Vorremmo ringraziare il Professor Anders Jeppsson per aiuto con fornire vasi sanguigni utilizzati negli esperimenti. Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione LUA ALF a SSH.

Il tessuto utilizzato, e il protocollo di questa carta segue le linee guida etiche dell'Università di Göteborg.
1. stoccaggio e preparazione tessuto
<ol><li>Tagliare il tessuto circostante dalla vena safena estratto utilizzando forbici e pinze chirurgiche. Nota: La vena safena viene sezionata da arto inferiore degli esseri umani da chirurghi vascolari. La vena safena utilizzata in questa carta è una parte inutilizzata dopo intervento di bypass.</li>
	<li>Per evitare perdite durante l'aspersione, lega i rami laterali alle loro estremità con suture ed il forcipe.</li>
	<li>Mantenere la vena in una provetta da 50 mL contenente 40 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Lavare la vena modificando PBS 2 - 3 volte per rimuovere il sangue in eccesso. Memorizzare la vena di congelamento a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparazione di decellularizzazione configurazioni e ricellularizzazione bioreattore
Nota: Utilizzando le forbici, tagliare i tubi in silicone come mostrato in tabella 1.
<ol><li>
Installazione di decellularizzazione 1 (per aspersione Triton X-100 e lavaggio)
	<ol>
<li>A un 2 L da camera (vasca di plastica), nastro tutti i tre pezzi di tubo A come mostrato in Figura 1A. Nota: Nastro una provetta per una parete dove il bordo tocca il fondo della camera (ingresso di detersivo) e gli altri due tubi a parete opposta con una distanza di 5-10 cm in mezzo a seconda della lunghezza della vena. Almeno 5 cm di questi tubi dovrebbe essere registrata anche al piano della camera (di vena ingresso e uscita).</li>
		<li>Utilizzando i connettori Luer maschi e femminili, collegare in serie dell'ingresso di detergente tubo B seguita da tubo F, tubo C e infine verso l'ingresso della vena. Posto il tubo F nel cassetto della peristaltica pompa io.</li>
		<li>Prendere un altro tubo C e collegare un'estremità alla presa di vena. Posizionare l'altra estremità nel vaso di vetro con l'uscita del tubo inferiore che è posto 45 cm sopra la camera (presa di detersivo) e nastro adesivo per fissare. Prendere metropolitana G e inserite un'estremità alla presa del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità della camera della vena. Nota: Le immagini di installazione completa (frecce rosse), da camera e direzione di flusso (frecce bianche) sono mostrate in Figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installazione di decellularizzazione 2 (attendersi per aspersione)
	<ol>
<li>Prendete un vasetto di vetro 1L e inserire un'estremità del tubo C (aspirazione detergente) nel barattolo fino a quando il tubo tocca il fondo del vaso.</li>
		<li>Collegare l'altra estremità al tubo F seguita da tubo C. posto l'altra estremità del tubo C nel vaso fino a metà profondità (ingresso di vena). Inserire la cassetta della pompa peristaltica tubo F io.</li>
		<li>Tubo D di prendere e posizionare un'estremità nel vaso (presa di vena) fino a metà profondità e l'altra estremità nel vaso di vetro con il tubo inferiore posizionato ad un'altezza di 45 cm dall'ingresso di vena (presa di detersivo). Per proteggere, nastro tubi di aspirazione e mandata di detersivo.</li>
		<li>Mettere il barattolo di vetro 1L su un agitatore magnetico e tenere il magnete all'interno della bottiglia.</li>
		<li>Prendere metropolitana G e inserite un'estremità sull'uscita del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità nel vaso di vetro di 1 L. Nota: L'immagine di installazione completa (frecce rosse), camera e flusso di direzione (frecce bianche) è mostrata in Figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installazione di decellularizzazione 3 (aspersione per DNasi)
	<ol>
<li>Prendere un flacone di vetro da 250 mL e inserire la cassetta della pompa peristaltica II di entrambe le estremità del tubo C. posto l'area centrale del tubo. Nota: Un'estremità del tubo è l'insenatura di soluzione e l'altra estremità del tubo è collegata all'ingresso di vena. Presa di vena è lasciato libero in soluzione.</li>
		<li>Posizionare l'intero setup tra cui pompa a 37 ° C. L'immagine di installazione completa e la direzione del flusso è illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ricellularizzazione bioreattore
	<ol>
<li>Tenere pronto il tutto come mostrato in Figura 2A.</li>
		<li>Come mostrato nella Figura 2B, prendete il tappo 4-port e inserire ogni porta, H (presa di vena) del tubo, tubo I (ingresso media) e J (ingresso di vena) del tubo. Inserire l'altra estremità del tubo H nella porta 4th (organo di stampa). Nota: La visualizzazione della PAC 4 porte dall'alto è illustrata nella Figura 2. Per un facile inserimento dei tubi, tagliare i bordi di una punta acuminata con una forbice.</li>
		<li>Piegare l'altra estremità del tubo di J in una forma di U e legarla con un filo di sutura. Collegare i connettori riducendo all'estremità interna del tubo H & J.</li>
		<li>Inserire il tubo da 60 mL con una base piatta il flacone di vetro da 250 mL e poi inserire la configurazione fatta sopra il tubo come mostrato in Figura 2D. Come illustrato nella Figura 2E, collegare tubi K, E e K in serie. Collegare un tubo K all'ingresso di vena e un altro tubo K all'entrata del media. Nota: Il diagramma schematico della installazione e direzione del flusso è visto in Figura 2F.</li>
		<li>Sterilizzare in autoclave del bioreattore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Soluzione 1 (10 x acqua): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 2 g di sodio azide e 18,6 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Mescolare fino a quando sali disciolti.</li>
	<li>Soluzione 2 (1 x acqua): prendere 100 mL di soluzione 1 e aggiungere 900 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Soluzione 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL di acqua ultrapura, aggiungere 50 mL di Triton X-100, 1 g di sodio azide e 9,3 g di EDTA. Mescolare fino a scioglimento.</li>
	<li>Soluzione 4 (1 x Triton X-100): prendere 200 mL di soluzione 3 e aggiungere 800 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Soluzione 5 (1 x TnBP): aggiungere 10 mL di attendersi con una pipetta 10ml a 990 mL di soluzione 2.</li>
	<li>Soluzione 6 (40 Kunitz unità/mL DNasi): aggiungere 2.000 Kunitz unità di DNaseI in 50 mL di tampone fosfato salino di Dulbecco contenente CaCl2 e MgCl2. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.</li>
	<li>Soluzione 7 (PBS): Aggiungere 24 g di cloruro di sodio, 0,6 g di cloruro di potassio, 4,32 g di fosfato di sodio e 0,72 g di fosfato di potassio a 3 L di acqua ultrapura. Mescolare fino a scioglimento. Regolare il pH a 7.4. 1 L di PBS in autoclave di sterilizzare e conservare separatamente.</li>
	<li>Soluzione 8 (0,1% acido peracetico): 50 mL di soluzione sterile 7, aggiungere 50 µ l di acido peracetico. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.</li>
</ol>4. preparazione del mezzo endoteliale
<ol><li>Aggiungere 5 mL di L-Glutammina, 5 mL di anti-anti, 50 mL di siero umano AB e tutti i componenti del kit di fattore di crescita di EGM-2 tranne siero bovino fetale per 500 mL di terreno MCDB131 sotto una cappa sterile.</li>
</ol>5. decellularizzazione di vena safena
<ol><li>Scongelare la vena safena umana da-80 ° C a temperatura ambiente. Congelare di nuovo a-80 ° C e ancora scongelare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tagliare una biopsia di 2 mm di lunghezza con le forbici e difficoltà in formaldeide per 24-48 h a temperatura ambiente. Fare ogni estremità della vena per gli strali di un connettore Luer maschio e femmina con una sutura.</li>
	<li>Collegare la vena al setup di decellularizzazione 1 e riempire 1 L di soluzione 2. Irrorare per 15 min a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.</li>
	<li>Aggiungere 1 L di soluzione 4 e irrorare per 4 h a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.</li>
	<li>Aggiungere 500 mL di soluzione 2 e irrorare per 5 min. svuotare il contenuto del setup. Ripetere questo passaggio. Scollegare la vena dal setup di perfusione 1 e connettersi al programma di installazione di aspersione 2.</li>
	<li>Aggiungere 1 L di soluzione 5, accendere l'agitatore e irrorare per 4 h a 35 mL/min. Nota: La soluzione 5 sembra nuvoloso dopo la svolta sull'agitatore e durante l'aspersione.</li>
	<li>Scollegare la vena dal programma di installazione di aspersione 2 e lavare la vena dentro e fuori con siringa o una pipetta 10ml in 4 cambi di acqua ultrapura per 5-10 min.</li>
	<li>Collegare la vena alla installazione di aspersione 3, aggiungere 50 mL di soluzione 6 e irrorare a 10 mL/min in una camera a 37 ° C per 4 h. svuotare il contenuto del setup e scollegare la vena dal setup.</li>
	<li>Collegare la vena al setup di perfusione 1, riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare durante la notte a 35 mL/min. Ripetere il punto 5.4 al passaggio 5.9 4 volte (per un totale di 5 cicli). Prendere una biopsia nuovamente come indicato al punto 5.2. Nota: Ignora passaggio 5,8 seconda parte nei cicli 1 e 3.</li>
	<li>Svuotare il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 2 dopo 12 h. svuotare il contenuto del setup. Riempire 1L di acqua ultrapura e irrorare per 24 h a 35 mL/min cambia l'acqua ultrapura dopo 12 h.Empty il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 7 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 7 dopo 12 ore.</li>
</ol>6. Verifica di decellularizzazione
<ol><li>Lavare la formalina riparata biopsie in acqua ultrapura per 15 min. di processo in un processatore di tessuti seguendo protocolli standard e incorporare in paraffina22.</li>
	<li>Tagliare 5 µm sezioni utilizzando un microtomo e macchia con hematoxylin e 0,2% alcolica eosina Meyer (H & E) seguire protocolli standard22.</li>
	<li>Mostra al microscopio per verificare la perdita dei nuclei nel tessuto decellularizzato rispetto al tessuto normale.</li>
</ol>7. ricellularizzazione
<ol><li>Sterilizzare la vena collocandolo in un tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione 8. Agitare a 80 giri al minuto (rpm) nello shaker per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Gestire la vena sotto il flusso laminare (LAF) d'ora in avanti per mantenere la sterilità. Trasferire la vena utilizzando pinze sterili per un nuovo tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione sterile 7 e 500 µ l di anti-anti. Agitare come sopra per 12 h. Change soluzione 7 almeno due volte in mezzo.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili, la vena di trasferimento ad un nuovo tubo 50 mL ed aggiungere 50 mL di media endoteliale. Agitare come sopra per 11h.</li>
	<li>Assemblare il bioreattore utilizzando guanti sterili sotto la LAF armadietto. Legare la vena a vena entrata e di uscita con sutura sterile ed il forcipe del bioreattore.</li>
	<li>Collegare la vena per il bioreattore e riempire con lo stesso mezzo. Aggiungere eparina a 50 UI/mL e irrorare per 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.</li>
	<li>Raccogliere 15-25 mL di sangue fresco (a seconda della lunghezza della vena) dal donatore in provette vacutainer eparina rivestito e diluire 1:1 con soluzione di Steen. Successivamente, aggiungere ghiandola endocrina vascolare endoteliale fattore di crescita derivato (EG-VEGF, 80 ng/mL), fattore di crescita di base del fibroblasto (b-FGF, 4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL).</li>
	<li>Spostare il bioreattore in incubatore a 37 ° C con 5% CO2 e irrorare per 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Circa dopo 12 h, spostare il bioreattore in un armadietto, LAF prendere una goccia di sangue e misurare il glucosio utilizzando una dispositivo di monitoraggio della glicemia. Se il livello è inferiore a 3 mmol/L, aggiungere glucosio per portare nella gamma di 7-9 mmol/L. Ripetere questo passaggio ogni 8-12 h.</li>
	<li>Dopo 48 h, spostare il bioreattore nella LAF armadietto e drenare il sangue dal bioreattore. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, scarico la soluzione. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, Ripeti due volte o fino a quando il colore rosso sangue è perso. Nota: La biopsia può essere presa per la verifica del collegamento della cella. Scollegare la vena, tagliare i bordi di 5 mm della vena con le forbici e gettarli. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2 e connettersi nuovamente la vena del bioreattore (passaggio facoltativo).</li>
	<li>Aggiungere 30-45 mL di terreno endoteliale e irrorare per 96 h nell'incubatore a 2 mL/min. Nota: Aggiungere endoteliale medio fino a quando la vena è sommerso.</li>
	<li>Spostare il bioreattore nell'armadietto LAF, scollegare la vena recellularized, tagliare i bordi di 5 mm della vena utilizzando forbici e scartare. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2.</li>
</ol>8. Verifica di ricellularizzazione
<ol><li>Seguire le istruzioni nella sezione 6 ed eseguire colorazione H & E. Esaminare i vetrini al microscopio per la presenza di cellule.</li>
</ol>

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SSH detiene quote in Verigraft, una società che ha concesso in licenza la tecnologia dei vasi sanguigni di ingegneria tissutale. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

La tecnica qui presentata per decellularizzazione delle vene safene è un metodo facile, semplice e conveniente che può essere applicato anche a tutte le vene di piccolo diametro come vene ombelicali e mammarie. Le soluzioni di decellularizzazione e le relative concentrazioni utilizzati in questo metodo vengono dal nostro precedente Risultati6,7. Anche se si consiglia di 5 cicli di decellularizzazione, in alcune vene abbiamo anche notato decellularizzazione completa in 3 cicli. Tuttavia, sono stati ottenuti risultati riproducibili utilizzando 5 cicli. Applicazione del presente protocollo, abbiamo decellularized vene di varie lunghezze fino a 30 cm con successo (risultati non pubblicati). Presa della soluzione decellularizzazione di sollevamento da 45 centimetri creerà una pressione di 33 mmHg all'interno della vena. Nella nostra esperienza, abbiamo notato questo come un passo fondamentale in decellularizing la vena tutta in modo uniforme e riproducibile in 5 cicli. La pressione selezionata è 3 volte superiore rispetto alla pressione normale della vena safena (5-10 mmHg), ma è che lo stesso come incompetente vene (vene varicose)23. Inoltre, speculiamo che questa alta pressione creerà una forza significativa sulle pareti della vena e può, pertanto, aiutare nella rimozione delle cellule più veloce ed efficiente.
Poiché attendersi sono un solvente organico e insolubile in acqua, mescolando il detersivo fino a quando diventa nuvoloso è importante; in caso contrario, il detersivo galleggerà. Per lo stesso motivo, per mantenere attendersi miscelati in soluzione, tubo di uscita di detersivo è stato disposto nella parte superiore del vaso di vetro con l'uscita del tubo. Efficiente rimozione di attendersi dalla vena dopo l'utilizzo in ogni ciclo può essere visto dall'assenza di attendersi gocce nell'acqua lavata di galleggiamento. Abbiamo anche notato che saltando il passaggio della dnasi produsse anche un tessuto decellularizzato ma in alcuni casi, è stato notato un relativamente alto contenuto di DNA nel tessuto decellularizzato. Ad alta pressione e portate elevate non è richieste per attività di dnasi efficiente, può essere utilizzato un tasso di bassa perfusione (10 mL/min). Una pompa peristaltica differente è stata usata come relativo più piccolo formato aiuta in maneggevolezza del setup. Poiché abbiamo notato che il danno della maggior parte delle cellule durante risultati di decellularizzazione nel ciclo 2, ti consigliamo di saltare trattamento dnasi durante i cicli di 1 e 3 (risultati non pubblicati). Anche se la caratterizzazione e la quantificazione delle proteine della matrice extracellulare non sono stati eseguiti in questo manoscritto, la nostra esperienza precedente con protocolli simili di decellularizzazione ha mostrato la conservazione delle proprietà biomeccaniche, matrice extracellulare struttura e proteine7. Anche se i nostri esperimenti preliminari quantificazione con queste vene ha prodotto un risultato simile (non pubblicato), i nostri risultati già pubblicati rafforzerà questa fiducia.
Ricellularizzazione usando il sangue è un processo conveniente e facile sopra cellule del midollo osseo espanso come si può evitare lunghi tempi di espansione delle cellule, mutazioni spontanee in cellule espanse, invasione chirurgica ed il disagio per il paziente. Poiché è noto che endotelizzazione può verificarsi anche da circolanti EPCs, abbiamo supposto che l'aspersione con sangue seguita da perfusione con mezzo endoteliale sarà sufficiente per ricellularizzazione. La sicurezza dei tessuti vena progettati utilizzando un metodo simile è visto da risultati di successo del trapianto quando due tali vene sono state impiantate in bambini con l'ostruzione di vena porta extra7. Speculiamo che i fattori di crescita nella matrice extracellulare decellularizzato permetterà l'attaccamento di circolazione EPCs dal sangue24. Ricellularizzazione delle vene seguendo un protocollo simile ha mostrato le cellule positive per VEGF receptor-2 e cluster di differenziazione (CD) 14 sul lume mentre CD45 che esprimono le cellule sono state vedute nel adventitia7. Immaginiamo anche che un continuo dello strato endoteliale non può essere osservato in tutti i casi, soprattutto quando si utilizza sangue dai pazienti più anziani e malati, come è noto che tali individui hanno fatto diminuire i numeri di circolazione di cellule progenitrici25. Tuttavia, postuliamo che l'aspersione con proprie del destinatario sangue può mascherare molti degli antigeni che sono esposti a causa di decellularizzazione e così possono fare diminuire le probabilità di reazioni avverse infiammatorie quando trapiantate al contrario di trapiantare solo vasi sanguigni decellularizzati. Inoltre, aspersione di sangue possa depositare i livelli aumentati di fattori di crescita sul lume e il adventitia che a sua volta può reclutare numeri aumentati delle cellule progenitrici risultante in un rapido processo di ricellularizzazione in vivodi circolazione.
I vantaggi del design bioreattore utilizzato in questo studio sono completa sterilizzazione in autoclave, facilità di montaggio, economicità, maneggevolezza e la minor possibilità di danni. Nella nostra esperienza, utilizzando il design attuale, vene erano recellularized fino a 10 cm di lunghezza. Anche se le vene fino a 25 cm di lunghezza può anche essere recellularized mantenendo la vena a forma di "U" all'interno del bioreattore, questo deve essere convalidato. Il design di bioreattore dimostra che la direzione del flusso nella vena è contro la gravità ed è progettata come tale perché è la direzione normale del flusso per queste vene in esseri umani. La perfusione di 12h del passo medio endoteliale è presupposto la vena e aumentare l'affinità per il fissaggio di EPCs in arrivo. Aggiunta di eparina supplementare e perfusione per 1 h si abbassa il rischio di formare coaguli di sangue nei tubi durante l'aspersione di sangue.
Il volume di sangue necessaria dipende dalla lunghezza della vena. Il principio di base che seguiamo per volume di sangue è che la vena dovrebbe essere immersa nel sangue. Durante la gestione di volumi di sangue superiori a 45 mL, miscelazione occasionale potrebbe essere necessario per prevenire l'accumulo delle cellule nella parte inferiore del bioreattore. Abbiamo aggiunto la soluzione di Steen a sangue perché contiene una quantità elevata di proteine e componenti necessari per mantenere i tessuti sani durante organo trapianto26,27. Aggiunta di VEGF e FGF-b è vantaggioso in quanto si tratta di fattori di crescita angiogenici potente28 e la loro presenza induce la migrazione, proliferazione e differenziazione delle EPCs29,30,31,32 . La quantità di VEGF aggiunto si basa sui nostri precedenti risultati inediti dove la proliferazione delle EPCs è stato visto a 80 ng/mL. Aggiunta di aspirin inibisce l'attivazione delle piastrine33 diminuendo in tal modo le probabilità del loro attaccamento alla strato endoteliale. Monitoraggio continuo e l'aggiunta di glucosio sarà anche utile per la proliferazione cellulare e prevenire l'emolisi dei globuli rossi.
Poiché solo un campione di sangue semplice è richiesto dal destinatario, può essere considerato come una procedura facile e fattibile, che richiedono competenze meno tecniche. Anche se l'intera procedura mostrata qui dall'inizio alla fine dura 20 giorni, memorizzare le vene decellularizzate come un largo della piattaforma prodotto accorcerà la procedura per 8 giorni per i pazienti. Anche se il deposito delle vene decellularizzate tecnicamente non dovrebbe pregiudicare l'efficienza di ricellularizzazione, esso deve essere valutato. Tessutale vene generate seguendo questa procedura possono essere utilizzate in clinica per interventi chirurgici di bypass, sostituendo vene ostruite, insufficienza venosa, che porta alle vene varicose senza la necessità di immunosoppressione e fornendo così una migliore qualità di vita per il paziente.

Condotti vascolari sono necessari per parecchie circostanze cliniche come aneurismi, stenosi dell'arteria carotica e aterosclerosi che porta a gravi problemi vascolari. Per ripristinare l'apporto di sangue funzionale i chirurghi utilizzano condotti vascolari autologhi, trapianto allogeneic o sintetici. Anche se l'uso dei vasi sanguigni autologhi è ancora considerato l'approccio ideale, la disponibilità nei pazienti è majorly limitata. Le alternative quali gli innesti allogeneic o sintetiche hanno profondi problemi con trattamenti immunosoppressivi e scarsa pervietà che conduce il rifunzionamento1,2, conseguente salute maggiori oneri economici ai paesi. Ingegneria dei tessuti dei vasi sanguigni mira a fornire gli innesti con un'omologia naturale e cellule autologhe. Così, il sistema immunitario destinatario riconosce l'innesto trapiantato come lo sé e poiché tali un innesto contiene le proteine naturali e cellule nella configurazione originale, potrebbe funzionare meglio rispetto alle alternative attuali. Ingegneria tessutale organi, come la vescica3, l' uretra4, la trachea5e vene6,7, sono stati utilizzati con successo nella clinica.
Tessuto tecnico per produrre innesti personalizzati richiede un innesto da un donatore seguito da decellularizzazione e ricellularizzazione. Decellularizzazione è una tecnologia promettente per rimuovere le cellule da tessuti ed organi8,9,10. Decellularizzazione può essere eseguita dai metodi fisici, chimici ed enzimatici specifici11 o combinandoli. A un uso ottimale di questi metodi, tessuti decellularizzati possono avere simili proteine strutturali e funzionali in una tabella extracellulare simile ai tessuti nativi. Tali organi possiedono la capacità intrinseca di migliorare allegato, migrazione, proliferazione e differenziazione delle cellule staminali in arrivo.
Ricellularizzazione è un processo dinamico di semina di cellule nell'innesto, e cellule staminali destinatario può essere utilizzate per il trapianto clinico. Cellule staminali attualmente utilizzate per tali finalità includono del midollo osseo, mesenchimale e organo residenti3,5,6. Animale e orientata alla ricerca studi hanno utilizzato cellule staminali mesenchimali origini che sono pluripotenti indotte e fetale12,13,14. Questo processo richiede un bioreattore (una sezione che contiene la vena e fornisce le condizioni necessarie come temperatura, gas, pH e pressione), cellule e terreni di coltura. La sfida di ricellularizzazione è quello di ottenere il numero di cellule di un tipo particolare e una strategia di semina mediante il quale le cellule possono raggiungere intero tessuto o organo. Anche se non completa del tessuto o organo strutturalmente e funzionalmente è stato generato e valutato fino ad ora, diversi avanzamenti in campo ed i risultati iniziali mostrano la possibilità futura di15. La funzione del tasto della vena si trova nell'endotelio luminal che controlla l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nei tessuti ed al livello medio del muscolo liscio che aiuta a costrizione e fornisce anche la forza per tenere la pressione sanguigna16. Gli studi hanno dimostrato che durante i danni, endotelizzazione si verifica da anastomosi o da cellule progenitrici endoteliali (EPC) in sangue17,18,19di circolazione. La nostra strategia per ricellularizzazione delle vene si basa sulle EPCs presenti nel sangue circolante.
Ingegneria tissutale di vene e arterie è stata eseguita da diversi gruppi che seguono diversi decellularizzazione e ricellularizzazione strategie20,21. Il nostro gruppo ha anche suonato e sviluppato strategie di decellularizzazione e ricellularizzazione per le vene iliache e mammario6,7. Decellularizzazione è stato effettuato dall'agitazione della vena in Triton X-100, tri-n-butil fosfato (biologicamente) e l'enzima desossiribonucleasi (DNasi). Il ricellularizzazione è stato effettuato utilizzando cellule di derivazione midollare muscolo endoteliale e liscio6 o7di sangue periferico. Le vene recellularized da entrambi i protocolli hanno mostrato promessa clinica nella fornitura di sangue funzionale nel trapianto di pazienti pediatrici con ostruzione extra epatica della vena portale6,7.
Attualmente abbiamo sviluppato una versione modificata dello stesso protocollo per le prestazioni migliorate e facile di decellularizzazione, ricellularizzazione e bioreattore manipolazione delle vene di piccolo diametro. L'attuale protocollo di decellularizzazione necessaria perfusione di detergenti tramite la vena usando pressione invece di agitazione con detergenti. Il protocollo di ricellularizzazione comporta un ulteriore passaggio di precondizionamento per migliorare l'adesione delle cellule e l'aggiunta di fattori di crescita nella circolazione sanguigna per migliorare l'adesione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Inoltre abbiamo migliorato il design del bioreattore utilizzando prodotti disponibili in commercio. In questa carta, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo modificato per l'esecuzione di decellularizzazione e ricellularizzazione delle vene safene umane.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Vascolare conduttori utilizzati durante le maggior parte delle operazioni chirurgiche vascolari sono innesti allogeneic o sintetici che spesso portano a complicazioni causate da immunosoppressione e scarsa pervietà. Ingegneria tissutale offre una nuova soluzione per generare gli innesti personalizzati con una matrice extracellulare naturale contenente cellule del destinatario utilizzando il metodo di decellularizzazione e ricellularizzazione. Vi mostriamo un metodo dettagliato per l'esecuzione di decellularizzazione della vena safena umana e ricellularizzazione per aspersione del sangue periferico. La vena era decellularized irrorante 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (biologicamente) e 2.000 Kunitz unità della desossiribonucleasi (DNasi). X-100 Triton e attendersi sono stati irrorati a 35 mL/min per 4 h, mentre dnasi è stata irrorata a 10 mL/min a 37 ° C per 4 h. La vena è stata lavata in acqua ultrapura e PBS e poi sterilizzata in 0,1% di acido peracetico. Era ancora lavata in PBS e condizionato in mezzo endoteliale. La vena è stata collegata a un bioreattore e irrorata con endoteliale mezzo contenente 50 UI/mL eparina per 1 h. ricellularizzazione è stato effettuato compilando il bioreattore con sangue fresco, diluito 1:1 in soluzione di Steen, e aggiunta di ghiandola endocrina-derivata vascolare fattori di crescita endoteliali (80 ng/mL), fattori di crescita di base del fibroblasto (4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL). Il bioreattore fu poi spostato in un incubatore e irrorato per 48 h a 2 mL/min mantenendo glucosio tra 3-9 mmol/L. Più tardi, la vena era lavata con PBS, riempita con il mezzo di endoteliale ed irrorata per 96 h nell'incubatrice. Trattamento con Triton X-100, attendersi e dnasi decellularized La vena safena in 5 cicli. La vena decellularizzata sembrava bianca in contrasto con la normale e recellularized vene (rosso chiaro). L'ematossilina ed eosina (H & E) ha mostrato la presenza di nuclei solo nel normale, ma non nelle vene decellularizzate. Nella vena recellularized, H & E-macchiatura ha mostrato la presenza di cellule sulla superficie luminale della vena.

La morfologia lorda di una vena normale è luce rossa (Figura 3A). Il colore rosso si perde nella progressiva decellularizzazione cicli (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e dal ciclo 5th , sembra pallido e bianco (Figura 3D). La vena recellularized dopo aspersione del sangue (Figura 3E) e media endoteliale perfusione (Figura 3F) sembra rosso luminoso a colori. I 5 cicli di trattamento di decellularizzazione rimosso con successo le cellule dalla vena come nessun nuclei blu nella macchiatura H & E (fig. 4B) sono stati veduti. Al contrario, parecchi nuclei sono stati veduti nella vena normale (Figura 4A). La presenza di cellule allegate dal lato luminal è visto nella macchiatura di H & E nella vena recellularized con sangue per 48 h (Figura 4, frecce nere) e dopo perfusione con il mezzo endoteliale per 96 h (Figura 3D, frecce nere).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montaggio delle configurazioni di perfusione per decellularizzati. A) l'immagine mostrando il programma di installazione di decellularizzazione assemblato 1 per Triton X-100 e lavatrice. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. B) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 2 per aspersione di attendersi. Allo stesso modo, come installazione di decellularizzazione 1, frecce bianche indicano il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. C) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 3 per aspersione desossiribonucleasi. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano insenature per vena e soluzioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparazione e montaggio del bioreattore per ricellularizzazione. A) foto che Mostra materiali necessari per il montaggio del bioreattore. B) foto della parte interna del tappo 4 porte mostrando il posizionamento di ridurre connettori (frecce rosse), punti per connetterti vena entrata e uscita (frecce bianche) e disposizione dei tubi H, I e J. L'estremità libera del tubo H viene inserito nel bioreattore per restituire i supporti. C) i rispettivi tubi andando dentro e fuori possono essere visto dal lato superiore di 4 Porto cap. D) foto che mostra il bioreattore assemblato. E) immagine che mostra l'installazione di bioreattore tutta con la pompa peristaltica. I tubi K estendono le connessioni da bioreattore per la pompa peristaltica. F) rappresentazione schematica del sistema di perfusione del bioreattore intero. Le frecce arancioni indicano la direzione del flusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Lordo morfologia delle vene durante decellularizzazione e ricellularizzazione. A) la morfologia lorda del vena normale sembra rosso luminoso a colori. Il colore viene perso con un numero crescente di decellularizzazione cicli B) ciclo 2 e C) 3 del ciclo. D) By 5 cicli, la vena sembra pallido e bianco. La vena dopo che irrora con E) sangue per 48 h e F) con il mezzo endoteliale per 96 h sembra ancora una volta brillante rosso a colori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caratterizzazione delle vene decellularizzate e recellularized. L'ematossilina ed eosina immagine di A) vena normale contiene molti nuclei blu ma sono assenti in B) vena decellularizzata. Nella vena recellularized con C) sangue per 48 h e con D) endoteliale medium per 96 h, collegamento delle cellule (frecce nere) presso lumen è stato notato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Qui, descriviamo un protocollo per la vena safena decellularizzazione utilizzando detergenti e ricellularizzazione tramite aspersione del sangue periferico e del mezzo endoteliale.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K Views.  University of Gothenburg. Qui, descriviamo un protocollo per la vena safena decellularizzazione utilizzando detergenti e ricellularizzazione tramite aspersione del sangue periferico e del mezzo endoteliale.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization e Recellularization di fegati interi

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

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Bioingegneria

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autologo di cellule progenitrici endoteliali-Seeding Tecnologie e test di biocompatibilità per dispositivi cardiovascolari in un modello animale di grandi dimensioni

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedura per la safena umane Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusione e rinforzo esterno

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Medicina

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Approvvigionamento e decellularizzazione degli arti posteriori di ratto utilizzando un bioreattore ex vivo basato sulla perfusione per allotrapianto composito vascolarizzato

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

Endoscopica sinergica con Bridging Vein Harvesting per il miglioramento della grande qualità dell'innesto della vena Saphenous dalla gamba inferiore

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Un sistema di formazione e test per l'esecuzione della ricostruzione vascolare in vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Riepilogo

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