Este trabalho foi financiado com prêmios de escritório do cientista-chefe (SCT/16/37) e uma bolsa de doutoramento de MRC.

1. semeadura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em 96 bem as placas de hepatócitos diferenciação
Nota: Os reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo foi listado na tabela 1. Meios usados para esta experiência devem ser esterilizado e na temperatura de quarto para cultura de células. Todos os volumes de reagente/solução descritos nesta parte do protocolo são baseados em um único poço de uma placa de 96 poços, a menos que especificado de outra forma.
<ol><li>
Preparar laminina revestido 96 placas bem.
	<ol>
<li>Descongelar um frasco de laminina recombinante 521 (100 µ g/mL) (LN-521) por 2 h durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare uma solução de 5 µ g/mL, diluindo-se LN-521 na gelada 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) (com Ca2 +/ mg2 +).</li>
		<li>Use um líquido automático dispensador de manipulação com um tubo padrão gaveta de distribuição para adicionar 50 µ l da solução LN-521 por alvéolo de um prato bem 96. Nota: Todo volume dispensa são executadas com um distribuidor de manipulação automática do líquido com um tubo padrão gaveta de distribuição, a menos que especificado de outra forma. Prime a solução até atingir o final dispensação da fita e, em seguida, prossiga para dispensar. Múltiplas 96 placas bem podem ser preparadas no mesmo experimento, repetindo o processo quantas vezes for necessário.</li>
		<li>Incube as placas revestidas LN521 em 37 °C/5% CO2 para 2 a 4 h. Nota: Placas com revestimento em LN521 podem ser armazenadas duas semanas a 4 ° C. Mantenha as placas seladas em uma superfície plana para evitar a evaporação e contaminação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aquecer o número necessário de placas pré-revestidas a 37 ° C por 30 min a 1 h.</li>
	<li>Aspire a solução LN-521 restante da superfície revestida, usando um adaptador de aspiração de 8 canais. Nota: É fundamental para evitar qualquer contato com a superfície revestida, para evitar a degradação do revestimento.</li>
	<li>Imediatamente adicione 50 μL por poço de mTeSR1 suplementado com inibidor de quinase Rho-associado (ROCK) 10 µM Y27632 e manter a placa na incubadora até a célula semeadura em 37 °C/5% CO2. Nota: Não permitem os poços laminina-revestidos secar.</li>
	<li>
Prepare uma suspensão de células de 3 x 105 células/mL em mTeSR1 suplementado com inibidor ROCK 10 µM Y27632. Nota: A densidade de semeadura para cada linhagem celular exigirá a otimização.<ol>
<li>Aspire o meio de uma placa de Petri com uma cultura diferenciada de hPSCs em cerca de 75% a 85% confluência cultivada na LN-521 conforme descrito anteriormente12. Nota: hPSCs são cultivadas na LN-521, em mTSER1, com o médio mudou a cada 24h e passadas regularmente, uma vez que as células alcançar 80% de confluência como descrito anteriormente,12.</li>
		<li>Lavar as células com 5 mL de temperatura 1 x DPBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e aspire o buffer.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de 1x gentil eritrócito de dissociação para as células e incubar a 37 ° C por 6 a 8 min para dissociação de célula. Nota: Para parar a reação, examine o desprendimento das células da matriz sob o microscópio. As células devem ser parcialmente desconectadas da placa. Se assim não for, estender a incubação por um extra 1 a 2 min.</li>
		<li>Terminar a reação aspirando o reagente gentil dissociação celular e adicionar 5 mL de mTeSR1 fresco suplementado com 10 µM ROCK inibidor da Y27632 para as células. Utilize um raspador de célula para levantar as células da matriz e da pipeta e descer usando uma dica P1000 várias vezes para misturar.</li>
		<li>Contar as células viáveis usando um hemocytometer baseado no azul Trypan método de exclusão de coloração e preparar a suspensão de células com concentrações necessárias.</li>
		<li>Pipetar o número desejado das células para um tubo de centrífuga de 15 mL ou 50 mL estéril e girar as células para baixo por centrifugação-los a 115 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: Para uma 96 placa bem, 5 mL de meio de mTeSR1, contendo 3 x 105 células/mL é necessário para a linha de celular H9.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e suavemente Ressuspender as células até à obtenção de uma solução homogênea a 37 ° C em mTeSR1 suplementado com inibidor ROCK 10 µM Y27632. Nota: O uso de inibidor ROCK é recomendado como melhora a célula sobrevivência post re-chapeamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 50 µ l de suspensão de célula na chapa bem 96 contendo 50 µ l de mTeSR1 com inibidor ROCK 10 µM Y27632.</li>
	<li>Após a semeadura, entregue as chapas para a incubadora de célula em 37 °C/5% CO2 por 24 h permitir que as células anexar.</li>
	<li>Examinar as células no dia seguinte e retirar inibidor ROCK, uma vez que estabeleceu o contato de uma célula para outra. Na confluência de 40%, alterne para o meio de diferenciação (figura 1B). Nota: Se a confluência de célula é superior a 40%, as placas não são adequadas para diferenciação de HLC com a linha de celular H9.</li>
</ol>2. diferenciação hPSCs de hepatócitos células na Laminins recombinante em 96 placas bem
<ol><li>
Prepare a diferenciação de fatores de crescimento e meio.
	<ol>
<li>Prepare o humano Activin A solução (100 µ g/mL), dissolvendo o pó de Activin A humana em estéril 0,2% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1:1, 000.</li>
		<li>Prepare a solução do mouse (10 µ g/mL) Wnt3a dissolvendo o pó de Wnt3a de rato em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1: 200.</li>
		<li>Prepare a solução humana hepatócito (10 µ g/mL) fator de crescimento (HGF) dissolvendo-se pó HGF humano em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1: 1000.</li>
		<li>Prepare a solução Oncostatin M (OSM) (20 µ g/mL), dissolvendo o pó em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1:1, 000.</li>
		<li>Endoderme definitivo: preparar o meio de diferenciação de endoderme, consistindo de suplemento de 2% B27 (50 x, sem insulina), 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais: 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado a Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) meio basal. Armazenar a 4 ° C e uso dentro de duas semanas. Em cada mudança de média, completar o volume necessário com A Activin e Wnt3a na concentração final de 100 ng/mL e 50 ng/mL, respectivamente.</li>
		<li>Hepatoblast diferenciação: preparar o hepatoblast meio de diferenciação, constituído por substituição de 20% de soro de nocaute (KSR), 0,5% alternativa suplemento de L-glutamina, 1% não aminoácidos essenciais (timina), 0.1 mM beta-Mercaptoetanol, DMSO 1% e 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado ao nocaute DMEM (KO-DMEM). Filtrar sob vácuo e armazenar a 4 ° C. Use dentro de duas semanas.</li>
		<li>Diferenciação do hepatócito: preparar o meio de diferenciação de hepatócitos, consistindo de 1%, uma alternativa suplemento de L-glutamina, 10 µM hidrocortisona 21-hemisuccinate sal de sódio (HCC), 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado ao meio de HepatoZYME. Armazenar o estoque a 4 ° C e uso dentro de duas semanas. Para cada alteração média, completar o volume necessário com HGF e OSM (concentrações finais em 10 ng/mL e 20 ng/mL, respectivamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>post de 24 h, semeadura, cuidadosamente remova o meio usando um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis e adicionar 100 µ l de fresco endoderme-ferragem suplementado com 100 ng/mL A Activin e Wnt3a de 50 ng/mL. Nota: O processo de diferenciação começa uma vez que o meio de endoderme definitivo foi adicionado. Uma vez que a célula semeadura é otimizado, a diferenciação celular é iniciada normalmente dentro de 24 h. Médio de todas as alterações são executadas, removendo o meio com um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis e 100 µ l de meio fresco, utilizando um dispensador de manipulação automática do líquido com um padrão de distribuição do tubo gaveta distribuidora a menos que caso contrário especificado. Utilizou-se um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis com um 96 bem cabeça, uso de 300 µ l dicas. Em breve, 90 µ l foram aspirado do bem evitando qualquer contato com as células, e é importante para não secar as células durante a mudança de médio para reduzir o stress celular.</li>
	<li>Para células-tronco embrionárias humanas (hESCs), altere o meio de diferenciação endoderme diariamente por três dias. Se a diferenciação é realizada por células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), estenda a fase definitiva endoderme por 2 dias extras usando Activin A apenas.</li>
	<li>Após a indução da endoderme definitivo, alterne para meio de KSR/DMSO para especificação de hepatoblast e mudar o médio a cada 2 dias durante 5 dias. Nota: Se houver um número de células não-inscritos no poço, use KO-DMEM não completadas para lavar as células uma vez antes da próxima mudança de médio. Devido a duração da segunda fase do protocolo (5 dias), haverá 3 alterações médias com o último no último dia da especificação hepatoblast.</li>
	<li>Após a diferenciação de hepatoblast, alterne para o HepatoZYME médio para maturação do hepatócito. Lavar as células uma vez com HepatoZYME sem o suplemento após a remoção média KSR/DMSO e adicionar 100 µ l de meio de maturação HepatoZYME suplementado com 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Mude o meio cada 48 h por 7 a 10 dias. No dia 18 da diferenciação, caracteriza HLCs, analisando a expressão gênica e atividade metabólica CYP P450.</li>
</ol>3. caracterização do hepatócito, como células diferenciadas na Laminins recombinante
<ol><li>Detecta a expressão de marcadores específicos do hepatócito e marcadores de polarização usando immunostaining.</li>
	<li>Teste de função metabólica de hepatócito usando CYP P450 ensaios conforme descrito antes12.</li>
	<li>Determine a variação de placa, contando o número total de células por poço por placa.</li>
</ol>4. alto Throughput imunocitoquímica e aquisição de imagem
<ol><li>No dia 18 de diferenciação, lavar os poços três vezes com 1 x DPBS, os HLCs pela distribuidora 50 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) e incubar a temperatura ambiente por 15 a 30 min. Após a fixação, lavar três vezes com PBST (0.1% tween) (sem o Ca2 +/ mg2 +) usando uma anilha de chapa automática. Nota: Todas as lavagens nesta seção são realizadas usando uma anilha de chapa automático, a menos que especificado de outra forma. Todas as lavagens são feitas seguindo o mesmo protocolo.</li>
	<li>Permeabilize a membrana pela distribuidora 100 µ l de PBST (sem o Ca2 +/ mg2 +) e incube por 20 min em temperatura ambiente. Em seguida, executar o bloqueio de proteína por aplicadora 100 µ l de 10% BSA em PBST e incubar durante 1 h em agitação suave, utilizando um agitador de placa. Após bloqueio de proteína, adicionar 50 µ l de 1% de BSA em PBST contendo os anticorpos primários, incubar a 4 ° C durante a noite com agitação suave, utilizando um agitador de placa. Nota: Não lave entre adição de bloco e anticorpo da proteína.</li>
	<li>Após 24h, lavar três vezes com 1 x DPBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e adicione o anticorpo secundário por aplicadora 50 µ l de 1% de BSA em PBST. Incube a 1h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Após a incubação do anticorpo secundário, lave 3 vezes com 1 x DPBS. Adicionar 50 µ l de DPBS com DAPI (10 µ g/mL) e incubar durante 5 a 10 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Finalmente, lavar 3 vezes com DPBS e deixar 100 µ l de 1 x DPBS no poço. As placas estão prontas para a imagem latente. Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C, no escuro até a imagem.</li>
	<li>A placa de imagem usando um sistema de imagens de alto teor e adquirir vários campos do outro lado do poço para obter uma boa representação do poço. Quantificar a expressão dos marcadores diferentes nos HLCs usando software de Colombo (alto teor Imaging software de sistema de análise). Nota: Colombo é um software de análise de conteúdo elevado, que oferece análise de segmentação celular para fenotipagem de células. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando CellProfiler, um software open-source para análise quantitativa de imagens biológicas22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. 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Prof David C. Hay é co-fundador e diretor da Stemnovate Limited.
Prof David C. Hay é um diretor de HigherSteaks Limited.

Nosso procedimento semi-automático é eficiente, confiável e econômica, permitindo a produção de HLCs em escala (Figura 1). Não houve diferença significativa em termos do número de células entre os poços da placa, tornando esta plataforma uma abordagem adequada para triagem baseada em célula (Figura 2). Além disso, o fluxo de trabalho semi automação permite que o usuário produzir um grande número de pratos ao mesmo tempo, que não era possível antes de usar processos manuais5,12.
Importante, o processo de automação não teve impacto sobre os rendimentos de diferenciação, com a maioria das células expressando HNF4α (89,2% ± 2) e ALB (92,8% ± 6) (Figura 3). HLCs também expressaram enzimas CYP P450 CYP2D6 e CYP3A4 e exibido CYP1A2 e CYP3A atividade metabólica comparável ao anterior relatado experimentos (Figura 3)5. Apesar da padronização do protocolo, confluência de célula antes da diferenciação é fundamental para diferenciação de HLC pura. Portanto, garantir uma distribuição boa célula através do poço é uma consideração importante (Figura 1). Isto tem provado para ser a linha de celular dependente, portanto, otimização de semeadura e densidade de células é necessária para cada antes de linha celular aumentar.
Na sua forma actual, esta plataforma não é adequada para produzir grandes quantidades de HLCs para aplicações clínicas, e isso provavelmente será alcançado através da utilização de biorreatores e fábricas de célula. No entanto, a metodologia desenvolvida permite para a rápida geração de células do fígado humanas para modelagem de doença, triagem de drogas e/ou drogas reaproveitamento de estudos. Além disso, o ensaio é passível de multiplexação, permitindo a geração de datasets Multiparamétrico para análise mecanicista. Vai para a frente, acreditamos também que esta tecnologia pode ser aplicada a sistemas em vitro mais complexos tais como diferenciação 3D ou como uma plataforma para melhorar HLC fenótipo em vitro.
Em conclusão, acreditamos que nosso sistema simples e semi automatizado vai aumentar a taxa de transmissão experimental e reduzir a variação experimental, melhorando assim a qualidade dos conjuntos de dados biológicos e sua extrapolação para a fisiologia humana.

Hepatócitos humanos primários (PHHs) representam o padrão atual para a investigação biomédica hepática. Apesar de suas vantagens, PHHs representam uma fonte limitada de hepatócitos maduros com fenótipo instável1. Células-tronco embrionárias humanas (CES) e as células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC) têm sido propostas como um poderoso recurso para investigação biomédica, prometendo uma fonte renovável de tecidos humanos, incluindo o fígado2,3,4 . Procedimentos de diferenciação de hepatócito atual geram células que expressam marcadores de hepatócitos, genes e funções semelhantes PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Mais recentemente, o uso de materiais definidos e matrizes como laminins recombinante, tem fenótipo celular melhorada e reprodutibilidade experimental5,12,13,14.
Técnicas de cultura celular tradicionais dependem fortemente de pipetagem manual, que é demorado e sujeito a erros. Isso limita o throughput de ensaio e um pode trabalhar com o formato da placa. Até à data, a maioria dos estudos descrevendo a geração de HLCs são trabalho intensivo na natureza e, portanto, de pequena escala em tamanho15,16,17.
Corrente de avanços na manipulação de líquidos e sistemas de pipetagem, em combinação com microscopia automatizada e analisadores de laboratório, foi possível desenvolver procedimentos que minimizem a necessidade de intervenção humana. Aproveitou-se dessas tecnologias e desenvolvemos um sistema semi-automático de diferenciação com o qual deseja gerar grandes quantidades de tecido do fígado humano para o basic e investigação biomédica aplicada. Esta abordagem pode ser realizada tanto com humano ESC e linhas de iPSC com pequenos ajustes necessários, dependendo da linhagem celular. Combinando este sistema com alto conteúdo de análise, demonstramos que a fenotipagem HLC pode ser menos demorado e realizada em escala18,19,20,21.
Em resumo, a automatização das técnicas de cultura celular aqui descritos conduziu a melhorias na confiabilidade, gerenciamento de tempo experimental e throughput de ensaio.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Células estaminais pluripotentes humanas representam uma fonte renovável de tecido humano. Nossa pesquisa é focada em gerar tecido hepático humano a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e induzidas (iPSCs) as células-tronco pluripotentes. Procedimentos de diferenciação atual geram humanas hepatócitos células (HLCs) exibindo uma mistura de traços fetais e adultos. Para melhorar o fenótipo da célula, totalmente definimos nosso procedimento de diferenciação e o nicho da célula, resultando na geração de populações de células que exibem expressão gênica melhorada e função. Enquanto estes estudos marcam progresso, a capacidade de gerar grandes quantidades de multi placas bem para triagem tem sido limitada pela variação de lote para lote e procedimentos intensivos do trabalho. Para abordar esta questão, desenvolvemos uma plataforma semi automatizada para diferenciar células estaminais pluripotentes, em semeadura de célula tronco HLCs. e diferenciação foram realizadas usando a manipulação de líquidos e sistemas automáticos de pipetagem em formato de placa de 96 poços. Após a diferenciação, o fenótipo celular foi analisado usando microscopia automatizada e um luminómetro bem multi.

Diferenciação celular foi realizada usando uma linha de células estaminais embrionárias (H9). A plataforma semi automatizada foi usada para diferenciar e caracterizar as células (figura 1A). Um dispensador de manipulação automática do líquido foi usada para revestir a matriz e células únicas de sementes. Diferenciação celular foi iniciada quando as células atingido 40% confluência (dia 0). Alterações de mídia foram realizadas usando um sistema de pipeta automática de canais electrónicos portáteis para remover a médio e o manipulação de líquido dispensador de adição médio (figura 1A). Fixação da pilha e coloração foram realizadas utilizando o dispensador de manipulação automática do líquido em combinação com a arruela de chapa automática. Imagens e quantificação foram realizadas por meio de um sistema de imagem de alto teor e software de Colombo. Atividade de citocromo P450 foi medida utilizando um ensaio estabelecido. Após incubação de substrato, sobrenadantes de células foram colhidas e bioluminescência gravado usando um leitor de microplacas multimodo (figura 1A). Além disso, a microscopia de contraste de fase convencional foi usada para medir as mudanças na morfologia celular durante a diferenciação de hepatócitos (figura 1B).
No dia 18, a variabilidade na cela número entre poços foi examinada após DAPI coloração (Figura 2A). Sete campos de vista foram capturadas por bem e o número de núcleos quantificados (Figura 2A). Detectamos que não há diferenças estatísticas entre poços, com uma média de 41.662 ± 3, 366 células por poço (Figura 2B).
No dia 18, HLCs eram fixas e manchados por marcadores típicos de hepatócitos (Figura 3A-G) e testados para CYP P450 atividade. HLCs expressaram marcadores de hepatócito como HNF4α (89,2% células positivas ± 2), ALB (92,8% ± 6 células positivas), AFP (61,8% ± 2 células positivas). HLCs também expressaram proteínas CYP P450 CYP2D6 e CYP3A4 e exibida uma aparência distinta e poligonal, como mostrado pela expressão da proteína de E-caderina. Atividade do CYP P450 HLCs foi medida no dia 18. HLCs exibiram atividade CYP1A2 em ± 45 295.906, 828 RLU/mL/mg de proteína e CYP3A no 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg de proteína (Figura 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figura 1: diferenciação de hepatócitos de EPS na 96 bem formato. (A). diagrama dos equipamentos utilizados para a diferenciação celular semi automatizar, fixação, coloração, imagem latente e atividade funcional. (B). representante as alterações na morfologia celular durante a diferenciação HLC. Brevemente, EPS são pré-pintados em direção a endoderme definitivo, seguido de especificação de hepatoblast caracterizada por células de paralelepípedos, como morfologia e antes da maturação do hepatócito com células, adquirindo forma poligonal. Barra de escala = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figura 2: avaliação da variabilidade de HLCs-a bem. (A) representação de um 96 placa bem vista HLCs manchadas com DAPI. Barra de escala = 1 mm. (B) a quantificação do número de células por poço. Média do número de células por poços em colunas (parte superior) e linhas (inferior), de sete campos de views por bem e quantificados utilizando software de Colombo. Número de telemóvel média em toda a placa é 41.662 ± 3.366 SEM as células por poço. Não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os poços. Utilizou-se uma ANOVA One-Way com testes estatísticos do post-hoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figura 3: expressão de marcador do hepatócito e medição de atividade de CYP P450 no HLCs no dia 18. (A) a percentagem do alfa do fator nuclear 4 hepatócito (HNF4α) expressão ± SEM baseia-se trinta poços com dez campos de vista por bem. (B) o percentual de expressão de albumina (ALB) + /-SEM, é baseado em 3 poços separados com dez campos de vista por bem. (C) a porcentagem de alfa fetoprotein (AFP) + /-SEM é baseada em 3 poços separados com dez campos de vista por bem. (D) E-caderina de coloração. (E) coloração de CYP2D6. Coloração de CYP3A4 (F) . (G). imunoglobulina G (IgG), controle de coloração. Barra de escala = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 e 3A atividade metabólica no HLCs no dia 18. O representa dados biológicos seis Replica + /-atividade SEM. é citado como unidades relativas de luz (RLUs) /mL por 1 mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K visualizações.  University of Edinburgh. Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biologia

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

Protocolo Integrativo para Geração de Organoides Hepáticos Humanos 3D Derivados de iPSC

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioengenharia

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Imunologia e Infecção

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...