Name: semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
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Diese Arbeit wurde mit Auszeichnungen aus dem Hauptamt Office (TCS/16/37) und ein Promotionsstipendium MRC unterstützt.

(1) seeding humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 96 auch Platten für Hepatozyten Differenzierung
Hinweis: Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendeten hat wurde in Tabelle 1aufgeführten. Für dieses Experiment verwendete Medien sind steril und bei Raumtemperatur für die Zellkultur. Alle Reagenzlösung/Volumes in diesem Teil des Protokolls beschriebenen basieren auf einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>
Bereiten Sie Laminin 96-well-Platten beschichtet.
	<ol>
<li>Tauen Sie ein Fläschchen mit rekombinanten Laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) für 2 h bei 4 ° c über Nacht</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 µg/mL Lösung durch Verdünnung LN-521 im eiskalten 1 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (mit Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Verwenden Sie eine automatische Flüssigkeit Umgang mit Dispenser mit einem Standardrohr Verzicht auf Kassette, 50 µL der LN-521-Lösung pro Bohrloch einer 96-well-Platte hinzuzufügen. Hinweis: Alle Volumen verzichtet werden durchgeführt mit einer automatischen Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser mit einem Standardrohr Abgabe Kassette, sofern nicht anders angegeben. Prime die Lösung bis zum Abgabe der Kassette Ende, dann gehen Sie zu verzichten. Durch den Vorgang so oft wie nötig wiederholen, können mehrere 96-well-Platten im gleichen Experiment vorbereitet werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die LN521-beschichtete Platten bei 37 °C/5% CO2 für 2 bis 4 h. Hinweis: LN521-beschichteten Platten können bis zu zwei Wochen bei 4 ° c gelagert werden Halten Sie die Platten versiegelt auf einer flachen Oberfläche, Verdunstung und Kontamination zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wärmen Sie die erforderliche Anzahl von vorbeschichtete Platten bei 37 ° C für 30 min bis 1 h.</li>
	<li>Aspirieren Sie die restliche LN-521-Lösung der beschichteten Oberfläche mit einem 8-Kanal-Aspiration-Adapter. Hinweis: Es ist entscheidend für jede Berührung mit der beschichteten Oberfläche, Beschichtung Verschlechterung zu vermeiden.</li>
	<li>Sofort fügen Sie 50 µL pro Bohrloch des mTeSR1 Mediums mit 10 µM Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitor Y27632 ergänzt hinzu und die Platte im Inkubator bis Zelle Aussaat bei 37 °C/5% CO2. Hinweis: Lassen Sie nicht die Laminin-beschichtete Brunnen trocken.</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Zellsuspension von 3 x 105 Zellen/mL in mTeSR1 Medium mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632 ergänzt. Hinweis: Die Aussaatdichte für jede Zelllinie erfordert Optimierung.<ol>
<li>Aspirieren Sie das Medium aus einer Petrischale mit einem undifferenzierten Kultur der hPSCs bei etwa 75 % bis 85 % Konfluenz kultiviert auf LN-521 wie oben beschrieben12. Hinweis: hPSCs sind kultiviert auf LN-521 in mTSER1 mit dem Medium verändert alle 24 h, und passagiert regelmäßig, sobald die Zellen 80 % Konfluenz wie zuvor beschrieben12erreichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 mL der Raumtemperatur 1 X DPBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und aufziehen der Puffer.</li>
		<li>Die Zellen 5 mL 1 x sanfte Zelle Dissoziation Reagenz hinzu und Inkubation bei 37 ° C für 6 bis 8 min für Zelle Dissoziation. Hinweis: Um die Reaktion zu stoppen, untersuchen Sie die Loslösung der Zellen von der Matrix unter dem Mikroskop. Die Zellen sollten teilweise von der Platte abgenommen werden. Ist dies nicht der Fall, die Inkubation für eine zusätzliche 1 bis 2 Minuten zu verlängern.</li>
		<li>Kündigen Sie die Reaktion durch Absaugen der sanften Zelle Dissoziation Reagenz und 5 mL frische mTeSR1 Medium mit 10 µM-ROCK-Inhibitor Y27632 zu den Zellen ergänzt. Verwenden Sie einen Zelle Schaber, heben Sie die Zellen aus der Matrix und Pipette nach oben und unten mit einer P1000 Spitze mehrmals zu mischen.</li>
		<li>Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer basierend auf Trypan Blau Färbung Ausschluss-Methode und bereiten Sie die Zellsuspension mit erforderlichen Konzentrationen.</li>
		<li>Die gewünschte Anzahl der Zellen in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL oder 50 mL Pipette und spin-down der Zellen durch Zentrifugieren sie 115 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Für eine 96-well-Platte ist 5 mL mTeSR1 3 x 105 Zellen/mL-haltigem Medium für die Zelllinie H9 erforderlich.</li>
		<li>Den überstand abgesaugt und sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet, bis eine homogene Lösung bei 37 ° C in mTeSR1 Medium ergänzt mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632 erreicht ist. Hinweis: Die Verwendung von ROCK-Inhibitor wird empfohlen, da es Zelle überleben Post wieder Beschichtung verbessert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Zellsuspension auf die 96 well-Platte mit 50 µL der mTeSR1 mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632.</li>
	<li>Nach der Aussaat, die Platten zurück in die Zelle Inkubator bei 37 °C/5% CO2 für 24 h, damit die Zellen legen.</li>
	<li>Untersuchen Sie am nächsten Tag die Zellen zu und zurückzuziehen Sie ROCK-Inhibitor, sobald die Zelle zu Zelle Kontakt hergestellt wurde. Bei 40 % Konfluenz wechseln Sie zur Differenzierung Medium (Abbildung 1 b). Hinweis: Wenn Zelle Konfluenz 40 % übersteigt, sind die Platten nicht für HLC Differenzierung mit der Zelllinie H9 geeignet.</li>
</ol>(2) Differenzierung hPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auf rekombinante Laminins in 96 auch Platten
<ol><li>
Bereiten Sie die Differenzierung Mittel- und Wachstums-Faktoren.
	<ol>
<li>Bereiten Sie menschliche Activin A-Stammlösung (100 µg/mL) durch menschliche Activin A Pulver in sterilen 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) in gepufferter Kochsalzlösung auflösen. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie 1:1 000.</li>
		<li>Bereiten Sie Maus Wnt3a Stammlösung (10 µg/mL vor) durch Auflösen der Maus Wnt3a Pulver in sterilen 0,2 % BSA. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 1: 200.</li>
		<li>Bereiten Sie menschliche Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) Stammlösung (10 µg/mL) durch menschliche HGF-Pulver in sterilen 0,2 % BSA auflösen. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 1: 1000.</li>
		<li>Bereiten Sie Oncostatin M (OSM)-Stammlösung (20 µg/mL) durch Auflösen des Pulvers in sterilen 0,2 % BSA. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie 1:1 000.</li>
		<li>Definitive Entoderm: bereiten Sie Entoderm Differenzierung Medium, bestehend aus 2 % B27 Ergänzung (50 X, ohne Insulin), 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen: 100 IE/mL und 100 µg/mL, bzw.) hinzugefügt, um Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) basale Medium. Bei 4 ° C lagern und innerhalb von zwei Wochen zu verwenden. Ergänzen Sie bei jedem mittleren Wechsel sich das erforderliche Volumen mit Activin A und Wnt3a bei Endkonzentration von 100 ng/mL und 50 ng/mL, beziehungsweise.</li>
		<li>Hepatoblast Differenzierung: bereiten Sie Hepatoblast Differenzierung Medium, bestehend aus 20 % ko-Serum Ersatz (KSR), 0,5 % eine Alternative Ergänzung zu L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol, 1 % DMSO und 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 IE/mL und 100 µg/mL, beziehungsweise), Ko DMEM (KO-DMEM) hinzugefügt. Unter Vakuum zu filtern und Lagerung bei 4 ° C. Verwenden Sie innerhalb von zwei Wochen.</li>
		<li>Hepatozyten Differenzierung: Vorbereiten der Hepatozyten Differenzierung Medium, bestehend aus 1 % eine Alternative Ergänzung zu L-Glutamin, 10 µM Hydrocortison-21-Hemisuccinate Natriumsalz (HCC), 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 IE/mL und 100 µg/mL, beziehungsweise), HepatoZYME Medium hinzugefügt. Die Aktie bei 4 ° C lagern und innerhalb von zwei Wochen. Für jede mittlere Änderung ergänzen das erforderliche Volumen mit HGF und OSM (Endkonzentrationen bei 10 ng/mL und 20 ng/mL, beziehungsweise).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h Post Aussaat, sorgfältig entfernen das Medium über eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem und 100 µL der frischen Entoderm-Priming-Medium mit 100 ng/mL Activin A und 50 ng/mL Wnt3a ergänzt. Hinweis: Der Differenzierungsprozess beginnt, sobald die endgültigen Entoderm Medium hinzugefügt wurde. Wenn Zelle Aussaat optimiert ist, ist die zellulare Unterscheidung normalerweise innerhalb von 24 h initiiert. Alle Änderungen erfolgen durch das Medium mit einer automatischen Handheld elektronische Pipette Kanalsystem entfernen und Verzicht auf frisches Medium einen Standard ein automatisches liquid Handling-Dispenser mit 100 µL Medium tube Abgabe Kassette, sofern nichts anderes angegeben. Eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem wurde mit 96 auch Kopf, mit 300 µL-Spitzen verwendet. Kurz gesagt, 90 µL wurden von der gut vermeiden jeglichen Kontakt mit den Zellen abgesaugt, und es ist wichtig, nicht die Zellen während der mittlere Änderung zur Verringerung der Belastung der Zelle zu trocknen.</li>
	<li>Für humane embryonale Stammzellen (hESC) ändern Sie das Entoderm Differenzierung Medium täglich für drei Tage. Erfolgt die Differenzierung für menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), verlängern Sie die definitive Entoderm Bühne für 2 Tage mit Activin A nur.</li>
	<li>Nach der endgültigen Entoderm Induktion wechseln Sie zu KSR/DMSO-Medium für die Hepatoblast-Spezifikation und verändern Sie alle 2 Tage für 5 Tage das Medium. Hinweis: Gibt es eine Reihe von fraktionslosen Zellen in den Brunnen, verwenden Sie nicht ergänzt KO-DMEM, um die Zellen einmal vor der nächsten mittlere Änderung zu waschen. Aufgrund der Dauer der zweiten Stufe des Protokolls (5 Tage) werden 3 mittlere Veränderungen mit dem letzten am letzten Tag der Hepatoblast Spezifikation.</li>
	<li>Im Anschluss an die Hepatoblast Differenzierung wechseln Sie zu HepatoZYME Medium für Hepatozyten Reifung. Waschen Sie die Zellen einmal mit HepatoZYME ohne Zuschlag nach dem Entfernen der KSR/DMSO-Medium und 100 µL der HepatoZYME Reifung Medium mit 10 ng/mL HGF und 20 ng/mL OSM ergänzt.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium alle 48 h für 7 bis 10 Tage. Am 18. Tag der Differenzierung charakterisieren GLT durch Analyse der Genexpression und CYP P450 Stoffwechselaktivität.</li>
</ol>3. Charakterisierung von Hepatozyten-ähnliche Zellen differenziert auf rekombinante Laminins
<ol><li>Den Ausdruck von Hepatozyten-spezifische Marker und Polarisation Marker mit Immunostaining zu erkennen.</li>
	<li>Testen Sie Hepatozyten metabolische Funktion mit CYP P450-Assays, wie vor12beschrieben.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Platte Variation, zählen die Gesamtzahl der Zellen pro Bohrloch pro Platte.</li>
</ol>4. hohe Durchsatz Immunocytochemistry und Bildaufnahme
<ol><li>Am Tag 18 der Differenzierung waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 X DPBS, beheben Sie die GLT durch Abgabe 50 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) und bei Raumtemperatur 15 bis 30 min inkubieren. Nach der Fixierung, dreimal mit PBST waschen (0,1 % Tween) (ohne Ca2 +/Mg2 +) mit einer automatischen Platte Scheibe. Hinweis: Alle Wäschen in diesem Abschnitt erfolgt über eine automatische Platte-Waschmaschine, sofern nicht anders angegeben. Alle Wäschen erfolgt nach dem gleichen Protokoll.</li>
	<li>Permeabilize der Membran durch Abgabe 100 µL PBST (ohne Ca2 +/Mg2 +) und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes führen Sie das Protein blockieren durch Abgabe 100 µL 10 % BSA in PBST und Inkubation für 1 h in Sanftes Schütteln mit einem Teller Shaker. Fügen Sie nach Protein blockieren 50 µL 1 % BSA in PBST, der primäre Antikörper enthält hinzu, bei 4 ° C inkubieren Sie über Nacht mit sanft schütteln mit einem Teller Shaker. Hinweis: Waschen Sie nicht zwischen Protein Block und Antikörper-Ergänzung.</li>
	<li>Waschen Sie nach 24 Stunden dreimal, mit 1 X DPBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und fügen Sie den sekundären Antikörper durch Abgabe 50 µL 1 % BSA in PBST. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal nach der Sekundärantikörper Inkubation mit 1 X DPBS. Fügen Sie 50 µL des DPBS mit DAPI (10 µg/mL) und 5 – 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Schließlich waschen Sie 3 Mal mit DPBS und 100 µL 1 X DPBS in den Brunnen. Platten sind bereit für die Bildgebung. Hinweis: Platten sollte bis Bildgebung bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden.</li>
	<li>Bild der Plattenrandes durch den Einsatz eines High-Content imaging Systems, und erwerben mehrere Felder über den Brunnen, eine gute Darstellung des Brunnens zu erhalten. Den Ausdruck der verschiedenen Marker in der GLT mit Columbus Software (High-Content Imaging System Analysesoftware) zu quantifizieren. Hinweis: Columbus ist eine hohe Content-Analyse-Software, die Segmentierung Analyse der Zelle für Zelle Phänotypisierung bietet. Ähnliche Ergebnisse können erreicht werden, mithilfe von CellProfiler, eine Open Source Software für die Quantitative Analyse von biologischen Bilder22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Prof. David C. Hay ist Mitbegründer und Vorstandsmitglied von Stemnovate Limited.
Prof. David C. Hay ist ein Vorstandsmitglied von HigherSteaks Limited.

Unsere halbautomatische Verfahren ist effizient, zuverlässig und wirtschaftlich, so dass die Produktion von GLT im Maßstab (Abbildung 1). Nicht gab es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Anzahl der Zellen zwischen den Brunnen in der Platte, so dass diese Plattform einen geeigneten Ansatz für zellbasierte Screening (Abbildung 2). Darüber hinaus ermöglicht die Teilautomatisierung Workflow dem Benutzer, große Anzahl von Platten auf einmal zu produzieren, was vor der Verwendung manueller Prozesse5,12nicht möglich war.
Wichtig ist, der Automatisierungsprozess keinen Einfluss auf Differenzierung Erträge mit der Mehrheit der Zellen mit dem Ausdruck HNF4α (89,2 % ±2) und ALB (92,8 % ±6) (Abbildung 3). GLT auch ausgedrückt CYP P450-Enzyme CYP2D6 und CYP3A4 und CYP1A2 und CYP3A metabolische Aktivität vergleichbar mit früheren gemeldeten Experimente (Abbildung 3)5angezeigt. Trotz der Standardisierung des Protokolls ist Zelle Konfluenz vor der Differenzierung für reine HLC Differenzierung von entscheidender Bedeutung. Gewährleisten eine gute Zelle Verteilung über dem Brunnen ist daher ein wichtiger Aspekt (Abbildung 1). Dies erweist sich als um Zelllinie angewiesen zu sein, daher Zelle seeding und Dichte Optimierung ist erforderlich für jede Zelle Zeile vor dem Skalieren.
In seiner jetzigen Form dieser Plattform ist nicht geeignet, große Mengen an GLT für klinische Anwendungen zu produzieren, und dies wird wahrscheinlich durch den Einsatz von Zellfabriken und Bioreaktoren erreicht werden. Allerdings erlaubt die entwickelte Methodik für die schnelle Erzeugung von menschlichen Leberzellen für Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und/oder Drug repurposing Studien. Darüber hinaus ist der Test zu Multiplexen, erlaubt die Erzeugung von multiparametric Datasets für mechanistische Analyse. Geht nach vorn, glauben wir auch, dass diese Technologie auf komplexer in-vitro- Systemen wie 3D Differenzierung oder als Plattform zur Verbesserung der HLC Phänotyp in Vitroangewandt werden könnte.
Zusammenfassend glauben wir, dass unser einfaches und halbautomatische System experimentelle Durchsatz zu erhöhen und verringern experimentelle Variante, dadurch Verbesserung der Qualität der biologischen Datasets und ihre Extrapolation in Richtung der menschlichen Physiologie.

Primären humanen Hepatozyten (PHHs) entsprechen dem aktuellen Stand für die Leber biomedizinische Forschung. Trotz ihrer Vorteile darstellen PHHs eine begrenzte Quelle von Reifen Hepatozyten mit instabilen Phänotyp1. Humanen embryonalen Stammzellen (WSR) und menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) wurden als eine leistungsfähige Ressource für die biomedizinische Forschung, verspricht eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes, einschließlich Leber,2,3,4 vorgeschlagen . Aktuelle Hepatozyten Differenzierung Verfahren generieren Zellen, die Hepatozyten Marker, Gene und ähnliche PHHs3,4,5,6,7Funktionen ausdrücken, 8,9,10,11. Vor kurzem hat die Verwendung von definierten Materialien und Matrizen z. B. rekombinante Laminins, verbesserte Zelle Phänotyp und experimentelle Reproduzierbarkeit5,12,13,14.
Traditionellen Zelle Kulturtechniken beruhen stark auf manuelle pipettieren, das ist zeitaufwändig und fehleranfällig. Dies schränkt den Durchsatz der Test und das Plattenformat, mit denen man zusammenarbeiten kann. Bis heute sind die meisten Studien beschreiben die Generation der GLT arbeitsintensiv in der Natur und daher klein in Größe15,16,17.
Aktuelle Fortschritte in der Handhabung von Flüssigkeiten und pipettieren Systeme in Kombination mit automatisierten Mikroskopie und Labor-Analysatoren, haben es möglich gemacht, Verfahren zu entwickeln, die die Voraussetzung für menschliche Eingriffe zu minimieren. Wir haben diese Technologien zunutze gemacht und entwickelt eine halbautomatische Differenzierung-System, um große Mengen von menschlichen Lebergewebe für Basic und angewandten biomedizinischen Forschung. Dieser Ansatz kann mit menschlichen ESC und iPSC-Linien mit geringfügigen Anpassungen erforderlich, abhängig von der Zell-Linie durchgeführt werden. Kombinieren dieses System mit hoher Inhaltsanalyse, zeigen wir, dass HLC Phänotypisierung weniger zeitaufwendig und in Skala18,19,20,21durchgeführt werden kann.
Zusammenfassend hat die Automatisierung der Zelle Kulturtechniken, die hierin beschriebenen in Zuverlässigkeit, experimentelle Zeitmanagement und Assay-Durchsatz zu Verbesserungen geführt.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Menschlicher pluripotenter Stammzellen stellen eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Erzeugung von menschlichen Lebergewebe aus humanen embryonalen Stammzellen (HES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Aktuellen Differenzierung Verfahren generieren menschliche Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) eine Mischung von fetalen und adulten Eigenschaften anzeigen. Zur Verbesserung der Zelle Phänotyp haben wir vollständig definiert unsere Differenzierung-Verfahren und die Zelle Nische, was bei der Erzeugung von Zell-Populationen, die verbesserte gen-Expression und Funktion anzeigen. Während dieser Studien Fortschritt, wurde die Fähigkeit, große Mengen von Multi-well-Platten für das Screening von Arbeitskräften intensive Verfahren und Variation von Charge zu Charge beschränkt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine halbautomatische Plattform um pluripotente Stammzellen in GLT. Stem Cell seeding differenzieren und Differenzierung wurden mit liquid Handling und automatischen Pipettier-Systemen in 96-Well-Plattenformat durchgeführt. Im Anschluss an die Differenzierung war Zelle Phänotyp mit automatisierte Mikroskopie und ein Multi gut Luminometer analysiert.

Zelldifferenzierung erfolgte mittels einer embryonalen Stammzellen-Linie (H9). Die halbautomatische Plattform wurde verwendet, um zu unterscheiden und zu charakterisieren, die Zellen (Abbildung 1A). Ein automatisches liquid Handling-Dispenser wurde zur Matrix Mantel und Samen einzelne Zellen. Zellulare Unterscheidung wurde eingeleitet, wenn die Zellen 40 % Konfluenz (Tag 0) erreicht. Medien-Änderungen wurden mit eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem entfernen Medium und die Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser für mittlere Zusatz (Abbildung 1A) durchgeführt. Zelle Fixierung und Färbung wurden mit der automatischen Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser in Kombination mit der automatischen Platte Scheibe durchgeführt. Bildgebung und Quantifizierung wurden mithilfe eines High-Content-imaging-System und Columbus Software durchgeführt. Cytochrom P450 Aktivität wurde mit einem etablierten Assay gemessen. Nach substratinkubation Zelle Überstände geerntet wurden und Biolumineszenz aufgezeichnet mit einem multimode Mikrotestplatte Reader (Abbildung 1A). Darüber hinaus war konventionellen Phasenkontrastmikroskopie verwendet, um die Veränderungen der Zellmorphologie während Hepatozyten Differenzierung (Abbildung 1 b) messen.
Am Tag 18 war die Variabilität der Zellzahl zwischen Brunnen nach DAPI-Färbung (Abbildung 2A) untersucht. Sieben Sichtfelder wurden pro Brunnen und die Anzahl der Nukleonen quantifiziert (Abbildung 2A) erfasst. Wir haben keine statistischen Unterschiede zwischen den Brunnen mit einem Durchschnitt von 41.662 ±3 366 Zellen pro Bohrloch (Abb. 2 b) festgestellt.
Am 18. Tag wurden GLT behoben und gebeizt für typische Hepatozyten Marker (Abbildung 3A-G) und für CYP P450 Aktivität getestet. GLT ausgedrückt Hepatozyten Marker wie HNF4α (89,2 % ±2 positive Zellen), ALB (92,8 % ±6 positive Zellen), AFP (61,8 % ±2 positive Zellen). GLT auch CYP P450-Proteine, CYP2D6 und CYP3A4 ausgedrückt und eine eigene polygonale Darstellung angezeigt, dargestellt durch E-Cadherin-Protein-Expression. GLT CYP P450 Aktivität war am 18. Tag gemessen. GLT ausgestellt CYP1A2-Aktivität bei 295.906 ±45, 828 RLU/mL/mg Protein und CYP3A bei 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg Protein (Abbildung 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Hepatozyten Differenzierung von EAP in der 96 gut formatieren. (A). schematische Darstellung der Ausrüstung verwendet, um zellulare Unterscheidung Semi automatisieren, Fixierung, Färbung, imaging und funktionelle Aktivität. (B). Vertreter ändert in zellulären Morphologie bei HLC Differenzierung. Kurz gesagt, sind EAP zur endgültigen Entoderm, gefolgt von Hepatoblast Spezifikation gekennzeichnet durch Zellen anzeigen Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie und vor der Hepatozyten Reifung mit Zellen, die polygonale Form zu erwerben grundiert. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Abbildung 2: Beurteilung der GLT-Brunnen-Brunnen-Variabilität. (A) Darstellung der 96 Platte gut Ansicht der GLT mit DAPI gefärbt. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Quantifizierung der Zellzahl pro Bohrloch. Durchschnitt der Zellzahl pro Brunnen in Spalten (oben) und Zeilen (unten), aus sieben Bereichen Views pro gut und quantifizierte mit Columbus-Software. Durchschnittliche Handynummer über die Platte ist 41.662 ± 3.366 SEM Zellen pro Bohrloch. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden zwischen Wells beobachtet. Ein One-Way ANOVA mit Tukey Post-hoc-statistische Tests arbeitete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Hepatozyten Marker Ausdruck und CYP P450 Aktivitätsmessung in GLT am Tag 18. (A) der Anteil der Hepatozyten nuklearer Faktor 4 Alpha (HNF4α) Ausdruck ± SEM basiert auf dreißig Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (B) der Anteil von Albumin (ALB) Ausdruck + / SEM, basiert auf 3 separate Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (C) der Anteil der alpha-Fetoprotein (AFP) + / SEM basiert auf 3 separate Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (D) E-Cadherin Färbung. (E) CYP2D6 Färbung. (F) CYP3A4 Färbung. (G). Immunglobulin G (IgG) Färbung Kontrolle. Maßstabsleiste = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 und 3A Stoffwechselaktivität in GLT am 18. Tag. Die Daten stellt sechs biologische + / SEM Aktivität repliziert wird relative leichte Einheiten (RLUs) /mL pro 1 mg Protein zitiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Aufrufe.  University of Edinburgh. Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Serie: Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biologie

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

Integratives Protokoll zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten 3D-Organoiden der menschlichen Leber

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Immunologie und Infektion

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch bildbasierte ML-Strategie

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available PSC-to-functional cell differentiation systems are impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Precise control of cell differentiation in real time is therefore important. In this protocol, we describe a non-invasive and intelligent strategy that overcomes the variability in cell differentiation by using bright-field image-based machine learning. Taking PSC-to-cardiomyocyte differentiation as an example, this methodology provides detailed information for control of the initial PSC state, early assessment and intervention in differentiation conditions, and elimination of the misdifferentiated cell contamination, together realizing consistently high-quality differentiation from PSCs to functional cells. In principle, this strategy can be extended to other cell differentiation or reprogramming systems with multiple steps to support cell manufacturing, as well as to further our understanding of the mechanisms during cell fate conversion.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Differenzierung von PSC zu funktionellen Zellen mithilfe von ML-Modellen auf der Grundlage von Hellfeld-Bildgebung für leben

Available pluripotent stem cell (PSC)-to-functional cell differentiation systems are currently impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Here, using cardiac differentiation as the main example, we present a protocol to intelligently monitor and modulate the process of PSC differentiation based on image-based machine learning.

Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...