Este protocolo fornece uma alta produção e uma composição confiável para a análise NHEJ que pode determinar a prevalência e quantidade relativa de mutações indel em populações de mosquitos editadas por genes. Comparado com a próxima geração, ou sequenciamento Sanger, o DDPCR tem um tempo de reviravolta mais rápido para resultados, o que permite uma análise rápida e completa da variação genética para o campo para organismos geneticamente modificados. Este método deve ser geralmente aplicável a todos os sistemas experimentais.
Demonstrando o procedimento estará Thai Pham, um pesquisador da equipe do laboratório de Yang. Para começar, prepare 25 microlitros da gotícula digital PCR, ou mistura de amostras ddPCR adicionando super mix ddPCR, primers avançados e reversos, sondas HEX ou FAM, DNA e água nas proporções descritas no texto. Em seguida, misture completamente a reação com vórtice.
Usando uma pipeta multicanal de 50 microlitrais, carregue 20 microliters da amostra ddPCR na linha média do cartucho. Em seguida, use uma pipeta multicanal de 200 microlitrais para carregar 70 microliters do óleo na linha inferior sem gerar bolhas em toda a tubulação. Coloque a junta, tocando apenas as bordas, evitando o centro, área concavizada, e, em seguida, coloque a placa com segurança no gerador de gotículas e feche a tampa para iniciar a corrida.
Para transferir a mistura de imersão da linha superior do cartucho para a placa de 96 poços, use uma pipeta multicanal e solte 40 microliters de amostra líquida por três a cinco segundos em um ângulo de 30 a 45 graus. Em seguida, expulse a mistura para o poço lentamente por mais de três segundos em um ângulo de 45 graus, permitindo que ela caia do lado, e depois vá para a segunda parada da pipeta para expulsar o líquido completamente. Usando vedações de calor de folha, sele as placas por cinco segundos a 180 graus celsius.
Coloque a placa selada no termociclador e ajuste as condições de PCR para as diretrizes de queda do NHEJ, definindo a desnaturação inicial a 95 graus celsius por 10 minutos. Em seguida, defina 40 ciclos de 94 graus celsius por 30 segundos para a desnaturação, 55 graus celsius de um minuto para anneal, e 60 graus celsius por dois minutos para se estender. Após 40 ciclos, mantenha-se a 98 graus celsius por 10 minutos, e a espera final a quatro graus celsius.
Use uma taxa de rampa de dois graus celsius por segundo para todas as etapas. A temperatura de ressarção varia, de acordo com as sondas ou primer utilizados. Coloque a placa com segurança no leitor de gotas com o A1 bem rotulado no canto superior esquerdo.
Abra o programa e configure a placa designando o FAM como o canal de referência conhecido, e HEX como o desconhecido para cada poço. Em seguida, mude o nome para cada amostra. Execute o experimento de leitura de gotículas como quantificação direta enquanto salva o modelo.
Designe os parâmetros experimentais corretos para análise de software, ou seja, informações de amostra, super mix, nome do alvo, tipo de destino, canal de sinal um e canal dois. Em seguida, defina o limite para contagem de gotículas acima de 10.000 para resultados confiáveis. Em seguida, verifique a contagem de gotículas para cada poço na aba gotícula, garantindo que todos estejam acima de 10.000.
Por fim, verifique a amplitude 1D para obter uma separação eficiente do sinal dos negativos. No editor da placa, destaque toda a placa e defina o tipo de experimento para cair. Defina o alvo WT como referência, designando o canal um para fam e o canal dois para HEX.
Defina o alvo NHEJ como desconhecido, designando o canal um para fam e o canal dois como nenhum. Na guia de amplitude 2D, defina os limiares de cluster com as ferramentas de gráfico para cada amostra. A cauda é normalmente associada com o cluster WT para ensaios NHEJ.
Na guia de proporção, clique no ícone de engrenagem do canto superior direito do gráfico e selecione a abundância fracionária para traçar um ponto correspondente à porcentagem de eventos NHEJ. 15 diferentes amostras puxadas de 10 mosquitos cada continham vários alelos NHEJ, foram analisados e identificados utilizando o ensaio de queda, e os resultados mostraram que todas as 15 amostras carregavam 100% de alelos indel. Em outro experimento, 11 amostras retiradas de mosquitos do tipo selvagem e mosquitos NHEJ com diferentes percentuais NHEJ foram examinadas com este protocolo ddPCR.
Os resultados mostraram que o percentual identificado foi relativamente próximo à detecção de Indel pela técnica de análise de amplicon. Pipeta lentamente para evitar bolhas, e permitir que todas as gotículas emulsificadas escorressem pela parede dos poços.
