Gostaríamos de agradecer o Professor Anders Jeppsson ajuda com o fornecimento de vasos sanguíneos utilizados nos experimentos. Este estudo foi financiado pela subvenção LUA ALF a SSH.

O tecido usado, e o protocolo deste trabalho segue as diretrizes éticas da Universidade de Gotemburgo.
1. tecido preparação e armazenamento
<ol><li>Corte o tecido circundante da veia safena obtida usando uma tesoura e pinça cirúrgica. Nota: A veia safena é dissecada do membro inferior dos humanos por cirurgiões vasculares. A veia safena utilizada neste trabalho é uma parte não utilizada após a cirurgia de bypass.</li>
	<li>Para evitar vazamentos durante a perfusão, ligate todos os ramos de lado em suas extremidades com suturas e fórceps.</li>
	<li>Manter a veia em um tubo de 50 mL contendo 40 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS). Lave a veia alterando PBS 2 - 3 vezes para remover o excesso de sangue. Armazenar a veia por congelamento a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparação de Decellularization configurações e Recellularization Bioreactor
Nota: Usando uma tesoura, corte os tubos de silicone, como mostrado na tabela 1.
<ol><li>
Decellularization instalação 1 (para Triton X-100 perfusão e lavagem)
	<ol>
<li>Para um 2L de câmara (banheira de plástico), fita de todos os três pedaços de tubo A, como mostrado na figura 1A. Nota: Fita um tubo para uma parede onde a borda toca o fundo da câmara (entrada do detergente) e os outros dois tubos para a parede oposta com uma distância de 5 a 10 cm entre dependendo do comprimento da veia. Pelo menos 5 cm destes tubos também devem ser amarrado ao piso da câmara (de veia entrada e saída).</li>
		<li>Usando os conectores Luer machos e fêmeas, ligar em série da entrada do detergente tubo a tubo B seguido pelo tubo F, tubo C e finalmente para a entrada da veia. Lugar do tubo F, na gaveta da peristáltica bomba eu.</li>
		<li>Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à tomada da veia. Coloque a outra extremidade na jarra de vidro com saída de mangueira do fundo é colocado 45 cm acima da câmara (saída de detergente) e fita-lo para fixar. Leve o tubo G e empurra uma extremidade à tomada da mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade na câmara da veia. Nota: As fotos da instalação completa (setas vermelhas), câmara e direção de fluxo (setas brancas) são mostradas na figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization instalação 2 (TnBP para perfusão)
	<ol>
<li>Tomar um frasco de vidro de 1 L e coloque uma das extremidades do tubo C (entrada detergente) dentro do frasco até o tubo toca fundo do frasco.</li>
		<li>Conecte a outra extremidade ao tubo F seguido pelo tubo C. lugar a outra extremidade do tubo C na jarra até meia profundidade (entrada da veia). Coloque o tubo F na gaveta da bomba peristáltica eu.</li>
		<li>Pegue o tubo D... e coloque uma extremidade dentro do frasco (saída da veia) até a metade da profundidade e a outra extremidade na jarra de vidro com a mangueira inferior colocada a uma altura de 45 cm da entrada da veia (saída de detergente). Para fixar, fita tubos de entrada e saída do detergente.</li>
		<li>Colocar o frasco de vidro de 1L um agitador magnético e manter o ímã dentro da garrafa.</li>
		<li>Pegue o tubo G e empurrar uma ponta na saída de mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade no frasco de vidro de 1 L. Nota: As imagens de instalação completa (setas vermelhas), direção de fluxo e câmara (setas brancas) é mostrada na figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization configuração 3 (perfusão para DNase)
	<ol>
<li>Pegue uma garrafa de vidro de 250 mL e Coloque ambas as extremidades do tubo C. lugar área média do tubo na gaveta da bomba peristáltica II. Nota: Uma das extremidades do tubo é a entrada da solução e a outra extremidade do tubo é conectada à entrada da veia. Tomada da veia é deixada livre na solução.</li>
		<li>Coloque toda a configuração incluindo bomba a 37 ° C. As imagens de instalação completa e direção do fluxo é mostrada na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biorreator de recellularization
	<ol>
<li>Preparem todas as peças como mostrado na Figura 2A.</li>
		<li>Como mostrado na Figura 2B, tirar a tampa da 4 portas e inserir em cada porta, tubo H (saída da veia), eu (entrada de mídia) do tubo e tubo J (entrada da veia). Insira a outra extremidade do tubo H na porta 4th (meio de comunicação). Nota: A vista da PAC 4-Porto de cima é mostrada na Figura 2. Para fácil inserção dos tubos, cortar as bordas de um ponto afiado com uma tesoura.</li>
		<li>Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarrá-lo com uma sutura. Ligue os conectores de redução para as extremidades internas dos tubos H & J.</li>
		<li>Coloque o tubo de 60ml com uma superfície plana para a garrafa de vidro de 250 mL e em seguida, coloque a configuração feita acima dentro do tubo, como mostrado na Figura 2D. Como mostrado na Figura 2E, conecte os tubos K, E e K em série. Conecte um tubo K à entrada da veia e outro tubo K para a entrada de mídia. Nota: O diagrama esquemático da configuração e direção de fluxo é visto na Figura 2F.</li>
		<li>Esterilize o biorreator em autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de soluções
<ol><li>Solução 1 (10 x água): para 1 L de água ultrapura, adicionar 2 g de azida de sódio e 18,6 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Mexa até sais são dissolvidos.</li>
	<li>Solução 2 (1 de água x): tomar 100 mL de solução 1 e adicionar 900 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de água ultrapura, adicionar 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sódio e 9,3 g de EDTA. Mexa até dissolver.</li>
	<li>Solução 4 (1 x X-100 Triton): tomar 200 mL de solução 3 e adicionar 800 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 5 (1 x TnBP): adicionar 10 mL de TnBP com uma pipeta de 10 mL a 990 mL de solução 2.</li>
	<li>Solução 6 (40 Kunitz unidades/mL DNase): Adicionar Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI em 50 mL de tampão fosfato salino de Dulbecco contendo CaCl2 e MgCl2. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
	<li>Solução 7 (PBS): Adicione 24 g de cloreto de sódio, 0,6 g de cloreto de potássio, 4,32 g de fosfato de sódio e 0,72 g de fosfato de potássio a 3 L de água ultrapura. Mexa até dissolver. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar a 1 L de PBS na autoclave e armazenar separadamente.</li>
	<li>Solução 8 (0,1% o ácido peracético): A 50 mL de solução estéril 7, adicionar 50 µ l de ácido peracético. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
</ol>4. preparação de Medium endotelial
<ol><li>Adicione 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de soro humano AB e todos os componentes do kit de fator de crescimento EGM-2 exceto soro bovino fetal a 500 mL do meio de MCDB131 sob uma capa de estéril.</li>
</ol>5. decellularization da veia safena
<ol><li>Descongele a veia safena humana de-80 ° C à temperatura ambiente. Congelar-se novamente a-80 ° C e novamente descongelar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Uma biópsia de 2 mm de comprimento com uma tesoura de cortar e fixar em formaldeído por 24-48 h à temperatura ambiente. Amarre cada extremidade da veia para as farpas de um conector Luer macho e fêmea com uma sutura.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de decellularization 1 e preencher 1 L de solução 2. Perfundir para min 15 a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicionar 1 L da solução 4 e perfundir por 4 h a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicione 500 mL de solução 2 e perfundir por 5 min. esvaziar o conteúdo da instalação. Repita este passo. Desconecte a veia da configuração de perfusão 1 e conectar-se à instalação de perfusão 2.</li>
	<li>Adicionar 1 L de solução 5, ligar o agitador e perfundir por 4 h a 35 mL/min. Nota: Solução 5 parece nublada depois de ligar o agitador e ao longo da perfusão.</li>
	<li>Desconecte a veia da instalação de perfusão 2 e lavar a veia dentro e fora com seringa ou uma pipeta de 10 mL em 4 mudanças de água ultrapura para 5-10 min.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 3, adicionar 50 mL de solução 6 e perfundir a 10 mL/min em uma câmara de 37 ° C por 4 h. esvaziar o conteúdo da instalação e desconecte o setup na veia.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 1, encha 1 L de solução 2 e perfundir durante a noite a 35 mL/min. Repita o passo a passo 5.9 4 vezes (para um total de 5 ciclos) 5.4. Leve uma biópsia novamente como indicado no passo 5.2. Nota: Skip passo 5.8 segunda parte em ciclos de 1 e 3.</li>
	<li>Esvazie o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 2 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 2 após 12 h. esvaziar o conteúdo da instalação. Encha 1L de água ultrapura e perfundir por 24 h a 35 mL/min. mudança da água ultrapura após 12 h.Empty o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 7 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 7 após 12 h.</li>
</ol>6. verificação de Decellularization
<ol><li>Lave a formalina fixada biópsias em água ultrapura durante 15 min. processo em um processador de tecido seguindo protocolos padrão e incorporar em parafina22.</li>
	<li>Corte 5 µm seções usando um micrótomo e mancha com hematoxilina e 0,2% alcoólica eosina Meyer (H & E) seguindo protocolos padrão22.</li>
	<li>Ver os sob um microscópio para verificar se há perda de núcleos em tecido decellularized em relação ao tecido normal.</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>Esterilize a veia, colocando-o em um tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução 8. Agitar em 80 rotações por minuto (rpm) no shaker para 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lidar com a veia sob o fluxo laminar (LAF) de agora em diante, para manter a esterilidade. Transferi a veia utilizando Pinças esterilizadas para um novo tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução estéril 7 e 500 µ l de anti-anti. Agite como acima por 12 h. mudança solução 7 pelo menos duas vezes no meio.</li>
	<li>Usando a pinça estéril, a veia de transferência para um novo tubo de 50 mL e adicionar 50 mL de mídia endotelial. Agite como acima de 11 h.</li>
	<li>Monte o biorreator usando luvas estéreis sob a LAF do armário. Amarre a veia para do biorreator veia entrada e saída com esterilizados para suturas e fórceps.</li>
	<li>Conectar-se a veia para o biorreator e encha com o mesmo meio. Adicionar a heparina em 50 UI/mL e perfundir para h 1 a 2 mL/min em 37 ° C.</li>
	<li>Coletar 15-25 mL de sangue fresco (dependendo do comprimento da veia) do doador em tubos vacutainer de heparina revestido e diluir 1:1 com solução de Steen. Depois, adicione derivado de glândula endócrina vascular fator de crescimento endotelial (VEGF-EG, 80 ng/mL), fator de crescimento básico de fibroblasto (FGF-b, 4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL).</li>
	<li>Mover o biorreator para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 e perfundir por 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Aproximadamente após 12 h, mover o biorreator para um LAF do armário, pegue uma gota de sangue e medir glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a 3 mmol/L, adicionar glicose para trazer na faixa de 7-9 mmol/L. repetir este passo cada 8-12 h.</li>
	<li>Após 48 h, mova o biorreator para a LAF do armário e drenar o sangue de bioreator. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. Escorra a solução. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. repetir duas vezes ou até que a cor vermelha sangue é perdida. Nota: A biópsia pode ser tomada para verificação de fixação da célula. Desconecte a veia, corte as bordas de 5 mm da veia com uma tesoura e descartá-las. Pegue uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2 e conectar a veia novamente para o biorreator (etapa opcional).</li>
	<li>Adicionar 30-45 mL de meio de endotelial e perfundir para 96 h na incubadora em 2 mL/min. Nota: Adicione endotelial médio até a veia está submersa.</li>
	<li>Mover o biorreator dentro do gabinete LAF, desconecte a veia recellularized, bordas de 5 mm da veia com uma tesoura de cortar e descartar. Leve uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2.</li>
</ol>8. verificação da Recellularization
<ol><li>Siga as instruções na seção 6 e realizar coloração H & E. Examine as lâminas ao microscópio para a presença de células.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brockbank, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+upon+vein+function+in+vivo.">Effects of cryopreservation upon vein function in vivo.</a> Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).</li><li>O'Donnell, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+operative+findings+with+angiographic+and+noninvasive+hemodynamic+factors+associated+with+failure+of+polytetrafluoroethylene+grafts.">Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts.</a> Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).</li><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Application+of+Tissue-Engineered+Veins+Using+Autologous+Peripheral+Whole+Blood:+A+Proof+of+Concept+Study.">In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study.</a> EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).</li><li>Conconi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+human+fetal+mesenchymal+stem+cells+for+off-the-shelf+bone+tissue+engineering+application.">The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application.</a> Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration.">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Science Reports. 4, 6716 (2014).</li><li>Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs:+Current+Problems+and+Future+Directions.">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).</li><li>Young, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+the+eyes+of+an+immunologist.">Endothelial cells in the eyes of an immunologist.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).</li><li>Graham, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+seeding+of+prosthetic+vascular+grafts:+early+experimental+studies+with+cultured+autologous+canine+endothelium.">Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium.</a> Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).</li><li>Onuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+endothelialization+model+for+the+study+of+Dacron+graft+healing.">Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing.</a> Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).</li><li>Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+graft+healing.+Rapid+transmural+capillary+ingrowth+provides+a+source+of+intimal+endothelium+and+smooth+muscle+in+porous+PTFE+prostheses.">Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses.</a> American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery.">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+exercise+and+body+position+on+the+venous+pressure+at+the+ankle+in+patients+having+venous+valvular+defects.">The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects.</a> Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+peptides+derived+from+extracellular+matrix+as+chemoattractants+for+primary+endothelial+cells.">Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells.</a> Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).</li><li>van Ark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes+mellitus+is+associated+with+an+imbalance+in+circulating+endothelial+and+smooth+muscle+progenitor+cell+numbers.">Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers.</a> Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).</li><li>Steen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+lungs+from+a+non-heart-beating+donor.">Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor.</a> Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).</li><li>Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+lung+perfusion.">Ex-vivo lung perfusion.</a> Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).</li><li>Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+VEGF+function+in+angiogenesis:+signalling+pathways,+biological+responses+and+therapeutic+inhibition.">FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition.</a> Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).</li><li>Peplow, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-+and+cytokine-stimulated+endothelial+progenitor+cells+in+post-ischemic+cerebral+neovascularization.">Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization.</a> Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).</li><li>Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+improves+proliferation+and+differentiation+of+endothelial+progenitor+cells+via+upregulating+VEGF+generation.">Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation.</a> Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).</li><li>Dragoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+stimulates+endothelial+colony+forming+cells+proliferation+and+tubulogenesis+by+inducing+oscillations+in+intracellular+Ca2++concentration.">Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration.</a> Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).</li><li>Sai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+is+essential+to+maintain+endothelial+progenitor+cell+phenotype+in+TR-BME2+cells.">Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).</li><li>Gallus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspirin+and+other+platelet-aggregation+inhibiting+drugs.">Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs.</a> Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).</li></ol>

SSH detém ações em Verigraft, uma empresa que licenciou a tecnologia de vasos sanguíneos de engenharia de tecidos. Os outros autores não têm nada a divulgar.

A técnica aqui apresentada para decellularization das veias safena é um método fácil, simples e econômico que também pode ser aplicado a todas as veias de pequeno diâmetro como veias umbilicais e glândulas mamárias. As soluções de decellularization e as respectivas concentrações utilizadas neste método são da nossa anterior resultados6,7. Mesmo que recomendamos 5 ciclos de decellularization, em certas veias também observamos decellularization completa em 3 ciclos. No entanto, obtiveram-se resultados reprodutíveis, usando 5 ciclos. Aplicação deste protocolo, nós decellularized as veias de diferentes comprimentos até 30 cm com êxito (inédito resultado). Tomada da solução decellularization de levantamento por 45cm criará uma pressão de 33 mmHg dentro da veia. Em nossa experiência, notamos isto como um passo fundamental na decellularizing na veia toda uniformemente e reproducibly em 5 ciclos. A pressão escolhida é 3 vezes maior que a pressão de veia safena normal (5-10 mmHg), mas é que a mesma incompetência das veias (varizes)23. Além disso, podemos especular que esta alta pressão irá criar uma força significativa nas paredes da veia e pode, portanto, ajudar na remoção de células mais rápido e eficiente.
Desde TnBP é um solvente orgânico e insolúvel em água, mexendo o detergente até torna-se nublado é importante; caso contrário, o detergente irá flutuar. Pela mesma razão, para manter a TnBP misturado na solução, o tubo de saída do detergente foi colocado na parte superior da jarra de vidro com saída de mangueira. Remoção eficiente de TnBP da veia após seu uso em cada ciclo pode ser visto pela ausência de flutuação TnBP gotas na água lavada. Também notamos que pular a etapa de DNase também produziu um tecido decellularized, mas em alguns casos, observou-se um comparativamente alto teor de DNA no tecido decellularized. Como pressão alta e taxas de fluxo elevado não são necessárias para a atividade de DNase eficiente, uma taxa baixa perfusão (10 mL/min) pode ser usada. Uma bomba peristáltica diferente foi usada como seu tamanho menor ajuda na manipulação fácil da instalação. Desde que notamos que dano da maioria das células durante os resultados decellularization no ciclo 2, sugerimos pular tratamento de DNase durante ciclos 1 e 3 (resultados não publicados). Mesmo que a caracterização e quantificação de proteínas da matriz extracelular não foram realizadas neste manuscrito, nossa experiência anterior com protocolos idênticos decellularization mostrou a preservação das propriedades biomecânicas, matriz extracelular proteínas e estrutura7. Embora nossos experimentos preliminares de quantificação com estas veias produziram um resultado semelhante (não publicado), nossos resultados já publicados reforçará essa confiança.
Recellularization usando o sangue é um processo fácil e conveniente sobre células da medula óssea expandida como um pode evitar longos tempos de expansão celular, mutações espontâneas em células expandidas, invasão cirúrgica e desconforto para o paciente. Desde que é conhecido que endotelização também pode ocorrer de circulantes EPCs, formulamos a perfusão com sangue seguido de perfusão com endotelial médio será suficiente para recellularization. A segurança dos tecidos veia projetado usando um método similar é vista a partir de resultados de sucesso do transplante quando duas dessas veias foram implantados em crianças com obstrução de veia porta hepática extra7. Podemos especular que os fatores de crescimento na matriz extracelular decellularized permitirá a fixação de EPCs de circulação de sangue24. Recellularization das veias seguindo um protocolo semelhante mostrou células positivo para receptor VEGF-2 e aglomerado de diferenciação (CD 14) sobre o lúmen enquanto CD45 foram observadas células expressando na adventícia7. Podemos também imaginar que uma camada endotelial contínua não pode ser observada em todos os casos especialmente quando usando o sangue de pacientes mais velhos e doentes, como é sabido que tais indivíduos diminuíram os números de circulação de células progenitoras25. No entanto, podemos postular a perfusão do destinatário próprio sangue pode mascarar muitos dos antígenos que são expostos por causa da decellularization e, portanto, podem diminuir as chances de reações inflamatórias quando transplantadas em vez de transplantar somente decellularized os vasos sanguíneos. Além disso, a perfusão sanguínea pode depositar aumento dos níveis de fatores de crescimento no lúmen e adventícia, que por sua vez pode recrutar o aumento do número de células progenitoras, resultando em um rápido processo de recellularization na vivode circulação.
As vantagens do bioreactor design utilizado neste estudo são autoclave completo, fácil montagem, custo-efetividade, fácil manuseio e menos possibilidade de danos. Em nossa experiência, usando o projeto atual, veias foram recellularized até 10 cm de comprimento. Apesar das veias até 25 cm de comprimento, também pode ser recellularized, mantendo a veia em forma de "U" dentro do biorreator, isto deve ser validado. O design de biorreator mostra que a direção do fluxo na veia é contra a gravidade e é projetada como tal porque é a direção normal do fluxo para estas veias em seres humanos. A perfusão de 12 h do passo médio endotelial é condição da veia e aumentar a afinidade para a ligação de entrada EPCs. Adição de heparina extra e perfusão por 1h irá diminuir o risco de formação de coágulos de sangue nos tubos durante a perfusão sanguínea.
O volume de sangue necessário é dependente do comprimento da veia. O princípio básico, que seguimos para o volume de sangue é que a veia deve ser submersa no sangue. Durante a manipulação de volumes de sangue superiores a 45 mL, misturando ocasionalmente pode ser necessário para evitar a acumulação de células na parte inferior do bioreator. Nós adicionamos solução de Steen de sangue desde que contem uma quantidade elevada de proteínas e componentes necessários para manter os tecidos saudáveis durante o transplante de órgão26,27. Adição de VEGF e b-FGF é benéfica porque eles são de fatores de crescimento angiogênico potente28 e sua presença induz a migração, proliferação e diferenciação de EPCs29,30,31,32 . A quantidade de VEGF adicionado baseia-se nos nossos resultados inéditos anteriores, onde a proliferação de EPCs foi vista em 80 ng/mL. Adição de aspirina inibe a ativação de plaquetas33 , diminuindo assim as chances de seu apego à camada endotelial. Monitoramento contínuo e adição de glicose também será benéficos para a proliferação celular e impedindo a hemólise dos glóbulos vermelhos.
Uma vez que apenas uma amostra de sangue simples é exigida o destinatário, pode ser considerado como um procedimento fácil e viável, exigindo menos técnicos especializados. Mesmo assim, todo o procedimento mostrado aqui do início ao fim leva 20 dias, armazenando as veias decellularized como da prateleira produto vai encurtar o procedimento para 8 dias para os pacientes. Embora, tecnicamente, o armazenamento de veias decellularized não deverá afectar a eficiência de recellularization, devem ser avaliada. Engenharia de tecidos veias geradas após este procedimento podem ser usadas na clínica para cirurgias de by-pass, substituindo as veias obstruídas, insuficiência venosa, levando a varizes sem a necessidade de imunossupressão e proporcionando uma melhor qualidade de vida para o paciente.

Conduítes vasculares são necessários para várias condições clínicas como aneurismas, estenose da artéria carótida e aterosclerose, levando a graves problemas vasculares. Cirurgiões usam conduítes vasculares sintéticas, autólogos ou alogênico para restabelecer o fornecimento de sangue funcional. Embora a utilização de embarcações de sangue autólogas é ainda considerada a abordagem ideal, a disponibilidade de pacientes é muito limitada. As alternativas tais como enxertos sintéticos ou alogênico tem profundos problemas com tratamentos imunossupressores e pobre patência levando a reoperação1,2, resultando em saúde principal encargos económicos a países. Engenharia de tecidos de vasos sanguíneos visa proporcionar enxertos com uma homologia natural e células autólogas. Assim, o sistema imunológico destinatário reconhece o enxerto transplantado como o self e desde que tal um enxerto contém as proteínas naturais e células na configuração original, que pode funcionar melhor em comparação com as alternativas atuais. Engenharia de tecidos, órgãos, tais como a bexiga3, a uretra4, a traqueia5e veias6,7, tem sido utilizados com sucesso na clínica.
Engenharia de tecido para produzir enxertos personalizados requer um enxerto de um doador, seguido por decellularization e recellularization. Decellularization é uma tecnologia promissora para remover células de tecidos e órgãos8,9,10. Decellularization pode ser realizada por métodos físicos, químicos e enzimáticos específicos11 ou combinando-os. No ideal uso desses métodos, tecidos decellularized ter proteínas estruturais e funcionais semelhantes em uma matriz extracelular semelhante aos tecidos nativos. Esses órgãos possuem a capacidade intrínseca para melhorar a fixação, migração, proliferação e diferenciação de células-tronco recebidas.
Recellularization é um processo dinâmico de semeadura de células para o enxerto, e células-tronco destinatários pode ser usadas para transplante clínico. Células-tronco atualmente usadas para tais fins incluem a medula óssea, mesenquimal e órgão residentes3,5,6. Animal e pesquisa orientada estudos utilizaram células-tronco mesenquimais origens que são pluripotentes induzidas e fetal12,13,14. Este processo requer um biorreator (uma câmara que contém a veia e fornece as condições necessárias, como gases, temperatura, pH e pressão), células e meios de cultura. O desafio em recellularization é obter o número necessário de células de um tipo específico e uma estratégia de propagação de que células podem chegar todo tecido ou órgão. Mesmo que não completo tecido ou órgão estrutural e funcionalmente foram gerada e avaliada até agora, vários avanços no campo e os resultados iniciais mostram a possibilidade futura de15. A função chave da veia encontra-se no endotélio luminal que controla a infiltração de células inflamatórias nos tecidos e a camada média de músculo liso que ajuda na constrição e também fornece a força para manter a pressão arterial16. Estudos têm demonstrado que, durante a danos, endotelização ocorre de anastomose ou de circulação de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue17,18,19. Nossa estratégia para recellularization das veias depende os EPCs presentes na circulação do sangue.
Engenharia de tecidos de veias e artérias foi realizada por vários grupos diferentes decellularization e recellularization estratégias20,21a seguir. Nosso grupo também tem realizado e desenvolvido estratégias decellularization e recellularization para veias ilíacas e glândulas mamárias6,7. Decellularization foi realizada por agitação da veia em Triton X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) e enzima desoxirribonuclease (DNase). O recellularization foi realizada usando derivada de medula óssea de células musculares lisas e endoteliais6 ou sangue periférico7. As veias recellularized por qualquer protocolo clínico prometedores em fornecer o suprimento de sangue funcional em transplante de pacientes pediátricos com obstrução de veia porta hepática extra6,7.
Atualmente, nós desenvolvemos uma versão modificada do mesmo protocolo para o desempenho melhorado e fácil de manipulação de decellularization, recellularization e biorreator de veias de pequeno diâmetro. O atual protocolo de decellularization necessário perfusão de detergentes na veia usando pressão em vez de agitação com detergentes. O protocolo de recellularization envolve uma etapa adicional de pré-condicionamento para melhorar a aderência de célula e a adição de fatores de crescimento na circulação de sangue para melhorar a proliferação, a sobrevivência e a adesão celular. Também melhorámos o design do bioreator utilizando produtos comercialmente disponíveis. Neste trabalho, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo modificado para a realização de decellularization e recellularization das veias safena humanas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">4-Port Cap</td>
			<td style="width:208px;">CPLabSafety</td>
			<td style="width:119px;">WF-GL45-4Kit</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acetyl salicylic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Anti-Anti</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">B-FGF</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">cc-4113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:333px;">Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td>
			<td style="width:208px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">70808-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNase-I</td>
			<td style="width:208px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2 Growth Factors Kit</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">EG-VEGF</td>
			<td style="width:208px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Glass bottle 250ml</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151593</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass bottle 1L</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151595</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td>
			<td style="width:208px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin</td>
			<td style="width:208px;">Leo</td>
			<td style="width:119px;">387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin Coated Vacutainer Tubes</td>
			<td style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Human AB Serum</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 5/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-45518-06</td>
			<td>For 5X8mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">MCDB 131</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Per acetic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump I</td>
			<td style="width:208px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">7524-45</td>
			<td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump II</td>
			<td style="width:208px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM941</td>
			<td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td>
			<td style="width:208px;">Biotech</td>
			<td style="width:119px;">ISM569A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Shaker</td>
			<td style="width:208px;">Ika</td>
			<td style="width:119px;">KS4000 i&#160; control</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Steen solution</td>
			<td style="width:208px;">Xvivo</td>
			<td style="width:119px;">19004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Suture</td>
			<td style="width:208px;">Agnthos</td>
			<td style="width:119px;">14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tri-n-butyl Phosphate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16084.AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tube 60ml with flat base</td>
			<td style="width:208px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">60596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube A</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube B</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube C</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube D</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube E</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube F</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube G</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube H</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube I</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube J</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube K</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Conduítes vasculares usados durante a maioria das cirurgias vasculares são enxertos sintéticos ou alogênico que muitas vezes levam a complicações causadas por imunossupressão e pobre patência. Engenharia de tecidos oferece uma nova solução para gerar os enxertos personalizados com uma natural da matriz extracelular que contém células do destinatário usando o método de decellularization e recellularization. Vamos mostrar um método detalhado para a realização de decellularization da veia safena humana e recellularization por perfusão de sangue periférico. A veia foi decellularized por perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) e 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonuclease (DNase). Triton X-100 e TnBP foram perfundidos em 35 mL/min para 4h enquanto DNase foi perfundido em 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. A veia foi lavada em água ultrapura e PBS e então esterilizada em 0,1% o ácido peracético. Foi lavado novamente em PBS e pré-condicionado endotelial médio. A veia foi conectada a um biorreator e perfundida com endotelial médio contendo 50 UI/mL heparina para 1 h. Recellularization foi realizada por preenchendo o biorreator com sangue fresco, diluído 1:1 em solução Steen e adicionando derivado de glândula endócrina vascular fatores de crescimento endoteliais (80 ng/mL), fatores de crescimento fibroblástico básico (4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL). O biorreator foi, em seguida, mudou-se para uma incubadora e perfundido por 48 h a 2 mL/min, mantendo a glicemia entre 3-9 mmol/L. Mais tarde, a veia era lavada com PBS, cheias de médio endotelial e perfundida por 96 h na incubadora. Tratamento com Triton X-100, TnBP e DNase decellularized da veia safena em 5 ciclos. A veia decellularized parecia branca em contraste com as veias normais e recellularized (luz vermelha). A hematoxilina & eosina (H & E) coloração mostraram a presença de núcleos apenas no normal, mas não nas veias decellularized. Na veia recellularized, H & E mancha mostraram a presença de células na superfície luminal da veia.

A morfologia bruta de uma veia normal é luz vermelha (Figura 3A). A cor vermelha é perdida na decellularization progressiva ciclos (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e pelo ciclo de 5th , parece pálido e branco (Figura 3D). A veia recellularized depois da perfusão sanguínea (Figura 3E) e mídia endotelial perfusão (Figura 3F) parece vermelho brilhante na cor. Os 5 ciclos de tratamento decellularization removido com sucesso as células da veia como eram vistos sem núcleos azuis na coloração H & E (Figura 4B). Em contraste, vários núcleos foram vistos na veia normal (Figura 4A). A presença de células anexadas no lado luminal é vista em H & E mancha na veia recellularized com sangue por 48 h (Figura 4, setas pretas) e após a perfusão com o meio endotelial de 96 h (Figura 3D, setas pretas).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montagem de configurações de perfusão para decellularization. A) a foto mostrando a configuração montada decellularization 1 para Triton X-100 e lavagem. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. B) a foto mostrando a configuração montada decellularization 2 para perfusão TnBP. Da mesma forma, como na instalação de decellularization 1, setas brancas indicam o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. C) a foto mostrando a configuração montada decellularization 3 para perfusão desoxirribonuclease. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas para a veia e soluções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparação e montagem do bioreator para recellularization. A) imagine apresentando materiais necessários para a montagem do biorreator. B) imagens do interior do cap 4 portas mostrando a colocação da redução conectores (setas vermelhas), aponta para conectar a veia de entrada e saída (setas brancas) e arranjo de tubos, H, I e J. A extremidade livre do tubo H é colocada em bioreator para retorno de mídia. C) os respectivos tubos entrando e saindo podem ser vistos da parte superior da tampa do bujão de 4. D) imagens mostrando o biorreator montado. E) foto mostrando a configuração inteira biorreator com a bomba peristáltica. Os tubos K estendem as conexões de bioreator para a bomba peristáltica. F) a representação esquemática do sistema de perfusão de biorreator toda. As setas laranja indicam o sentido do fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Morfologia das veias de efectivação durante decellularization e recellularization. A) a morfologia bruta da veia normal parece vermelho brilhante na cor. A cor é perdida com o aumento do número de ciclos de decellularization B) ciclo 2 e C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, a veia parece pálida e branca. A veia depois perfusing com E) sangue por 48 h e F) com o meio endotelial de 96 h parece mais uma vez brilhante vermelho na cor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterização das veias decellularized e recellularized. A hematoxilina e eosina, manchando a imagem de A) veia normal contém muitos núcleos azuis mas estão ausentes no B) veia decellularized. Na veia recellularized com C) sangue por 48 h e com D) endotelial médio para 96 h, fixação de células (setas pretas) no lúmen foi notado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins at JoVE.com

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K visualizações.  University of Gothenburg. Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.

Vídeo: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Bioengenharia

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...