Esse método pode ser usado para responder a perguntas-chave na virologia da Hepatite B, como encontrar fatores celulares ou virológicos que afetam a integração do DNA do HPV. Há múltiplas vantagens nessa técnica. É relativamente barato, e fácil de realizar, a análise dos resultados é simples, e é muito sensível, até cópias simples.
Embora este método possa ser usado para fornecer informações sobre a integração do HBV, ele também pode ser usado para outros vírus que se integram ao genoma da célula hospedeira, como HIV, HTLV-1 ou HPV. Para infectar as células, sementes 200.000 células por mililitro em uma placa de doze poços, com 1 mililitro de D-mem. No dia seguinte, use a coluna Heparin purificada su-per-na-din do HEP-AD 38 como inoculante para infectar as células a 1.000 VGE por célula, em 500 microliters de meio de cultura.
Então, cultue as células a 37 graus Celsius. Então, no dia seguinte, lave as células duas vezes com um mililitro de estéril uma vez PBS. Em seguida, substitua o meio de cultura a cada 2 dias, até a colheita.
No dia 3 pós infecção, trate as células com 5 micromolar tenofovir desoproxil e 10 micromolars lamivudina para limitar a produção de intermediários replicativos HBV que são amplificados por PCR inverso. No dia 5, pós-infecção, triplize algumas células com 200 microliters de Trypsin EDTA e suspenda-as em 2 mililitros de D-mem contendo 5 micromolar Tenofovir disoproxil e 10 micromolar Lamivudine. Posteriormente, transfira as suspensões celulares para uma placa de seis poços, para induzir uma rodada de mitose.
No 7º dia pós infecção, trippsinize as células expandidas em 400 microliters de Trypsin EDTA e suspenda a mistura em 1 mililitro de D-mem. Em seguida, transfira a suspensão em um tubo de 1,5 mililitro. Pelota as células por centrifugação a 500 vezes G, por cinco minutos.
E remova o Su-per-na-din por aspiração. Extrair o DNA da cápsula celular usando um kit de extração de DNA, de acordo com a instrução do fabricante. Para inversão de DNA, aloque 1,5 a 2,5 microgramas do extrato total de DNA em um tubo PCR de 200 microliter.
Em seguida, adicione a quantidade apropriada de restrição do mix mestre da enzima para resultar em um microliter de volume de reação, contendo 1 vezes tampão de reação de digestão e 10 unidades NCO-1HF. Incubar a reação enzimática de restrição em uma máquina PCR a 37 graus Celsius por uma hora, para uma ótima eficiência de digestão. Em seguida, inativar a enzima de restrição incubando-a 80 graus Celsius por 20 minutos.
Transfira toda a reação da enzima de restrição para um tubo de 1,5 mililitro. Posteriormente, adicione 400 microlitadores de 1 vezes tampão de ligase de DNA T4 e 500 unidades de ligadura de DNA T4, e misture bem. Um grande volume de reação incentiva a ligadura intramolecular dos fragmentos de DNA digeridos.
Incubar a reação de ligadura à temperatura ambiente por 2 horas para garantir a ligadura completa. Após 2 horas, inative a liga ligase de DNA T4 a 70 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitres de 10 Sulfato dodedecyl de sódio para garantir a inativação completa da ligadura T4.
Adicione cloreto de sódio a uma concentração final de 100 milimil, e Dextran a uma concentração final de 90 microgramas por mililitro. Misture por vórtice de pulso e gire brevemente a mistura de reação. Em seguida, adicione 900 microliters de 100 etanol, e misture por inversão.
Precipitar o DNA a 20 graus Celsius negativo durante a noite. E pelota o DNA precipitado por centrifugação a 14000 vezes G por 15 minutos. Depois, remova o Su-per-na-dine por aspiração.
Lave a pelota com 500 microliters de 70 etanol. E centrifugação a 14.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, remova o Etanol por aspiração e seque a pelota de DNA à temperatura ambiente por 20 minutos.
Dissolva a pelota em 20 microliters de água e adicione 20 microliters de mistura mestre enzimada restrita para resultar em um volume de reação de 40 microliteres, contendo 1 vezes tampão de reação de digestão, 5 unidades BSIHK-1 e 5 unidades de SPH-1HF. Nest, incubar a reação enzimática de restrição em um bloco de calor a 37 graus Celsius, por 1 hora. Gire brevemente a mistura de reação, incubar a reação enzimática de restrição em um bloco de calor a 65 graus Celsius por 1 hora.
Neste procedimento, remova amplicons potenciais de uma vedação de tapete de silício reutilizável, usando uma solução de degradação de DNA. Enxágüe bem o tapete com água livre de DNA e o ar seque-o à temperatura ambiente. Em seguida, prepare um mililitro de 1 vezes mistura PCR contendo os primers externos para a frente e para trás a uma concentração de 0,5 micromolar.
Adicione 170 microliters se a mistura de 1 vezes PCR aos poços A-1 e E-1, em uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, adicione 120 microliters da mistura de 1 vezes PCR aos poços B-1 e H-1. Depois, adicione 10 microliters do DNA invertido aos poços A-1 e E-1.
Misture a reação em cada poço, em pipetando suavemente cada um, cerca de 10 vezes usando um conjunto P-1000 para 100 microliters. Diluir as amostras de poços A-1 para D-1, numa proporção de 1:3, transferindo 60 microlitadores a cada etapa. Misture os poços a cada passo, em pipetando-os suavemente cerca de 10 vezes usando um conjunto P-1000 para 100 microliters.
Evite formar bolhas, repita o procedimento para bem E-1, diluindo até bem H-1. Posteriormente, aloque 10 microlitadores da mistura de reação, usando pipeta multicanal, de Wells A-1, H-1, em poços A-2, H2, A-3, H-3 e assim por diante, até atingir os poços A-12, H-12 da placa de poço 96. Cubra a placa PCR com um tapete de silicone seco e pressione firmemente.
Em seguida, coloque a placa em uma máquina PCR e execute o programa indicado, antes de transferir a placa para a temperatura ambiente. Depois, aqueça os pinos de um replicador de 96 pinos para o vermelho-quente com um queimador Bunsen, em seguida, esfrie por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. Encha os poços de uma segunda placa PCR com 10 microliters de 1 vezes mistura PCR, contendo um buffer pronto para carga de gel, e o interior para frente e contra-invertido em 0,5 micromolar.
Remova cuidadosamente o tapete de silício da placa PCR da placa 96 da primeira rodada do PCR, e evite a contaminação cruzada entre os poços. Use o replicador refrigerado para transferir os produtos PCR da placa 96, desde pcr de primeira rodada até a recém-alocada placa de 96 poços. Realizar o PCR aninhado, utilizando a condição conforme indicado.
Para isolar os produtos PCR, analise-os por eletroforese de gel, utilizando uma placa de 96 poços, com gel 1.3 Agarose. Para um gel Agarose de 100 mililitros, corra a 200 volts por 10 a 15 minutos. Depois, extirem as bandas de DNA dos géis de Agarose, usando canudos descartáveis.
Para cada produto PCR, coloque a palha e o gel Agarose plug em um tubo de 1,5 mililitro, corte a palha ao tamanho com uma tesoura. Depois, ejete os plugues Agarose em cada tubo, apertando na extremidade do fragmento de palha. Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de extração de gel, e 5 microliters de contas de vidro de extração de gel em cada tubo.
Extrair os produtos PCR por instruções do fabricante para o kit de extração de gel, e diluir o DNA das contas com 30 microliters de água. Envie o DNA purificado para sequenciamento Sanger, com o primer dianteiro usado na segunda rodada aninhada PCR. Um exemplo de eletroforese de gel agarose de pcr inverso bem sucedido, antes e depois do isolamento do produto PCR, é mostrado aqui.
M representa o marcador de DNA último, cada linha de 12 representa as réplicas técnicas em uma única diluição na placa PCR. Neste caso, os produtos pcr únicos devem ser alcançados até a segunda ou terceira diluição de 1:3 de cada amostra. Nessas diluições, aproximadamente 50% dos produtos representarão verdadeiras junções de DNA de células do vírus.
Enquanto a outra metade representa amplificação dos intermediários de DNA HBV. Essa técnica permitiu aos pesquisadores explorar a integração do DNA do HPV em sistemas de infecção in vitro altamente controlados. Métodos adicionais, como análise biotemática, podem ser usados para responder a mais perguntas.
Por exemplo, se a integração do DNA do HPV ocorrer em regiões específicas do genoma celular. Não se esqueça que trabalhar com infecção O vírus da hepatite B pode ser perigoso e controles adequados de infecção, como armários de bio segurança e vacinação prévia, devem ser sempre tomados durante a realização desses procedimentos.
