Gostaríamos de agradecer o Professor Anders Jeppsson ajuda com o fornecimento de vasos sanguíneos utilizados nos experimentos. Este estudo foi financiado pela subvenção LUA ALF a SSH.

O tecido usado, e o protocolo deste trabalho segue as diretrizes éticas da Universidade de Gotemburgo.
1. tecido preparação e armazenamento
<ol><li>Corte o tecido circundante da veia safena obtida usando uma tesoura e pinça cirúrgica. Nota: A veia safena é dissecada do membro inferior dos humanos por cirurgiões vasculares. A veia safena utilizada neste trabalho é uma parte não utilizada após a cirurgia de bypass.</li>
	<li>Para evitar vazamentos durante a perfusão, ligate todos os ramos de lado em suas extremidades com suturas e fórceps.</li>
	<li>Manter a veia em um tubo de 50 mL contendo 40 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS). Lave a veia alterando PBS 2 - 3 vezes para remover o excesso de sangue. Armazenar a veia por congelamento a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparação de Decellularization configurações e Recellularization Bioreactor
Nota: Usando uma tesoura, corte os tubos de silicone, como mostrado na tabela 1.
<ol><li>
Decellularization instalação 1 (para Triton X-100 perfusão e lavagem)
	<ol>
<li>Para um 2L de câmara (banheira de plástico), fita de todos os três pedaços de tubo A, como mostrado na figura 1A. Nota: Fita um tubo para uma parede onde a borda toca o fundo da câmara (entrada do detergente) e os outros dois tubos para a parede oposta com uma distância de 5 a 10 cm entre dependendo do comprimento da veia. Pelo menos 5 cm destes tubos também devem ser amarrado ao piso da câmara (de veia entrada e saída).</li>
		<li>Usando os conectores Luer machos e fêmeas, ligar em série da entrada do detergente tubo a tubo B seguido pelo tubo F, tubo C e finalmente para a entrada da veia. Lugar do tubo F, na gaveta da peristáltica bomba eu.</li>
		<li>Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à tomada da veia. Coloque a outra extremidade na jarra de vidro com saída de mangueira do fundo é colocado 45 cm acima da câmara (saída de detergente) e fita-lo para fixar. Leve o tubo G e empurra uma extremidade à tomada da mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade na câmara da veia. Nota: As fotos da instalação completa (setas vermelhas), câmara e direção de fluxo (setas brancas) são mostradas na figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization instalação 2 (TnBP para perfusão)
	<ol>
<li>Tomar um frasco de vidro de 1 L e coloque uma das extremidades do tubo C (entrada detergente) dentro do frasco até o tubo toca fundo do frasco.</li>
		<li>Conecte a outra extremidade ao tubo F seguido pelo tubo C. lugar a outra extremidade do tubo C na jarra até meia profundidade (entrada da veia). Coloque o tubo F na gaveta da bomba peristáltica eu.</li>
		<li>Pegue o tubo D... e coloque uma extremidade dentro do frasco (saída da veia) até a metade da profundidade e a outra extremidade na jarra de vidro com a mangueira inferior colocada a uma altura de 45 cm da entrada da veia (saída de detergente). Para fixar, fita tubos de entrada e saída do detergente.</li>
		<li>Colocar o frasco de vidro de 1L um agitador magnético e manter o ímã dentro da garrafa.</li>
		<li>Pegue o tubo G e empurrar uma ponta na saída de mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade no frasco de vidro de 1 L. Nota: As imagens de instalação completa (setas vermelhas), direção de fluxo e câmara (setas brancas) é mostrada na figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization configuração 3 (perfusão para DNase)
	<ol>
<li>Pegue uma garrafa de vidro de 250 mL e Coloque ambas as extremidades do tubo C. lugar área média do tubo na gaveta da bomba peristáltica II. Nota: Uma das extremidades do tubo é a entrada da solução e a outra extremidade do tubo é conectada à entrada da veia. Tomada da veia é deixada livre na solução.</li>
		<li>Coloque toda a configuração incluindo bomba a 37 ° C. As imagens de instalação completa e direção do fluxo é mostrada na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biorreator de recellularization
	<ol>
<li>Preparem todas as peças como mostrado na Figura 2A.</li>
		<li>Como mostrado na Figura 2B, tirar a tampa da 4 portas e inserir em cada porta, tubo H (saída da veia), eu (entrada de mídia) do tubo e tubo J (entrada da veia). Insira a outra extremidade do tubo H na porta 4th (meio de comunicação). Nota: A vista da PAC 4-Porto de cima é mostrada na Figura 2. Para fácil inserção dos tubos, cortar as bordas de um ponto afiado com uma tesoura.</li>
		<li>Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarrá-lo com uma sutura. Ligue os conectores de redução para as extremidades internas dos tubos H & J.</li>
		<li>Coloque o tubo de 60ml com uma superfície plana para a garrafa de vidro de 250 mL e em seguida, coloque a configuração feita acima dentro do tubo, como mostrado na Figura 2D. Como mostrado na Figura 2E, conecte os tubos K, E e K em série. Conecte um tubo K à entrada da veia e outro tubo K para a entrada de mídia. Nota: O diagrama esquemático da configuração e direção de fluxo é visto na Figura 2F.</li>
		<li>Esterilize o biorreator em autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de soluções
<ol><li>Solução 1 (10 x água): para 1 L de água ultrapura, adicionar 2 g de azida de sódio e 18,6 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Mexa até sais são dissolvidos.</li>
	<li>Solução 2 (1 de água x): tomar 100 mL de solução 1 e adicionar 900 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de água ultrapura, adicionar 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sódio e 9,3 g de EDTA. Mexa até dissolver.</li>
	<li>Solução 4 (1 x X-100 Triton): tomar 200 mL de solução 3 e adicionar 800 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 5 (1 x TnBP): adicionar 10 mL de TnBP com uma pipeta de 10 mL a 990 mL de solução 2.</li>
	<li>Solução 6 (40 Kunitz unidades/mL DNase): Adicionar Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI em 50 mL de tampão fosfato salino de Dulbecco contendo CaCl2 e MgCl2. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
	<li>Solução 7 (PBS): Adicione 24 g de cloreto de sódio, 0,6 g de cloreto de potássio, 4,32 g de fosfato de sódio e 0,72 g de fosfato de potássio a 3 L de água ultrapura. Mexa até dissolver. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar a 1 L de PBS na autoclave e armazenar separadamente.</li>
	<li>Solução 8 (0,1% o ácido peracético): A 50 mL de solução estéril 7, adicionar 50 µ l de ácido peracético. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
</ol>4. preparação de Medium endotelial
<ol><li>Adicione 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de soro humano AB e todos os componentes do kit de fator de crescimento EGM-2 exceto soro bovino fetal a 500 mL do meio de MCDB131 sob uma capa de estéril.</li>
</ol>5. decellularization da veia safena
<ol><li>Descongele a veia safena humana de-80 ° C à temperatura ambiente. Congelar-se novamente a-80 ° C e novamente descongelar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Uma biópsia de 2 mm de comprimento com uma tesoura de cortar e fixar em formaldeído por 24-48 h à temperatura ambiente. Amarre cada extremidade da veia para as farpas de um conector Luer macho e fêmea com uma sutura.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de decellularization 1 e preencher 1 L de solução 2. Perfundir para min 15 a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicionar 1 L da solução 4 e perfundir por 4 h a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicione 500 mL de solução 2 e perfundir por 5 min. esvaziar o conteúdo da instalação. Repita este passo. Desconecte a veia da configuração de perfusão 1 e conectar-se à instalação de perfusão 2.</li>
	<li>Adicionar 1 L de solução 5, ligar o agitador e perfundir por 4 h a 35 mL/min. Nota: Solução 5 parece nublada depois de ligar o agitador e ao longo da perfusão.</li>
	<li>Desconecte a veia da instalação de perfusão 2 e lavar a veia dentro e fora com seringa ou uma pipeta de 10 mL em 4 mudanças de água ultrapura para 5-10 min.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 3, adicionar 50 mL de solução 6 e perfundir a 10 mL/min em uma câmara de 37 ° C por 4 h. esvaziar o conteúdo da instalação e desconecte o setup na veia.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 1, encha 1 L de solução 2 e perfundir durante a noite a 35 mL/min. Repita o passo a passo 5.9 4 vezes (para um total de 5 ciclos) 5.4. Leve uma biópsia novamente como indicado no passo 5.2. Nota: Skip passo 5.8 segunda parte em ciclos de 1 e 3.</li>
	<li>Esvazie o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 2 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 2 após 12 h. esvaziar o conteúdo da instalação. Encha 1L de água ultrapura e perfundir por 24 h a 35 mL/min. mudança da água ultrapura após 12 h.Empty o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 7 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 7 após 12 h.</li>
</ol>6. verificação de Decellularization
<ol><li>Lave a formalina fixada biópsias em água ultrapura durante 15 min. processo em um processador de tecido seguindo protocolos padrão e incorporar em parafina22.</li>
	<li>Corte 5 µm seções usando um micrótomo e mancha com hematoxilina e 0,2% alcoólica eosina Meyer (H & E) seguindo protocolos padrão22.</li>
	<li>Ver os sob um microscópio para verificar se há perda de núcleos em tecido decellularized em relação ao tecido normal.</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>Esterilize a veia, colocando-o em um tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução 8. Agitar em 80 rotações por minuto (rpm) no shaker para 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lidar com a veia sob o fluxo laminar (LAF) de agora em diante, para manter a esterilidade. Transferi a veia utilizando Pinças esterilizadas para um novo tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução estéril 7 e 500 µ l de anti-anti. Agite como acima por 12 h. mudança solução 7 pelo menos duas vezes no meio.</li>
	<li>Usando a pinça estéril, a veia de transferência para um novo tubo de 50 mL e adicionar 50 mL de mídia endotelial. Agite como acima de 11 h.</li>
	<li>Monte o biorreator usando luvas estéreis sob a LAF do armário. Amarre a veia para do biorreator veia entrada e saída com esterilizados para suturas e fórceps.</li>
	<li>Conectar-se a veia para o biorreator e encha com o mesmo meio. Adicionar a heparina em 50 UI/mL e perfundir para h 1 a 2 mL/min em 37 ° C.</li>
	<li>Coletar 15-25 mL de sangue fresco (dependendo do comprimento da veia) do doador em tubos vacutainer de heparina revestido e diluir 1:1 com solução de Steen. Depois, adicione derivado de glândula endócrina vascular fator de crescimento endotelial (VEGF-EG, 80 ng/mL), fator de crescimento básico de fibroblasto (FGF-b, 4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL).</li>
	<li>Mover o biorreator para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 e perfundir por 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Aproximadamente após 12 h, mover o biorreator para um LAF do armário, pegue uma gota de sangue e medir glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a 3 mmol/L, adicionar glicose para trazer na faixa de 7-9 mmol/L. repetir este passo cada 8-12 h.</li>
	<li>Após 48 h, mova o biorreator para a LAF do armário e drenar o sangue de bioreator. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. Escorra a solução. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. repetir duas vezes ou até que a cor vermelha sangue é perdida. Nota: A biópsia pode ser tomada para verificação de fixação da célula. Desconecte a veia, corte as bordas de 5 mm da veia com uma tesoura e descartá-las. Pegue uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2 e conectar a veia novamente para o biorreator (etapa opcional).</li>
	<li>Adicionar 30-45 mL de meio de endotelial e perfundir para 96 h na incubadora em 2 mL/min. Nota: Adicione endotelial médio até a veia está submersa.</li>
	<li>Mover o biorreator dentro do gabinete LAF, desconecte a veia recellularized, bordas de 5 mm da veia com uma tesoura de cortar e descartar. Leve uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2.</li>
</ol>8. verificação da Recellularization
<ol><li>Siga as instruções na seção 6 e realizar coloração H & E. Examine as lâminas ao microscópio para a presença de células.</li>
</ol>

<ol>
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SSH detém ações em Verigraft, uma empresa que licenciou a tecnologia de vasos sanguíneos de engenharia de tecidos. Os outros autores não têm nada a divulgar.

A técnica aqui apresentada para decellularization das veias safena é um método fácil, simples e econômico que também pode ser aplicado a todas as veias de pequeno diâmetro como veias umbilicais e glândulas mamárias. As soluções de decellularization e as respectivas concentrações utilizadas neste método são da nossa anterior resultados6,7. Mesmo que recomendamos 5 ciclos de decellularization, em certas veias também observamos decellularization completa em 3 ciclos. No entanto, obtiveram-se resultados reprodutíveis, usando 5 ciclos. Aplicação deste protocolo, nós decellularized as veias de diferentes comprimentos até 30 cm com êxito (inédito resultado). Tomada da solução decellularization de levantamento por 45cm criará uma pressão de 33 mmHg dentro da veia. Em nossa experiência, notamos isto como um passo fundamental na decellularizing na veia toda uniformemente e reproducibly em 5 ciclos. A pressão escolhida é 3 vezes maior que a pressão de veia safena normal (5-10 mmHg), mas é que a mesma incompetência das veias (varizes)23. Além disso, podemos especular que esta alta pressão irá criar uma força significativa nas paredes da veia e pode, portanto, ajudar na remoção de células mais rápido e eficiente.
Desde TnBP é um solvente orgânico e insolúvel em água, mexendo o detergente até torna-se nublado é importante; caso contrário, o detergente irá flutuar. Pela mesma razão, para manter a TnBP misturado na solução, o tubo de saída do detergente foi colocado na parte superior da jarra de vidro com saída de mangueira. Remoção eficiente de TnBP da veia após seu uso em cada ciclo pode ser visto pela ausência de flutuação TnBP gotas na água lavada. Também notamos que pular a etapa de DNase também produziu um tecido decellularized, mas em alguns casos, observou-se um comparativamente alto teor de DNA no tecido decellularized. Como pressão alta e taxas de fluxo elevado não são necessárias para a atividade de DNase eficiente, uma taxa baixa perfusão (10 mL/min) pode ser usada. Uma bomba peristáltica diferente foi usada como seu tamanho menor ajuda na manipulação fácil da instalação. Desde que notamos que dano da maioria das células durante os resultados decellularization no ciclo 2, sugerimos pular tratamento de DNase durante ciclos 1 e 3 (resultados não publicados). Mesmo que a caracterização e quantificação de proteínas da matriz extracelular não foram realizadas neste manuscrito, nossa experiência anterior com protocolos idênticos decellularization mostrou a preservação das propriedades biomecânicas, matriz extracelular proteínas e estrutura7. Embora nossos experimentos preliminares de quantificação com estas veias produziram um resultado semelhante (não publicado), nossos resultados já publicados reforçará essa confiança.
Recellularization usando o sangue é um processo fácil e conveniente sobre células da medula óssea expandida como um pode evitar longos tempos de expansão celular, mutações espontâneas em células expandidas, invasão cirúrgica e desconforto para o paciente. Desde que é conhecido que endotelização também pode ocorrer de circulantes EPCs, formulamos a perfusão com sangue seguido de perfusão com endotelial médio será suficiente para recellularization. A segurança dos tecidos veia projetado usando um método similar é vista a partir de resultados de sucesso do transplante quando duas dessas veias foram implantados em crianças com obstrução de veia porta hepática extra7. Podemos especular que os fatores de crescimento na matriz extracelular decellularized permitirá a fixação de EPCs de circulação de sangue24. Recellularization das veias seguindo um protocolo semelhante mostrou células positivo para receptor VEGF-2 e aglomerado de diferenciação (CD 14) sobre o lúmen enquanto CD45 foram observadas células expressando na adventícia7. Podemos também imaginar que uma camada endotelial contínua não pode ser observada em todos os casos especialmente quando usando o sangue de pacientes mais velhos e doentes, como é sabido que tais indivíduos diminuíram os números de circulação de células progenitoras25. No entanto, podemos postular a perfusão do destinatário próprio sangue pode mascarar muitos dos antígenos que são expostos por causa da decellularization e, portanto, podem diminuir as chances de reações inflamatórias quando transplantadas em vez de transplantar somente decellularized os vasos sanguíneos. Além disso, a perfusão sanguínea pode depositar aumento dos níveis de fatores de crescimento no lúmen e adventícia, que por sua vez pode recrutar o aumento do número de células progenitoras, resultando em um rápido processo de recellularization na vivode circulação.
As vantagens do bioreactor design utilizado neste estudo são autoclave completo, fácil montagem, custo-efetividade, fácil manuseio e menos possibilidade de danos. Em nossa experiência, usando o projeto atual, veias foram recellularized até 10 cm de comprimento. Apesar das veias até 25 cm de comprimento, também pode ser recellularized, mantendo a veia em forma de "U" dentro do biorreator, isto deve ser validado. O design de biorreator mostra que a direção do fluxo na veia é contra a gravidade e é projetada como tal porque é a direção normal do fluxo para estas veias em seres humanos. A perfusão de 12 h do passo médio endotelial é condição da veia e aumentar a afinidade para a ligação de entrada EPCs. Adição de heparina extra e perfusão por 1h irá diminuir o risco de formação de coágulos de sangue nos tubos durante a perfusão sanguínea.
O volume de sangue necessário é dependente do comprimento da veia. O princípio básico, que seguimos para o volume de sangue é que a veia deve ser submersa no sangue. Durante a manipulação de volumes de sangue superiores a 45 mL, misturando ocasionalmente pode ser necessário para evitar a acumulação de células na parte inferior do bioreator. Nós adicionamos solução de Steen de sangue desde que contem uma quantidade elevada de proteínas e componentes necessários para manter os tecidos saudáveis durante o transplante de órgão26,27. Adição de VEGF e b-FGF é benéfica porque eles são de fatores de crescimento angiogênico potente28 e sua presença induz a migração, proliferação e diferenciação de EPCs29,30,31,32 . A quantidade de VEGF adicionado baseia-se nos nossos resultados inéditos anteriores, onde a proliferação de EPCs foi vista em 80 ng/mL. Adição de aspirina inibe a ativação de plaquetas33 , diminuindo assim as chances de seu apego à camada endotelial. Monitoramento contínuo e adição de glicose também será benéficos para a proliferação celular e impedindo a hemólise dos glóbulos vermelhos.
Uma vez que apenas uma amostra de sangue simples é exigida o destinatário, pode ser considerado como um procedimento fácil e viável, exigindo menos técnicos especializados. Mesmo assim, todo o procedimento mostrado aqui do início ao fim leva 20 dias, armazenando as veias decellularized como da prateleira produto vai encurtar o procedimento para 8 dias para os pacientes. Embora, tecnicamente, o armazenamento de veias decellularized não deverá afectar a eficiência de recellularization, devem ser avaliada. Engenharia de tecidos veias geradas após este procedimento podem ser usadas na clínica para cirurgias de by-pass, substituindo as veias obstruídas, insuficiência venosa, levando a varizes sem a necessidade de imunossupressão e proporcionando uma melhor qualidade de vida para o paciente.

Conduítes vasculares são necessários para várias condições clínicas como aneurismas, estenose da artéria carótida e aterosclerose, levando a graves problemas vasculares. Cirurgiões usam conduítes vasculares sintéticas, autólogos ou alogênico para restabelecer o fornecimento de sangue funcional. Embora a utilização de embarcações de sangue autólogas é ainda considerada a abordagem ideal, a disponibilidade de pacientes é muito limitada. As alternativas tais como enxertos sintéticos ou alogênico tem profundos problemas com tratamentos imunossupressores e pobre patência levando a reoperação1,2, resultando em saúde principal encargos económicos a países. Engenharia de tecidos de vasos sanguíneos visa proporcionar enxertos com uma homologia natural e células autólogas. Assim, o sistema imunológico destinatário reconhece o enxerto transplantado como o self e desde que tal um enxerto contém as proteínas naturais e células na configuração original, que pode funcionar melhor em comparação com as alternativas atuais. Engenharia de tecidos, órgãos, tais como a bexiga3, a uretra4, a traqueia5e veias6,7, tem sido utilizados com sucesso na clínica.
Engenharia de tecido para produzir enxertos personalizados requer um enxerto de um doador, seguido por decellularization e recellularization. Decellularization é uma tecnologia promissora para remover células de tecidos e órgãos8,9,10. Decellularization pode ser realizada por métodos físicos, químicos e enzimáticos específicos11 ou combinando-os. No ideal uso desses métodos, tecidos decellularized ter proteínas estruturais e funcionais semelhantes em uma matriz extracelular semelhante aos tecidos nativos. Esses órgãos possuem a capacidade intrínseca para melhorar a fixação, migração, proliferação e diferenciação de células-tronco recebidas.
Recellularization é um processo dinâmico de semeadura de células para o enxerto, e células-tronco destinatários pode ser usadas para transplante clínico. Células-tronco atualmente usadas para tais fins incluem a medula óssea, mesenquimal e órgão residentes3,5,6. Animal e pesquisa orientada estudos utilizaram células-tronco mesenquimais origens que são pluripotentes induzidas e fetal12,13,14. Este processo requer um biorreator (uma câmara que contém a veia e fornece as condições necessárias, como gases, temperatura, pH e pressão), células e meios de cultura. O desafio em recellularization é obter o número necessário de células de um tipo específico e uma estratégia de propagação de que células podem chegar todo tecido ou órgão. Mesmo que não completo tecido ou órgão estrutural e funcionalmente foram gerada e avaliada até agora, vários avanços no campo e os resultados iniciais mostram a possibilidade futura de15. A função chave da veia encontra-se no endotélio luminal que controla a infiltração de células inflamatórias nos tecidos e a camada média de músculo liso que ajuda na constrição e também fornece a força para manter a pressão arterial16. Estudos têm demonstrado que, durante a danos, endotelização ocorre de anastomose ou de circulação de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue17,18,19. Nossa estratégia para recellularization das veias depende os EPCs presentes na circulação do sangue.
Engenharia de tecidos de veias e artérias foi realizada por vários grupos diferentes decellularization e recellularization estratégias20,21a seguir. Nosso grupo também tem realizado e desenvolvido estratégias decellularization e recellularization para veias ilíacas e glândulas mamárias6,7. Decellularization foi realizada por agitação da veia em Triton X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) e enzima desoxirribonuclease (DNase). O recellularization foi realizada usando derivada de medula óssea de células musculares lisas e endoteliais6 ou sangue periférico7. As veias recellularized por qualquer protocolo clínico prometedores em fornecer o suprimento de sangue funcional em transplante de pacientes pediátricos com obstrução de veia porta hepática extra6,7.
Atualmente, nós desenvolvemos uma versão modificada do mesmo protocolo para o desempenho melhorado e fácil de manipulação de decellularization, recellularization e biorreator de veias de pequeno diâmetro. O atual protocolo de decellularization necessário perfusão de detergentes na veia usando pressão em vez de agitação com detergentes. O protocolo de recellularization envolve uma etapa adicional de pré-condicionamento para melhorar a aderência de célula e a adição de fatores de crescimento na circulação de sangue para melhorar a proliferação, a sobrevivência e a adesão celular. Também melhorámos o design do bioreator utilizando produtos comercialmente disponíveis. Neste trabalho, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo modificado para a realização de decellularization e recellularization das veias safena humanas.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Conduítes vasculares usados durante a maioria das cirurgias vasculares são enxertos sintéticos ou alogênico que muitas vezes levam a complicações causadas por imunossupressão e pobre patência. Engenharia de tecidos oferece uma nova solução para gerar os enxertos personalizados com uma natural da matriz extracelular que contém células do destinatário usando o método de decellularization e recellularization. Vamos mostrar um método detalhado para a realização de decellularization da veia safena humana e recellularization por perfusão de sangue periférico. A veia foi decellularized por perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) e 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonuclease (DNase). Triton X-100 e TnBP foram perfundidos em 35 mL/min para 4h enquanto DNase foi perfundido em 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. A veia foi lavada em água ultrapura e PBS e então esterilizada em 0,1% o ácido peracético. Foi lavado novamente em PBS e pré-condicionado endotelial médio. A veia foi conectada a um biorreator e perfundida com endotelial médio contendo 50 UI/mL heparina para 1 h. Recellularization foi realizada por preenchendo o biorreator com sangue fresco, diluído 1:1 em solução Steen e adicionando derivado de glândula endócrina vascular fatores de crescimento endoteliais (80 ng/mL), fatores de crescimento fibroblástico básico (4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL). O biorreator foi, em seguida, mudou-se para uma incubadora e perfundido por 48 h a 2 mL/min, mantendo a glicemia entre 3-9 mmol/L. Mais tarde, a veia era lavada com PBS, cheias de médio endotelial e perfundida por 96 h na incubadora. Tratamento com Triton X-100, TnBP e DNase decellularized da veia safena em 5 ciclos. A veia decellularized parecia branca em contraste com as veias normais e recellularized (luz vermelha). A hematoxilina & eosina (H & E) coloração mostraram a presença de núcleos apenas no normal, mas não nas veias decellularized. Na veia recellularized, H & E mancha mostraram a presença de células na superfície luminal da veia.

A morfologia bruta de uma veia normal é luz vermelha (Figura 3A). A cor vermelha é perdida na decellularization progressiva ciclos (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e pelo ciclo de 5th , parece pálido e branco (Figura 3D). A veia recellularized depois da perfusão sanguínea (Figura 3E) e mídia endotelial perfusão (Figura 3F) parece vermelho brilhante na cor. Os 5 ciclos de tratamento decellularization removido com sucesso as células da veia como eram vistos sem núcleos azuis na coloração H & E (Figura 4B). Em contraste, vários núcleos foram vistos na veia normal (Figura 4A). A presença de células anexadas no lado luminal é vista em H & E mancha na veia recellularized com sangue por 48 h (Figura 4, setas pretas) e após a perfusão com o meio endotelial de 96 h (Figura 3D, setas pretas).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montagem de configurações de perfusão para decellularization. A) a foto mostrando a configuração montada decellularization 1 para Triton X-100 e lavagem. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. B) a foto mostrando a configuração montada decellularization 2 para perfusão TnBP. Da mesma forma, como na instalação de decellularization 1, setas brancas indicam o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. C) a foto mostrando a configuração montada decellularization 3 para perfusão desoxirribonuclease. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas para a veia e soluções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparação e montagem do bioreator para recellularization. A) imagine apresentando materiais necessários para a montagem do biorreator. B) imagens do interior do cap 4 portas mostrando a colocação da redução conectores (setas vermelhas), aponta para conectar a veia de entrada e saída (setas brancas) e arranjo de tubos, H, I e J. A extremidade livre do tubo H é colocada em bioreator para retorno de mídia. C) os respectivos tubos entrando e saindo podem ser vistos da parte superior da tampa do bujão de 4. D) imagens mostrando o biorreator montado. E) foto mostrando a configuração inteira biorreator com a bomba peristáltica. Os tubos K estendem as conexões de bioreator para a bomba peristáltica. F) a representação esquemática do sistema de perfusão de biorreator toda. As setas laranja indicam o sentido do fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Morfologia das veias de efectivação durante decellularization e recellularization. A) a morfologia bruta da veia normal parece vermelho brilhante na cor. A cor é perdida com o aumento do número de ciclos de decellularization B) ciclo 2 e C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, a veia parece pálida e branca. A veia depois perfusing com E) sangue por 48 h e F) com o meio endotelial de 96 h parece mais uma vez brilhante vermelho na cor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterização das veias decellularized e recellularized. A hematoxilina e eosina, manchando a imagem de A) veia normal contém muitos núcleos azuis mas estão ausentes no B) veia decellularized. Na veia recellularized com C) sangue por 48 h e com D) endotelial médio para 96 h, fixação de células (setas pretas) no lúmen foi notado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Vídeo: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Bioengenharia

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Medicina

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

Sinergia endoscópica pré-grade com colheita de veia ponte para a melhoria da grande qualidade do enxerto de veia saphenous da perna inferior

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Um sistema de treinamento e teste para a realização de reconstrução vascular in vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

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