DRW é suportado pelo NIH bolsas AI089972 e AI113217, e pela mucosa Estudos Imunologia Team, e detém um Prémio Carreira para médicos cientistas do Fundo Wellcome Burroughs.

NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> 1.000 vezes anti-CD40: obter do fabricante a 1,0 mg / ml, armazenar a 4 ° C. </li><li> Meios estimulação das células B: Para 425 ml de meio RPMI-1640, adicionar 75 ml de descongelado de fresco de soro fetal de vitelo (FCS), 10 ml de tampão HEPES 1,0 M, 5 ml de caldo de L-glutamina, 5 mL de Penicilina: stock de Estreptomicina, 5 ml essenciais Médio não-essenciais Aminoácidos jul (MAM-NEAA), e 3,5 mínimo de 2-mercaptoetanol. Mantenha o material a 4 ° C por até uma semana. Adicionar IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) imediatamente antes da utilizaçãoapenas com o volume de material necessário. </li><li> 2% de FCS em FACS Buffer: Adicionam-se 10 ml de FCS e 490 mL de PBS 1x. Mantenha a 4 ° C. </li><li> 2x solução de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solução estoque de tripsina-EDTA (tripsina 5,0 g, 2,0 g de EDTA por litro) em 20 ml de PBS 1x. Loja de tripsina-EDTA em 2x alíquotas trabalhando a 4 ° C. Deixa-se aquecer até à temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Soro fetal bovino: Manter FCS descongeladas a 4 ° C por até duas semanas. Colocar em gelo 15 min antes do processo de coloração citoplasmática. </li><li> Neutro-tamponada de formalina: Prepare uma solução de formol a 10% (3,7% de paraformaldeído). Formalin é tóxico e, portanto, lidar com ele sob uma fume hood laboratório enquanto usava EPI adequado. Formalina loja à temperatura ambiente em um armário de armazenamento de produtos químicos. </li><li> Metanol: loja metanol absoluto (100%) a -20 ° C até as células estão prontas para ser permeabilizadas. Note-se que o metanol é inflamável e deve ser armazenado em freezer apropriado. </li></ol> 2.Purificação e activação de células B <ol><li> A partir de um baço recém-colhida rato, preparar uma suspensão de células individuais, pressionando suavemente o órgão através de um filtro de células 70 um com o êmbolo de uma seringa de 3 ml. Num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, recolher as células em 10 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de células vermelhas do sangue tampão de lise durante 5 min. Neutraliza-se com 13,5 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> (Opcional) magneticamente separar as células B, utilizando anti-CD45R (B220) marcado com grânulos, seguindo o protocolo de purificação MACS acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Estimular as células B purificadas a 1,0 x 10 6 células / ml em meios aquecida a estimulação das células B contendo IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) durante 5 dias a 37 ° C. Comece com 8 ml de cultura divididos em dois poços de uma placa de cultura de 6 poços (4 ml cada). </li><li> Verifique culture diária para manter a 1,0 x 10 6 células / ml. Ajustar a concentração através da divisão em outras cavidades e a diluição da cultura com meio de estimulação das células B fresco contendo IL-4 e anti-CD40. </li></ol> 3. A tripsinização, Fixação e permeabilização <ol><li> Tripsinizaï¿½o <ol><li> Recolhe-se a 1,0 x 10 7 de células de cultura num tubo de 15 ml, centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, e decanta-se o sobrenadante. </li><li> Lava-se com 10 ml de PBS para remover a proteína residual a partir do suporte de recolha de células. Repetir o passo de centrifugação e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células no volume residual após decantação (cerca de 100 uL). </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 800 ul de 0,1% temperatura ambiente (2x) de tripsina-EDTA para as células. Dispensar lentamente num ângulo de 45 ° para o lado do tubo cónico. </li><li> Fechar o tubo e misturar suavemente pela inclinação do tubo de modo que o líquido corre ao longo do comprimento do tubo de tempo 5-6s. Um precipitado pegajoso, branco pode formar-se na solução. Limite o tempo de tripsinização para menos de um min. </li><li> Extingue-se a reacção tripsinização com 1 ml de FCS a frio. Dilui-se o FCS imediatamente por adição de 10 ml de PBS frio. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, depois decanta-se o sobrenadante e devolver os tubos em gelo. </li></ol></li><li> Fixação <ol><li> Ressuspender as células do volume residual, após decantação. Se necessário, levar o volume até 100 ml com PBS frio. </li><li> Numa hotte, adicionar 800 ul de solução de formalina tamponada neutra a 10% para as células e pipetar para cima e para baixo. O tubo vai aquecer após a adição de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilização <ol><li> Configurar um misturador de bancada vortex a uma velocidade agitação suave. </li><li> Desenhar 9 ml de frio (-20 ° C) de metanol em 10 ml de uma pipeta serológica. </li><li> Segurar o tubo contendo as células ao longo do misturador de vórtice e suavemente começar tremendog das células. </li><li> Adicionar metanol frio para o tubo assim que cai gota a gota sobre as células, enquanto o tubo está ainda agitação, de modo que o metanol é se mistura continuamente. Depois dos primeiros 2 ml de metanol a velocidade de distribuição pode ser aumentada para um caudal lento. </li><li> Deixe o tubo de sentar em gelo durante 30 min para completar a permeabilização. Alternativamente, as células podem ser armazenadas a -20 ° C durante até um mês. </li></ol></li></ol> 4. A fluorescência de coloração para IgG1 e IgE Classe Switching <ol><li> Amostra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos e decantar a solução de metanol. Um precipitado branco podem sedimentar com as células. </li><li> Adicionar 10 ml de 1x PBS temperatura ambiente e centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para lavar as células. Repetir uma vez. Nota: A lavagem do pellet com temperatura ambiente PBS dissolve precipitado extra que podem formar após o passo 4.1. </li><li> Realizar uma lavagem adicional com 10 ml de 2% FCS-tampão de FACS. </li><li> Distribuir amostras de 96 poços rodada placa de fundoe centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante e colocar a placa no gelo. </li><li> Mancha em 60 ul de tampão de 2% de FCS em FACS por poço com as seguintes diluições de anticorpos: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 de PE, 1: 600, FITC anti-IgE, 1: 100, Anti CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Após 5 min de coloração, lavar a placa com 150 ul de 2% de FCS-tampão de FACS e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Ressuspender em 400 ul de tampão de 2% de FCS em FACS e por meio de uma pipeta de 40 um coador de células de nylon para um tubo de 5 ml de FACS. </li></ol> 5. Use a Estratégia Gating seguir: <ol><li> Isolar CD45R (B220) células positivas da população de linfócitos jateamento localizado no / parcela SSC FSC (Figura 1). </li><li> A partir das células positivas B220, utilizar o lote de IgE e IgG1 para revelar as populações correspondentes. </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li><li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S&#181;+to+S&#949;+recombination.">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct S&#181; to S&#949; recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li><li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination.">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li><li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk.">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. 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IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li><li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo.">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li><li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies.">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li><li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE(+)+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition.">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li><li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgE(+)+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li><li>He, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE++B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response.">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li><li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI.">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li></ol>

The authors have no disclosures.

A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE 5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos 12 ou células B do baço como purificados 11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnétic...

Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 &#39;em cada conjunto de C H 1 s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação. IgE é um mediador chave da doença alérgica 2 e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH 3, mas pode ser muito elevado em estados de doença 4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE 5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE 7 endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE. Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos 9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:301px;">Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:343px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Mouse IgE FITC</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553415</td>
			<td>clone R35-72</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550083</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-4052-82</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">anti-Mouse/Rat CD40</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0402-85</td>
			<td>clone HM40-3</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Lifetechnologies (Corning)</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;">MACS CD45R (B220) microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MACS purification column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">IL-4</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>214-14</td>
			<td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Trypsin-EDTA Solution (10X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4174-100mL</td>
			<td>5.0g Trypsin, 2.0g EDTA&#376;4Na per Liter of 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100mL</td>
			<td>10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">2-mercaptoethanol (99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1140-17</td>
			<td>clone 1B4B1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HyClone Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;">B cell Stimulation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:343px;">B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,&#160; 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 &#181;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &#181;L/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.

Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente 11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura...

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Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K visualizações.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.