytospins) e 10-63 X para cortes de tecido.</li>
	<li>Reduza o brilho estreitando o diafragma de campo para que seja um pouco maior que o campo de visão.</li>
	<li>Uso de luz monocromática, aplicando um filtro de inferência de ampla bandpass nm 10 perto do comprimento de onda isobestic do formazan precipitado7 em combinação com um bloqueio de infravermelho filtro (ver Tabela de materiais). Nota: A absorvância máxima isobestic de nitroBT é em 585 nm.</li>
	<li>Otimizar a iluminação para garantir que toda a cinza nível gama da câmera é usada (ou seja, definir o nível de iluminação para que a iluminação máxima é alcançada sem excesso de exposição durante a gravação de uma lâmina de microscópio em branco).</li>
	<li>Calibre os valores medidos níveis de cinza de absorvância conhecida (ou densidade óptica [OD]). Para este fim, captura imagens de escala de cinza pelo menos 10 etapas diferentes de um slide de calibração ou passo tablet com valores conhecidos de OD (consulte a etapa 4.1.1), ambos comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou medir um tablet de passo Cunha escala de cinzentos feitos sob medida por um densitophotometer e utilização dos resultados para calibrar medidos cinzenta valores para os valores de absorvância conhecido.</li>
	<li>Captura de fotomicrografias de células ou cortes de tecido de interesse.</li>
</ol>4. análise de imagens
<ol><li>Antes da análise de imagem, calibre o software ImageJ para medições de absorvância.<ol>
<li>Medir a absorvância (OD) de fotomicrografias de pelo menos 10 áreas de calibração com parâmetros conhecidos absorvância no tablet de slide ou etapa de calibração com valores conhecidos de OD. No ImageJ, use Analyze → medida menu ou tecla de atalho Ctrl + M para medir uma área selecionada.</li>
		<li>Iniciar o procedimento de calibração de absorvância por vai analisar → calibração. Escolha a função "Rodbard (NIH Image)". Na coluna da esquerda da janela que se abre, os resultados de medições de nível cinzas de cada passo do tablet slide/passo da calibração realizada em 4.1.1 já estão presentes. Se não, copiá-los a partir da tela de resultados do ImageJ. Na coluna à direita, insira cada correspondente valor de absorvância conhecido como impresso sobre o certificado que você recebeu com o tablet passo calibrado. Marque as caixas "calibração Global" e "Trama do Show" e pressione "Okey".</li>
		<li>Para controle de qualidade, certificar-se de que o R2 da função Rodbard é > 0,99. Se for < 0,99, verifique se os slides de calibração foram fotografados e medidos corretamente e se os parâmetros de absorvância conhecidos foram inseridos corretamente.</li>
		<li>ImageJ agora é calibrado até você fechar o programa (daí "Calibração Global"). Para as medidas de absorbância, uma sessão de ImageJ calibrada sempre converte que a absorbância observada significa para valores entre 0 e 1, onde 0 e 1 são as assíntotas de zero e completo absorvância, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cytospins, selecione > 100 células únicas de forma aleatória. Para cortes de tecido, selecione um ou mais campos de interesse de um comprimento fixo e largura em todas as seções.<ol>
<li>Projeto uma varredura sobre as fotomicrografias para auxiliar em seleções de célula imparcial. No ImageJ, projetar uma grade sobre uma imagem através do menu Plugins → Analyze → grade.</li>
		<li>No ImageJ, use a ferramenta elíptica para selecionar células únicas e use a ferramenta retângulo para selecionar regiões de tecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a absorvância e a área das regiões de tecido ou células selecionadas. A densidade óptica e área são chamados de "Quer dizer" e "Área" no ImageJ resultados da planilha, respectivamente. Nota: A absorvância total de uma região de célula ou tecido (se você tiver selecionado várias regiões de tecido com tamanhos diferentes) é igual à soma de todas as absorvâncias pixel separadas. Se uma célula é fotografada por 1000 pixels, então a absorção total é dada pela soma das absorvâncias 1000 e a absorvância média é dada pelo total de absorvância/1000. Esse procedimento também evita erro distributivos.</li>
	<li>Determinar a absorbância total média de > 30 células ou regiões de tecido da lâmina de controle, que contém uma amostra que foi exposta para controlar meio de incubação na ausência de substrato mas na presença de cofactores. Absorvância este controle é usado para controle para coloração de atividade de enzima inespecífica e artefatos de absorvância induzida pelas lâminas de microscopia usadas, médio, lamínula ou microscópio de montagem.</li>
	<li>Subtrai a absorvância média do controle de todas as medidas de absorbância total de amostras que foram expostas ao meio de incubação com a mesma concentração de cofator (mas diferentes concentrações de substrato e/ou inibidor). Isto dá a absorvância total corrigida de uma região da célula ou tecido.</li>
	<li>Estatisticamente, compare as absorvâncias de totais médias corrigidas usando teste T de Student ou teste de ANOVA One-Way, dependendo do seu projeto experimental.</li>
	<li>Formazan absorbância pode ser convertida em atividade de enzima (substrato µmol convertido por mL / min) usando a lei de Lambert-Beer: c=A/(є×d), onde c é a concentração de formazan no meio de reação, A é a absorvância medida no ImageJ após calibração; Є é o coeficiente de extinção do formazan (16.000 em 585 nm)8 e d é a luz viajando a distância, que é igual à célula média espessura ou a espessura de corte de seção nominal (6-10 µm neste protocolo). Nota: Após a secagem, a espessura de corte de tecido diminui ~ 50% da espessura do corte da seção nominal, mas isso não se reflete no cálculo acima, porque a espessura nominal de corte é biologicamente mais relevantes. A célula média espessura e dimensões da esfera de célula preparados aderiram a lâminas de vidro de microscopia podem ser determinadas usando microscopia confocal ou microscopia de campo amplo, para os quais protocolos podem ser encontrados em outros lugares. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Pesquisa sobre o metabolismo celular está experimentando atualmente um renascimento porque pesquisadores percebem agora que os efeitos metabólicos são cruciais para a patogênese e o tratamento de muitas doenças. 1 além disso, a pesquisa metabólica é auxiliado por um crescente disponibilidade de técnicas que fornecem este campo de pesquisa com ferramentas mais do que nunca, incluindo a espectrometria de massa, marcação de rotulagem e espectrometria de ressonância magnética nuclear. Mapeamento metabólico não é uma técnica nova, mas sua capacidade de dar informação integrada sobre a atividade de enzimas em uma situação de quase verdadeiro-à-natureza faz com que esta técnica mais relevante do que nunca. 2
Os cofatores NAD+ e NADP+ são encontrados em todas as células vivas, o que indica que a desidrogenases surgiram muito cedo durante a evolução e tem papéis-chave no metabolismo celular. 14 , 15 -atualmente, existem 523 reações catalisadas por enzimas que são classificadas como desidrogenases e ocorrerem através de todas as espécies. 16 teoricamente, a atividade de todas as reacções diferentes desidrogenase pode ser separadamente investigada pelos ajustes do protocolo de mapeamento metabólico descrito aqui. Cada reação enzimática é exclusiva por meio do substrato e co-fatores que são necessários para a sua actividade. Portanto, a atividade de cada reação enzimática pode ser determinada usando um experimento de mapeamento metabólica com o substrato adequado e cofactores no meio de reação. No entanto, algumas isoformas da enzima diferem na sua localização subcellular, por exemplo, uma isoforma catalisa uma reação no citoplasma, Considerando que outra isoforma funções nas mitocôndrias. Um exemplo notável é IDH1 e IDH2, dos quais o primeiro é citoplasmático e o último é mitocondrial e que são duas diferentes proteínas codificadas por dois genes diferentes. 11 1-metoxi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoxi-PMS) e 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) podem ser usados como carreadoras de elétrons para estes experimentos. O ex não passa as membranas mitocondriais, este faz. Portanto, investigações sobre enzimas mitocondriais (por exemplo, IDH2) devem usar PMS Considerando que investigações sobre citosólica enzimas (por exemplo, IDH1) devem usar mPMS.
Tal como acontece com muitas técnicas, variações do presente protocolo, como o uso de diferentes tipos de sais de tetrazólio, excluindo a adição de PMS e azida de sódio, usando um meio de montagem aquoso e variando de incubação e lavagem vezes, existe e pode funcionar igualmente bem. O aplicativo de mapeamento metabólico com sais de tetrazólio não está limitado a desidrogenases. Com pequenas modificações no protocolo, pode também ser usada para a avaliação da atividade das enzimas que funcionam diretamente a montante de uma desidrogenase em uma via metabólica. Descrevemos anteriormente este princípio para a enzima glutaminase,17 , que funciona diretamente a montante da glutamato desidrogenase na via glutaminolysis. 18 em teoria, o mesmo princípio pode ser aplicado a outras enzimas que ciclo de função diretamente a jusante ou montante de uma desidrogenase por exemplo aconitase, que se encontra diretamente a montante do IDH2 e IDH3 no ácido tricarboxílico (TCA). Outra variação simples das concentrações descritas na tabela 1 é por meio de frascos médio de incubação com várias concentrações de substrato, cofator e/ou inibidor. Isto permite a geração de curvas dose-atividade em função da concentração de substrato, cofator e/ou inibição.
Tecnicamente falando, metabólica experimentos de mapeamento não facilitar observações imparciais da atividade da enzima em situ , porque os pesquisadores têm de escolher uma concentração de substrato e cofator que pode não refletir os níveis de substrato e cofator que estão presentes em situ. Além disso, o uso de viscoso 18% PVA no meio de reação serve para manter macromoléculas intactas, no lugar e na conformação, mas proíbe a difusão efetiva de reagentes de baixos peso molecular através do meio de reação. 3 , 5 portanto, as atividades de determinada enzima nos experimentos descritos aqui que usam concentrações de substrato suprafisiológicas não refletem a situação no vivo em uma concentração de determinado substrato, mas são adequados para comparações intra experimentais. Assim, o resultado de experimentos de mapeamento metabólica é a capacidade de produção (atividade máxima) de uma reação enzimática no contexto dos níveis substrato e cofator que estão presentes em situ. Além disso, o uso de várias concentrações de substrato e/ou cofactores e amostras múltiplas permite comparação imparcial da capacidade de produção máxima (Vmax) e afinidade (Km) de uma enzima de um substrato/cofator em preparações da pilha , tecidos ou regiões do tecido. Esses parâmetros são o resultado da soma da expressão da proteína de enzima, modificações borne-translational e o efeito de um microambiente lotado na atividade de enzimas. Portanto, mapeamento metabólico é ainda uma melhor reflexão da atividade da enzima do que experimentos que determine a expressão da proteína ou purificada enzima atividade em vitro.

Um pilar essencial da fisiologia celular é o metabolismo. Metabolismo fornece as células com a energia necessária para todos os processos fisiológicos, fornece os blocos de construção para biossíntese macromolecular e regula a homeostase celular com respeito a produtos residuais, moléculas tóxicas e a desmontagem e reciclagem de componentes celulares desnecessários ou disfuncionais. As enzimas catalisam quase todas vitais celulares reações químicas e são, portanto, as unidades motoras na fisiologia das células. 1 , 2
A atividade das enzimas é fortemente regulamentada em muitos níveis e, portanto, quantitativa enzima histoquímica e Citoquímica (também chamado de mapeamento metabólico) é o método preferido para estudar a atividade de enzima em situ. A nível transcricional, expressão gênica no mRNA é regulada. O efeito do Regulamento da transcrição pode ser determinado usando ensaios quantitativos de mRNA, como Microarrays do sequenciamento de RNA direto ou ensaios de mRNA qualitativa, tais como a hibridização in situ , que dá informações sobre o celular (sub) Localização de moléculas de mRNA. Isto torna possível apreciar diferenças relativas em atividade transcricional entre as células. No entanto, a interpretação e validade destes ensaios de mRNA com relação a atividade metabólica é complicado porque o regulamento também ocorre no nível de mRNA, onde sequência e estabilidade das moléculas de mRNA são editados depois que é transcrito do DNA. Esta edição regula proteína isoform Tradução e quantidade de tradução de proteínas para os ribossomas. Além disso, o processo de tradução de proteínas é controlado e em última análise, afeta a atividade e, portanto, a expressão da enzima. Os efeitos combinados dos passos regulamentares acima mencionados podem ser apreciados utilizando ensaios de expressão quantitativa de proteína, como a mancha ocidental Microarrays do lisado de proteína de fase reversa ou ensaios de expressão qualitativa da proteína, tais como imunocitoquímica e imuno-histoquímica, mas essas técnicas não conseguem incorporar efeitos regulamentares a jusante como modificação pós-traducional de proteínas e o Regulamento funcional de enzimas no seu microambiente lotado. Além disso, a expressão de uma enzima mal pode correlacionar com sua atividade, para que as medições da atividade de uma enzima purificada em células ou tecidos homogenates ou em soluções diluídas são amplamente utilizadas para estudos de atividade enzimática. No entanto, estas experiências não replicar a influência de um citoplasma compartimentada lotada ou organela sobre a atividade de uma enzima. Além disso, determinar a quantidade ou a localização da expressão do mRNA ou enzima todas as técnicas acima mencionadas, mas são incapazes de dar uma informação completa sobre os dois desses aspectos da expressão da enzima, e muito menos a integração deste informações com determinações de atividade enzimática. 2 , 3 , 4
Mapeamento metabólico permite a apreciação de todas as variáveis acima mencionadas que determinam a atividade de uma enzima. Além disso, o mapeamento metabólico é uma forma de célula viva ou imagem de tecido com células e tecidos que são mantidos intactos durante a análise para gerar uma situação de quase verdadeiro-à-natureza para gerar dados de atividade de enzimas. Ela produz imagens que facilitam a apreciação ambos detalhada da localização da actividade enzimática, bem como robusta quantificação da atividade da enzima dentro de um compartimento da célula ou tecido. 3 , 4 os protocolos descritos aqui para metabólico mapeamento da atividade de desidrogenases são baseados sobre o manual de laboratório de todos os métodos histoquímicos de enzima disponível,5 nos princípios da histoquímica enzimática quantitativa,6 e na análise de imagens de mapeamento metabólico quantitativo. 4
Desidrogenases são enzimas que realizam as reações redox para reduzir canônicos cofactores como NAD+,+ de NADP e FAD a NADH, NADPH e DANIII2, respectivamente. Células intactas ou criostato cortes histologicos que não são quimicamente fixas são incubados em um meio de reação que contém, entre outros reagentes, o substrato e cofatores de uma desidrogenase específica e um sal de tetrazólio. Posteriormente, essa desidrogenase executa sua atividade catalítica e reduz, por exemplo,+ de NADP a NADPH. Através de uma transportadora de elétrons, 2 moléculas de NADPH em última análise, reduzem 1 molécula de sal de tetrazólio semi incolor solúvel em água em molécula 1 formazan de azul insolúvel em água que precipita-se imediatamente no site da desidrogenase. Portanto, a absorvância de formazan precipitado é uma medida direta da atividade local de uma desidrogenase e pode ser observada usando microscopia de luz ou quantificados utilizando análise de microscopia e imagem luz monocromática. O aspecto quantitativo do presente protocolo permite que pesquisadores desenhar conclusões estatísticas destes ensaios. Além disso, esta quantificação facilita a determinação em situ parâmetros de cinética enzimática, tais como a atividade máxima da enzima (Vmax) e a afinidade de um substrato para uma enzima (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Ao planejar um experimento de mapeamento metabólica, é importante perceber que, por experiência, um máximo de 50 lâminas de vidro com preparações da pilha aderente ou cortes de tecido são recomendados para minimizar os atrasos de tempo durante a incubação a fim de obter consistente resultados. É possível processar mais slides e/ou composições médias quando estes passos de protocolo são realizados cooperativamente por mais de um experimentador. Além disso, alguns variabilidade existente entre as experiências. Portanto, experiências idênticas devem ser repetidas pelo menos 3 vezes com cytospins de cada preparação de célula ou seções de cada amostra de tecido e controlos adequados devem ser incluídos em cada experimento. Prepare sempre um meio de incubação de controle na ausência de substrato mas na presença de cofatores para controle para coloração de atividade de enzima inespecífica. Os resultados mais representativos são obtidos em experimentos onde concentrações de substrato/cofator diferentes são aplicadas para cortes de tecido ou preparações da pilha da mesma amostra, para que o experimentador pode realizar análises do uso de cinética enzimática curvas dose-atividade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

Metabolismo celular alterado é uma marca registrada de muitas doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e infecções. As unidades motoras metabólicas das células são enzimas e sua atividade é fortemente regulamentada em muitos níveis, incluindo o transcriptional, estabilidade do mRNA, nível translacional, borne-translational e funcional. Este complexo Regulamento significa que convencionais ensaios quantitativos ou de imagem, tais como quantitativos mRNA experimentos, borrões ocidentais e imuno-histoquímica, produzem informações incompletas sobre a atividade final de enzimas, sua função e/ou sua localização subcellular. Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica (i.e., mapeamento metabólica) mostram informações detalhadas na atividade enzimática em situ e sua cinética, função e Localização subcellular numa situação quase verdadeiro-à-natureza.
Descreveremos um protocolo para detectar a atividade de desidrogenases, que são enzimas que realizam as reações redox para reduzir cofactores como NAD(P)+ e FAD. Secções de tecidos e células são incubadas em um meio que é específico para a atividade enzimática de uma desidrogenase. Posteriormente, a desidrogenase que é objecto de investigação executa sua atividade enzimática em seu site subcellular. Em uma reação química com o meio de reação, isso gera, em última análise formazan cor azul no local da atividade da desidrogenase. Absorvância da formazan é, portanto, uma medida direta da atividade da desidrogenase e pode ser quantificada usando análise de microscopia e imagem luz monocromática. O aspecto quantitativo do presente protocolo permite que pesquisadores desenhar conclusões estatísticas destes ensaios.
Além de estudos observacionais, esta técnica pode ser usada para estudos de inibição de enzimas específicas. Neste contexto, estudos beneficiar as vantagens da verdadeiro-à-natureza de mapeamento metabólica, dando resultados em situ que pode ser fisiologicamente mais relevante do que em vitro estudos de inibição enzimática. Ao todo, mapeamento metabólico é uma técnica indispensável para estudar o metabolismo a nível celular ou tecido. A técnica é fácil de adotar, fornece informações metabólicas em profundidade, abrangentes e integradas e permite rápida análise quantitativa.

Vários protocolos para preparar meio de incubação são mostrados para investigar a atividade de uma desidrogenase específica. Para cada desidrogenase, dissolver os reagentes listados na solução de PVA, mantendo uma temperatura de pelo menos 37 ° C. Os reagentes devem ser dissolvidos na ordem listada na tabela, ou seja, nitroBT sempre é dissolvido primeiro e (m) PMS sempre é dissolvido última. Cada 5 mg de nitroBT é dissolvido na mistura de 40 µ l (20 etanol µ l + 20 µ l dimetilformamida). Todos os volumes são por 1 mL de solução PVA 18%, que pode ser usada para manchar ~ 2 cortes histologicos ou preparações da pilha ~ 4 placas de vidro. NitroBT, NAD+, NADP+, soluções ADP e substrato devem ser feitas na hora. NaN3, MgCl2 e (m) PMS soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por um mês. 18% PVA dissolvido em fosfato de reserva pode ser armazenada a 60 ° C durante 2 semanas. O pH da solução de 18% PVA pode ser definido usando diferentes composições da dihidrogenofosfato de potássio 0,1 M (KH2PO4) e buffers de fosfato (NA2HPO4) de hidrogênio de dissódico 0,1 M. Os períodos de incubação mostrado fornecem bons pontos de partida, mas os períodos de incubação ideal dependem da espécie, o tipo de tecido e a preservação do tecido. Em geral, preparações da pilha devem ser incubadas em mais do que para obter um nível semelhante de produção formazan cortes histologicos.
Selvagem-tipo isocitrato desidrogenase 1 e 2 (IDH1/2) catalisar a conversão de isocitrato a α-cetoglutarato (αKG), com concomitante redução de+ de NADP a NADPH no citoplasma e mitocôndrias, respectivamente. Estas enzimas recentemente tem atraído interesse porque IDH1/2 mutações ocorrem em vários tipos de câncer humano, incluindo câncer cerebral primária (glioblastoma) e câncer colorretal e oferecem uma oportunidade única para demonstrar as possibilidades de mapeamento metabólico. Mutações IDH1 desativar IDH1 atividade de enzima do selvagem-tipo e também induzir uma atividade enzimática-neo que leva à produção e à acumulação subsequente do oncometabolite D-2-Hidroxiglutarato (D-2 HG),11 , que é discutido em outra parte em detalhe. 12 mapeamento metabólica experimentos mostraram que+de NADP-dependente IDH1/2 atividade foi significativamente menor em células de carcinoma colorretal com uma batido em heterozigotos IDH1 mutação do que em células de carcinoma colorrectal que foram IDH1 selvagem-tipo (figura 1A). Esta diferença foi quantificada por análise de imagem de fotomicrografias de luz monocromáticas (figura 1B). 12
Outro exemplo ilustrativo de experimentos de mapeamento metabólica é mostrado na Figura 2, que é uma imagem de uma seção do criostato do cérebro de rato que foi injetado com células de glioblastoma humano. IDH1/2 é o mais importante fornecedor de NADPH no cérebro humano e sua atividade é upregulated em selvagem-tipo IDH1/2 glioblastoma, considerando a capacidade de produção de NADPH de IDH1/2 é muito mais baixa no cérebro de roedores. 11 Figura 2A mostra a diferença entre o NADP alta+-dependente IDH1/2 atividade em células de glioblastoma humano e o NADP baixa+-dependente IDH1/2 atividade no cérebro de rato saudável. IDH1/2 atividade é quantificada como produção de NADPH µmol / mL de tecido por minuto na Figura 2B.
A reação enzimática da IDH1/2 é relativamente simples, mas o lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima mais complicada complexa. LDH converte a conversão reversível do lactato a piruvato, com concomitante redução do NAD+ para NADH ou vice-versa. A disponibilidade de lactato e piruvato e a composição da enzima LDH complexa dita se lactato é primeiramente convertido em piruvato (que é catalisado por LDH-B e produz NADH) ou se o piruvato é primeiramente convertido para lactato (que é catalisada por LDH-A e consome NADH). Experimentos de mapeamento metabólica 13 são capazes de visualizar a atividade da reação LDH-B, mas eles são "cegos" para a atividade da LDH-A reação, porque não ocorre produção de NADH e consequentemente nitroBT não é reduzido a formazan. A Figura 3 mostra o NAD+-dependente atividade LDH (ou seja, a conversão de lactato em piruvato) no cérebro humano seções na ausência de substrato (Figura 3A), na presença de alta concentração de lactato (Figura 3B ), na presença de lactato de 6 mM (Figura 3) e na presença de uma baixa concentração de lactato e uma maior concentração de piruvato (Figura 3D). Os resultados dessas experiências ilustram metabólica mapeamento adequadamente que capta o NAD+-dependente atividade LDH em seções do tecido depende da disponibilidade de lactato e piruvato no meio de reação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
Figura 1 . +De NADP-dependente IDH1/2 atividade de células de carcinoma colorectal humana. (A) representante monocromático luz fotomicrografias de células de carcinoma colorectal humana HCT116 depois da coloração para NADP+-dependente atividade IDH1/2 contra 1-10mm NADP isocitrato e 0,8 mM+. Barras de escala = 50 µm. (B) uma quantificação da absorvância do formazan azul produzida a partir de nitroBT por+de NADP-dependente IDH1/2 atividade por célula é mostrado com o uso de luz monocromática em (A) e análise de imagem. Abreviaturas: IDH1WT/WT, isocitrato desidrogenase 1 selvagem-tipo; IDH1WT/MUT, isocitrato desidrogenase 1 mutado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
Figura 2 . +De NADP-dependente IDH1/2 atividade de amostras de glioblastoma humano. (A) representante fotomicrografia de uma seção de cérebro de rato que contém o cérebro de rato saudável (h) e um transplante de tumor glioblastoma humano (t) depois da coloração para NADP+-dependente IDH1/2 atividade na presença de 0.8 NADP mM+ e 2mm isocitrato. Barra de escala = 200 µm (B) quantificação de atividade de enzima das áreas do cérebro de rato (h) e glioblastoma humano xenoenxertos (t) mostrada em (A) usando a lei de Lambert-Beer. Barras de erro representam desvios-padrão. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
Figura 3 . NAD+-dependente lactato desidrogenase (LDH) atividade de amostras de cérebro humano. Representante fotomicrografias das seções seriais de amostras de cérebro humano depois da coloração para NAD+-atividade LDH dependente (A) contra condições de controle (no substrato de ausência e piruvato, 3mm NAD+ somente) (B) contra 150 mM lactato na ausência de piruvato (C) contra 6 mM lactato na ausência de piruvato e (D) contra lactato de 6 mM na presença de piruvato de 18mm, inibidor da reação de lactato para piruvato-produto competitivo. Barra de escala = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzima:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>LDH</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA 18% em tampão fosfato de 100mm</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL;  pH = 7,4</td>
			<td>1 mL;  pH = 8.0</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 8.0</td>
			<td>1 mL; pH = 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NitroBT</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
			<td>mistura de 5 mg/40 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NaN3 </td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM MgCl2</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 mM NADP</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2mm ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>substrato</td>
			<td>10 mM de glicose-6-fosfato</td>
			<td>lactato de 150 mM</td>
			<td>succinato de 50mm</td>
			<td>ácido málico 100mm</td>
			<td>isocitrato 2mm</td>
			<td>isocitrato 2mm</td>
			<td>isocitrato 2mm</td>
			<td>10 mM 6-fosfo-galactonate</td>
			<td>ácido glutâmico de 10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>mPMS 0,32 mM</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PMS de 0.2 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>10 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Duração da incubação</td>
			<td>5 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>60 min</td>
			<td>60 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>10 min</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
</tbody></table>
Tabela 1. Visão esquemática do protocolo de mapeamento metabólica por desidrogenases. Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; (m) PMS (metoxi) -5-metil sulfato de methylphenazinium; nitroBT, cloreto de tetrazólio azul de nitro; G6PDH, glicose-6-fosfato desidrogenase; LDH, lactato desidrogenase; SDH, Succinato desidrogenase; MDH, malato desidrogenase; IDH, isocitrato desidrogenase; 6PGD, 6-phosphogluconate desidrogenase; GDH, glutamato desidrogenase.

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Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Aqui, apresentamos um protocolo que pode ser usado para microscopicamente Visualizar e quantificar a atividade de desidrogenases em células e tecidos e sua cinética, função e Localização subcellular.

Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K visualizações.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. Aqui, apresentamos um protocolo que pode ser usado para microscopicamente Visualizar e quantificar a atividade de desidrogenases em células e tecidos e sua cinética, função e Localização subcellular.

Vídeo: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...