Conselho dinamarquês de pesquisa independente, tecnologia e produção, conceder #4005-00029

A instalação experimental não tem nenhuma restrição ética e legal e foi conduzida de acordo com a Universidade de Roskilde. Uma visão geral sobre a montagem experimental pode ser vista na Figura 1 e os mecanismos da câmara óptica na Figura 2.
1. preparação
<ol><li>Execute todas as etapas em um banco do fluxo laminar esterilizado por limpar a bancada e todos os equipamentos com etanol a 70% antes do início do experimento.</li>
	<li>Coloque a câmara óptica numa incubadora convencional a 37 ° C com 5% de CO2 para garantir condições ideais para as células.</li>
	<li>Desenvolvem-se células HaCaT na mídia DMEM com 10% FBS e 1 x antibióticos (penicilina e estreptomicina) num balão T75.</li>
	<li>Use tripsina de 1 x 1 mL para separar as células e sub, cultivá-las a cada 3-4 dias, por isso dispersar sobre a camada celular. Pré-aqueça a temperatura ambiente antes do uso.</li>
</ol>2. gerar uma monocamada de HaCaT células em uma placa de microtitulação de 48-poços
<ol><li>Remova o meio do balão T75 com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lave as células aderentes no frasco, adicionando 5 mL 1X PBS estéril para o balão de T75. Nota: Certifique-se de que o PBS é livre de cálcio e magnésio.</li>
	<li>Circule a PBS e removê-lo com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Repita a etapa 2.2-2.3.</li>
	<li>Adicionar tripsina de 1 x 1 mL no balão e dispersá-la em toda a camada de células.</li>
	<li>Incubar o frasco a 37 ° C numa incubadora convencional até que as células são desanexadas (5-8 min é suficiente para a maioria das linhas de células).</li>
	<li>Ver no microscópio se as células são desanexadas. Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 9 mL dos meios de cultura regular com 10% FBS para inactivar a tripsina 1 x.</li>
	<li>Contar a célula com qualquer um hemocytometer, um contador de coulter ou similar. Nota: Trypan azul pode ser usado para exibir as células mortas. No entanto, em tripsina 1 x HaCaT células são perfeitamente redonda quando vivo.</li>
	<li>Transferi 7,5 x 104 células/poço em 250 µ l 10% FBS meios de comunicação social para uma cultura de tecidos de 48-poço redondo placa (padrão). Nota: ensaio também pode ser configurado em 6, 12, 24-ou placas de 96 poços, que tudo podem ser analisadas ao microscópio óptico.</li>
	<li>Mover suavemente a placa de lado para lado para garantir que as células estão igualmente distribuídas em poços, ou as células irão se reunir no centro de poços. Inspecionar sob um microscópio de luz para certificar-se de que a célula é espalhada uniformemente na mídia</li>
	<li>Colocar a placa numa incubadora convencional CO2 a 37 ° C durante a noite ou até que as células tenham aderido ao fundo dos poços.</li>
</ol>3. adição de estímulos para efeitos de migração
<ol><li>Verifique se os poços estão confluente de 90-95% sob um microscópio de luz.</li>
	<li>Prepare-se 10 µ g/mL de mitomicina C em uma quantidade apropriada de médio porte. Nota: Neste estudo, mitomicina C é mantido a 4 ° C em uma solução de 1 mg/ml. Mitomicina C em solução pode ser armazenada até uma semana no escuro a 2-8 ° C.</li>
	<li>Remova a mídia passou com uma pipeta Pasteur de cada poço.</li>
	<li>Adicione 250 µ l de 5 µ g/mL de mitomicina C para cada poço.</li>
	<li>Incube a placa por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Prepare-se estímulos de peptídeos diluindo-os em uma quantidade apropriada de médio porte. Nota: Neste estudo, tanto a humana e bovina lactoferrina e Lactoferricin foram testados em 25 µ g/mL em um volume de 250 µ l</li>
	<li>Remova o meio com mitomicina C com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lave os poços 1x com 250 ml de 1X PBS (temperatura ambiente) e remover a lavagem com uma Pasteur pipeta.</li>
	<li>Adicionar 250 µ l de 1X PBS e riscar manualmente os poços verticalmente com a ponta da pipeta 200 µ l. Use uma ponta de pipeta nova para cada poço.</li>
	<li>Remova a PBS e adicione 250 estímulos de peptídeo µ l.</li>
	<li>Monte a placa no sistema óptico da câmera, ajustando os parafusos em ambos os lados da placa. Deixe a tampa da placa de microtitulação. Nota: A câmera pode operar com a tampa aberta, se necessário.</li>
</ol>4. configurar o programa para a câmara óptica no computador
<ol><li>Clique em Acquire na barra de tarefas à esquerda.</li>
	<li>Escolha a função de cicatrização de feridas na barra de tarefas à esquerda.</li>
	<li>Escolha o tipo de placa clicando abaixo a ilustração da placa.</li>
	<li>Cancelar a seleção de poços, não estiver em uso, marcando-os e clique em habilitar no lado superior esquerdo na tela. Nota: Todos os poços são selecionados por padrão.</li>
	<li>Ajuste o foco da lente em poços para ajustar a posição das células clicando em um dos poços. Nota: Autofocus também pode ser ajustado manualmente, movendo a barra à direita da ilustração a placa.</li>
	<li>Definir o período de tempo para imagens em Intervalo de imagens (por exemplo, (00:30:00)).</li>
	<li>Defina o número de repetições para caber o período desejado (por exemplo, 97 repetições).</li>
	<li>Começa a correr, clicando no botão Iniciar no canto inferior direito.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. 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R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. 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Os autores não têm nada para divulgar.

A importância da migração em estudos de desenvolvimento, cicatrização de feridas, imunologia e câncer levou a diversos métodos para estudar a migração. Migração pode ser uma expressão da expansão ou o fechamento da lacuna pelas células. Mais frequentemente o encerramento da Risque é testado, como é mais fácil cultivar células em um monolayer e então fazer um arranhão do que o crescimento das células em uma forma específica de8. Nosso estudo demonstra um método otimizado para...

A migração é um processo importante que influencia diversos aspectos fisiológicos. Na cicatrização de feridas, migração facilita a fase de re-epitelização da pele. Em feridas não-cura, tais como feridas crônicas, bactérias oportunistas causar infecção da ferida, e feridas abertas são ideais para o crescimento de bactérias e formação de biofilme1,2. Biofilme é uma das causas do desenvolvimento de bactérias resistentes, que é uma das maiores ameaças à nossa sociedade moderna3. Na cicatrização de feridas, as células do sistema imunológico não consegue penetrar o biofilme. Em câncer, migração de células cancerosas é um passo crucial de metástase, que é a principal causa de morte para pacientes com tumores sólidos4,5. Portanto, é crucial poder estudar a migração.
O ensaio de zero é frequentemente usado para testar a migração celular, porque é barato e fácil de realizar em linhas de células aderentes, tais como fibroblasto, endotelial e a célula epitelial linhas6,7. Hoje, existem vários métodos para executar arranhões8, e materiais diferentes foram relatados para ser usado, incluindo célula raspadores10palitos9, lasers11e correntes elétricas12. Todos os métodos têm diferentes prós e contras, e o método deve ser decidido de acordo com a ferramenta de tipo, orçamento e análise de célula. Por exemplo, se o tipo de célula usada necessita de revestimento, remoção de pressão manual, por exemplo, com uma ponta de palito de dente ou pipeta, influenciará a migração dentro da área, deve ser usado um método diferente. Neste estudo, focaremos na raspagem manual.
Uma desvantagem para raspagem manual é a variação do tamanho, as formas dos arranhões e acúmulo de células nas bordas da risque. Existem muitos protocolos, e um papel altamente citados aconselha aumentou a velocidade e/ou lavagem completa após coçar13. Além disso, vários métodos têm sido utilizados para minimizar a proliferação, uma vez que a proliferação das células não pode ser distinguida da migração e, portanto, pode dar resultados falso-positivos da migração. Alguns relataram métodos são fome soro precede o zero14 e diminuindo a quantidade de soro15. No entanto, nenhum desses métodos pode garantir que não há nenhuma proliferação. Portanto, nós relatamos um pré-tratamento das células com mitomicina C para garantir resultados verdadeiros da migração. Mitomicina C é um antibiótico que inibe a síntese de DNA, formando uma ligação covalente com o DNA, o que impede o DNA de separar16. Pré-tratamento com mitomicina C e lavagem com PBS antes de coçar, detectado encerramento do gap demonstra a verdadeira migração das células (Figura 1).
Uma característica de todos os métodos é a necessidade de um sistema analisar o processo de migração17. Um método de baixo custo para analisar o progresso e um comum é usar um microscópio de luz-campo para tirar fotos da risque em pontos de tempo pré-determinado, seguidos por uma análise do fechamento de gap em um software de imagem18,19. Este método é demorado, não confiável com relação ao tirar fotos no mesmo lugar e foco, e o movimento da incubadora para câmera forças ciclos de mudanças de temperatura enquanto fotos são tiradas. Outros métodos têm sido desenvolvidos para detectar a migração medindo o fluxo de corrente. As alterações atuais, como células cobrem mais espaço na placa, que é lido como um aumento da impedância de20. Medindo a impedância, o ambiente das células não é afectado, e o método, portanto, é considerado não-invasiva. Este método baseia-se em placas especializadas com eletrodos de ouro, que são caros, mas eles permitem a detecção de muitos processos, tais como adesão celular, proliferação, migração e morte celular. Uma grande desvantagem deste método é que a medição de impedância não indica diretamente a migração, como fatores tais como temperatura têm um grande impacto sobre a impedância. Alterações na impedância podem ser causadas por vários fatores que não são revisados pelo software, dificultando a análise dos dados. Portanto, a falta de visualização exige um microscópio de luz convencional para verificar a migração.
Para superar muitas das desvantagens das técnicas disponíveis, nós usamos uma câmera óptica automatizada em tempo real. A câmara óptica é um sistema de detecção com um microscópio de alta produtividade em uma pequena plataforma com uma lente, unidade de iluminação e uma câmera digital. Tem um built-in software, que pode testar a migração e proliferação entre outras coisas. Para detectar a migração, dois algoritmos são usados para analisar o crescimento e a cinética de migração das células, que são chamados a proliferação e a ferida que cura a análise, respectivamente. A análise de proliferação é baseado em um algoritmo de segmentação de imagens de duas etapas que se aplica a análise de textura para detectar a diferença entre as áreas cobertas de célula (mostrado em amarelo) e vazio fundo áreas por análise de histograma avançado. A análise de cicatrização de feridas é baseada em um algoritmo de três etapas que detecta a monocamada de células, localiza a abertura da ferida e determina a largura do fosso. Estas etapas são realizadas nos pontos de tempo determinados pelo usuário, e os dados são apresentados como coberta, largura do fosso e área de abertura. Uma das grandes vantagens desta máquina é que ele permite que imagens de células aderentes através de líquido por causa do ângulo da câmera21. As lenstakes inclinado que imagens são projetadas para uma pilha de um único plano z z geram para garantir que as fotos estão em foco (Figura 2). z-pilhas são geradas pela fusão da série de fotos (por exemplo, 40) perpendiculares à borda da ferida e através da ferida toda. Os z-pilhas permite capturar da profundidade da camada de células, bem como de um avião em foco através da ferida. Além disso, a série de imagens pode ser colocada juntos para uma coleção de vídeo das imagens, com o clique de um botão.
Vamos demonstrar um protocolo otimizado para a deteção de migração em linhagem celular de queratinócitos HaCaT. Nós testamos a lactoferrina e seu peptídeo N-terminal, Lactoferricin, com os humanos e as vacas, para analisar o seu efeito sobre a migração como estas moléculas têm demonstradas ter numerosas aplicações como antimicrobiano e imunológico, modulando as moléculas22 , 23. os quatro compostos foram comparados às células não tratadas de HaCaT e fator de crescimento epidérmico (EGF) foi usado como controle positivo.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optical camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&amp;nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cell</td><td></td><td></td><td>Donated from Bispebjerg Hospital</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium for HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Without Mg+ and Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Trypsin (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibits proliferation</td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&amp;deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&amp;uuml;rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Migração celular é um processo importante que influencia muitos aspectos da saúde, tais como a cicatrização de feridas e câncer, e é, portanto, crucial para o desenvolvimento de métodos para estudar a migração. O ensaio de risco tem sido o método mais comum em vitro testar compostos com propriedades anti e pro migration por causa de seu baixo custo e simples procedimento. No entanto, um problema frequentemente relatados do ensaio é o acúmulo de células através da borda da risque. Além disso, para obter dados de ensaio, imagens de diferentes exposições devem ser tomadas durante um período de tempo no mesmo lugar para comparar os movimentos de migração. Análise de diferentes programas pode ser usado para descrever o fechamento zero, mas eles são mão de obra intensiva, impreciso e forças ciclos de mudanças de temperatura. Neste estudo, vamos demonstrar um método otimizado para testar o efeito de migração, por exemplo, com as proteínas naturais, humanos e bovinos-lactoferrina e seu peptídeo N-terminal Lactoferricin na linha de células epiteliais HaCaT. Uma otimização de crucial é lavar e arranhar em PBS, que elimina o referido acúmulo de células ao longo da borda. Isso pode ser explicado pela remoção de cátions, que foram mostrados para ter um efeito sobre a conexão do celular de queratinócitos. Para garantir a verdadeira detecção de migração, pré-tratamento com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA, foi adicionada ao protocolo. Finalmente, vamos demonstrar a automatizado óptica câmera, que elimina os ciclos de temperatura excessiva, trabalho manual com análise de risco de encerramento, enquanto melhora na reprodutibilidade e garantir a análise de seções idênticas da risque ao longo do tempo.

HaCaT é uma linha de celular de queratinócitos, um dos tipos de célula mais abundantes na pele. Quando um ferimento ocorre, as células de pele começam a proliferar e migrar para o leito da ferida para fechar a ferida (Figura 3). Ambos os processos são, portanto, de extrema importância para a cura adequada.
A câmara óptica pode acompanhar os dois processos em tempo real. Para a migração, o...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

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Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K visualizações.  Roskilde University. Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Vídeo: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Pesquisa do câncer

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Biologia do Desenvolvimento

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Ambiente

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicina

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biologia

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Elucidando a cinética das células T: métodos para análise de migração em tempo real

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Autor em destaque: Compreendendo os mecanismos da doença por meio da análise em tempo real da migração de células T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

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Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias