Este método pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para o câncer para analisar o DNA tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiplas alterações genéticas em regiões de mutações de cluster em uma única reação. Isso ajuda a salvar amostras preciosas de pacientes.
Este método pode fornecer insights sobre a carga tumoral em seu perfil mutacional. Agora também pode ser aplicado a uma análise molecular como uma alternativa ao qPCR para obter uma quantificação absoluta das sequências de alvo de ácido nucleico. Coletar amostras de sangue em tubos EDTA de sete mililitros.
Dois tubos são recomendados para coletar cerca de quatro mililitros de plasma. Centrifugar as amostras de sangue por 10 minutos a 820 vezes a gravidade dentro de três horas do sangue se rifar para separar glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plasma. O tempo entre a amostragem e a centrifugação é fundamental para obter DNA livre de células T de alto grau não contaminado com DNA liberado de glóbulos brancos.
Após a centrifugação, use uma pipeta sorológica para coletar o supernatante sem tocar na camada de glóbulos brancos. Cerca de dois mililitros de plasma são geralmente recuperados por tubo EDTA. Depois de transferir os plasmos para dois tubos mililitros, centrifufique as alíquotas a 16.000 vezes a gravidade por 10 minutos a 15 graus Celsius para remover detritos celulares.
Colete cuidadosamente o plasma sem perturbar a pelota e transfira para dois tubos criogênicos mililitros. Armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece adicionando 400 microliters de proteinase K a um tubo de 50 mililitros.
Em seguida, adicione quatro mililitros de plasma e 3,2 mililitros de tampão de lise ACL contendo um micrograma de RNA portador do kit de extração. Feche o tubo e misture por vórtice por 30 segundos para obter uma solução homogênea. Em seguida, incubar a 60 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, adicione 7,2 mililitros de ACB tampão ao lisato para otimizar a ligação dos ácidos nucleicos circulantes à membrana de sílica. Misture por vórtice por 15 a 30 segundos. Em seguida, incubar o tubo no gelo por cinco minutos.
Coloque a coluna e o extensor de 20 mililitros na bomba de vácuo. Feche as porções não utilizadas para permitir aspiração de vácuo. Depois de centrifugar brevemente o tubo, introduza cuidadosamente a mistura no extensor do tubo.
Em seguida, ligue a bomba de vácuo e deixe que o lisato seja desenhado completamente através das colunas. Remova e descarte o extensor do tubo. Em seguida, aplique 600 microliters de buffer ACW1 na coluna.
Quando o buffer ACW1 tiver desenhado através da coluna, adicione 750 microliters de buffer ACW2 e, finalmente, 750 microliters de 96 a 100% etanol. Em seguida, coloque a coluna em um tubo de coleta limpo de dois mililitros e centrífuga a toda velocidade por três minutos para eliminar o etanol. Depois de colocar a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros, abra a tampa e, em seguida, incubar a 56 graus Celsius por 10 minutos para secar completamente a membrana.
Após a incubação, coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação. Aplique cuidadosamente 36 microliters de água livre de RNase com azida de 0,04%. Em seguida, feche a tampa e incubar em temperatura ambiente por três minutos.
Centrífuga a toda velocidade novamente por um minuto para elutar os ácidos nucleicos. Em seguida, armazene a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece descongelando e equilibrando os componentes de reação à temperatura ambiente em um capô PCR limpo.
Em seguida, prepare uma mistura de 20 vezes de primers e sondas em RNase e água destilada sem Dnase com cada primer a 18 concentrações de micromolar e cada sonda em cinco concentrações de micromolar. Para todas as reações individuais do PCR, prepare uma mistura de amostras combinando 10 microlitros de duas vezes ddPCR Supermix, um microliter de 20 vezes primers e sondas misturam, e até 10 nanogramas da amostra de DNA em 20 microlitros de água destilada. Vórtice a mistura de reação completamente para garantir a homogeneidade.
E brevemente centrífuga para coletar conteúdo na parte inferior do tubo antes de dispensar. Insira o cartucho ddPCR no suporte e carregue 20 microliters de mistura de reação amostral nos poços médios do cartucho para geração de gotículas. Adicione 70 microliters de óleo gerador de gotícula nos poços inferiores.
Insira o cartucho com uma junta no gerador de gotículas. As gotículas serão produzidas nos poços superiores do cartucho. A aspire lentamente e suavemente 40 microliters das gotículas dos cartuchos e dispense em uma placa PCR de 96 poços.
Sele a placa PCR final com papel alumínio usando um selador de placa imediatamente após a transferência de gotículas para evitar a evaporação. Centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Execute uma amplificação convencional do PCR em um cicloviário térmico.
Quando a corrida estiver concluída, centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Após a amplificação do PCR, use o leitor de gotículas para contar as gotículas negativas do PCR e pcr seguindo as instruções do fabricante. A seguir, os resultados representativos obtidos durante as etapas de otimização do ensaio ddPCR de entrega.
Esta imagem mostra a detecção de DNA mutante e DNA selvagem em uma reação contendo DNA 100% mutante, DNA 5% mutante e DNA 100% selvagem. Esta imagem mostra exemplos de amostras de plasma analisadas com os ensaios de ddPCR de queda do KRAS e EGFR mostrando a detecção de nucleotídeos únicos e múltiplas substituições em exon dois de KRAS e uma exclusão em exon EGFR 19. Ao tentar este procedimento, é importante proceder cuidadosamente a cada passo com uma atenção especial na geração de gotículas, que é um passo crítico deste método.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e clínicos no campo da pesquisa sobre câncer otimizar a análise de mutação tumoral por meio de biópsia líquida.
