Os autores agradecem as contribuições de Greg Smith, Pomeranz Lisa, Matt Lyman, Eldridge Marlies, Staniszewska Halina Goraczniak, e os membros do laboratório Enquist in fine-tuning protocolo isso.

1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers <ol><li> Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV). </li><li> Quando as células são 95 - confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. Placas de rocha suavemente a cada 15 minutos para garantir que a monocamada de células permanece totalmente revestida pela inóculo do vírus. Enquanto isso, aqueça o meio para a próxima etapa. </li><li> Após uma hora de infecção, aspirado inóculo viral das placas, adicione 15 ml de meio quente, e incubar a 37 ° C por 12-20 horas em uma incubadora umidificada. </li><li> Prepare buffers LCM (ver Tabela 1) e rock durante a noite a 4 ° C para homogeneização da mistura. Prepare TNE para a ressuspensão de DNA viral (ver Tabela 2). </li></ol> 2. Segundo dia, Fase 1: Lise Celular e Ultracentrifugação <ol><li> Confirmar visualmente que a infecção de células causou efeito citopático uniforme (CPE). Permitir a infecção progredindo até que todas as células têm arredondado para cima, mas ainda não decolou no prato. </li><li> Raspe as células infectadas no meio, e combinar as células e médio em 50 ml tubos cônicos. O número de tubos cônicos necessários para esta etapa vai depender do número de pratos utilizados para a infecção no Passo 1.2 acima, por exemplo, um tubo de 50 ml cônica pode ser usado para pellet um máximo de 3 pratos de 15 ml de meio de cada Opcional:. Lave o placas com 10 ml de PBS e combinam com as células e médias empresas. </li><li> Células centrífuga e médio por 10 minutos a 2000 centifugal força relativa (RCF) em temperatura ambiente, em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS. Se o pellet de uma infecção viral foi espalhada em vários tubos cônicos na Etapa 2.2, estes podem ser recombinados em um tubo cônico nesta etapa. Repetir a centrifugação e aspiração Opcional:. Este pellet podem ser armazenadas a -20 ° C e do protocolo continuou em um momento posterior. </li></ol> 3. Segundo dia, Fase 2: Ultracentrifugação Mantenha o pellet celular e buffers LCM no gelo sempre que possível durante as etapas seguintes. <ol><li> Adicionar β-mercaptoetanol para 0% de glicerol - buffer de LCM. Começar a resfriar a ultracentrífuga (para o passo 3.9), definindo-a 4 ° C e ligar o vácuo. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 5 ml de glicerol 0% - tampão LCM até que não é mais clumpy. Se necessário, o tubo de vórtice para quebrar qualquer célula não dissolvido pellet. </li><li> Extrato, adicionando 1,5 ml Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vórtex vigorosamente. Imediatamente centrifugar por 10 min a 2000 rcf a uma temperatura de 4 ° C. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande furo (evitando a interface) e transferir para um novo tubo Opcional:. Se o pellet é um sólido gelatinoso, você pode rapidamente despeje a camada superior para um tubo novo. </li><li> Repetir a extracção Freon e centrifugar novamente. </li><li> Coletar a camada superior (~ 5 ml) e transferir para um novo tubo polyallomer ultracentrífuga. Adicionar β-mercaptoetanol para o glicerol dois restantes - buffers LCM. </li><li> Prepare um gradiente no tubo de ensaio polyallomer por underlaying o extrato Freon (camada superior) com 3 ml de glicerol 5% - LCM (camada intermediária), e depois underlaying novamente com 2,5 ml de glicerol 45% - LCM (camada inferior). Use uma pipeta fina para evitar o transbordamento do conteúdo do tubo. </li><li> Se necessário, prepare um tubo de equilíbrio equivalente usando as mesmas proporções de buffers LCM. </li><li> Transferência de tubos em baldes ultracentrífuga. Equilíbrio baldes para dentro de 0,1 g do outro, suavemente adicionando glicerol 0% extra - buffer de LCM para a camada superior (~ 5-10 mL de cada vez). </li><li> Usando uma ultracentrífuga frio com um rotor horizontal balde ou balançando, spin amostras equilibrada durante 1 hora a 77.000 rcf (por exemplo, 25.000 rpm para um rotor SW41Ti) a uma temperatura de 4 ° C. </li><li> Durante ultracentrifugação, fazer um gancho para capturar DNA de vidro flutuante na etapa de precipitação de etanol (4.6). Segure ambas as extremidades de uma pipeta Pasteur de vidro e suspender a parte do meio sobre uma chama. Quando uma seção de vidro é quase derretido, retire com cuidado para esticar o copo, dobre-o suavemente para criar um gancho bem anguladas (&lt;90 graus), e puxe bruscamente para selar o fim. Se a ponta do anzol de vidro está aberto, segure a ponta sobre a chama para que o vidro derrete o suficiente para a fechar. </li><li> Após a ultracentrifugação, você deve ver uma fina opaco pellet com uma mancha escura no meio. Aspirar cuidadosamente o líquido do tubo, incluindo drippings ao longo dos lados, mas evitando a pelota no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 0,5 ml TNE em temperatura ambiente. </li><li> Deixe o pellet sentar-se por pelo menos 10 minutos para permitir a hidratação do sedimento. Optional: O pellet também pode ressuspender em TNE durante a noite, se for mantida a 4 ° C. </li></ol> 4. Terceiro Dia: &quot;Ghost&quot; Precipitação DNA <ol><li> Quebrar o pellet por pipetagem com uma ponteira de pequeno calibre (por exemplo, um p200 ponta da pipeta). Não se preocupe com corte nesta etapa, porque o DNA viral ainda está contida em capsídeos neste momento. Adicionar os reagentes a seguir ao tubo contendo o pellet viral, à temperatura ambiente, para destruir capsídeos: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml SDS 10% </li><li> 2 mg de proteinase K </li></ul> Agite levemente para misturar estes reagentes. Deve haver um ligeiro aumento na viscosidade. </li></ol> Cuidado com corte a partir de agora, por exemplo, uso de grande calibre pipetas e não vortex o material viral <ol start="2"><li> Extrato de proteínas virais, adicionando 5 ml de fenol-clorofórmio e imediatamente começar a inverter ou vórtex para manter uma emulsão. Misture por 10 segundos, em seguida, centrifugar a emulsão de 5 minutos a 2000 rcf à temperatura ambiente. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande diâmetro, evitando a interface, e transferir para um novo tubo Opcional:. Use fase de bloqueio de gel (PLG) tubos nesta etapa para evitar a contaminação a partir da interface. </li><li> Repita a extração fenol-clorofórmio e centrifugar novamente. </li><li> Após a extração do fenol-clorofórmio segundo, coletar a camada superior em um vidro de 30 ml tubo Corex e descontrair o tubo a -20 ° C por 10-15 minutos, tomando cuidado para que não congela. </li><li> Adicionar 10 ml de etanol gelado, cobrir o tubo (por exemplo, que se estende um pedaço de Parafilm M sobre a parte superior), e inverta para misturar imediatamente. Assistir a um DNA &quot;fantasma&quot; para aparecer, que consiste de um precipitado ropy fina. Inverter o tubo suavemente para misturar mais e fazer com que o DNA sticky precipita a se agrupar. </li><li> Use um gancho de vidro para capturar o fantasma DNA (s). Cuidadosamente blot o DNA para remover o excesso de líquido, em seguida, coloque o gancho (ponta para baixo) em um tubo de 1,5 ml e deixar secar. Adicionar ,25-,5 ml de TE para dissolver o fantasma DNA. Permitir a ressuspensão de DNA para continuar por pelo menos uma hora. DNA armazenar a 4 ° C. Opcional: Para maximizar o rendimento de DNA, romper o gancho de vidro dentro do tubo de 1,5 ml, de modo que a ressuspensão fora os fragmentos de vidro podem continuar ao longo do tempo. </li></ol> 5. Resultados representante Com uma alta suficientemente MOI, as células devem atingir CPE total dentro ~ infecção pós 18 horas (hpi) para as estirpes do tipo selvagem PRV, e ~ hpi 24 para tipo selvagem HSV-1 amostras (Figura 1). Uma vez que o pellet celular infectado é colhido, os passos do protocolo restante pode ser completa em um dia inteiro ou realizadas durante dois dias (Figura 2). Ao preparar anzóis de vidro para capturar o fantasma DNA, é importante fazer o ângulo de gancho ser inferior a 90 graus, para que mais tarde pode caber na base de um tubo de 1,5 ml (Figura 3). Vedação a ponta deste gancho impede a perda de DNA no interior da pipeta. Fantasmas DNA formam durante a etapa de precipitação e vai aparecer como o branco, threads ropy (Figura 4). Estes agregados e ficar uns aos outros e / ou o gancho de vidro usado para capturar o DNA. Assim, o gancho mesmo vidro pode ser usado para juntar vários segmentos de DNA a partir da solução de precipitação. <table border="1"><tbody><tr><td> Escolha coluna com base no volume desejado: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> KCL 1M </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 ml </td><td> 450 mL </td><td> 600 mL </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 </td><td> 10 ml </td><td> 15 mL </td><td> 20 l </td><td> 40 mL </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol (adicione imediatamente antes da utilização) </td><td> 4,3 mL </td><td> 6,5 mL </td><td> 8,6 mL </td><td> 17,2 mL </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Use proporções nas pesquisas de glicerol por cento desejado (0, 5 ou 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glicerol </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> água </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> Glicerol 5% </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Receitas para a preparação de buffers LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Para 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ml de EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Para 1 volume L </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O para 1L </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Preparação de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> Figura 1. Células PK15 (A) antes da infecção, (B) no meio de infecção, e (C) no efeito citopático (CPE), depois de uma multiplicidade de infecção. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> Figura 2. Visão geral do protocolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> Figura 3. Três exemplos representativos de vidro ganchos utilizados para recolher os fantasmas DNA viral. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplo representativo de uma bem-formados e abundantes de DNA &quot;fantasma&quot;.

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. 4 Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. 7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique com sua instituição, para obter orientações sobre o descarte adequado de resíduos contendo Freon, ou ver Mendez et al. de alternativas Freon potencial 9. </td></tr><tr><td> Bloqueio fase de tubos de gel, capacidade de 15ml Pesada </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga tubos Polyallomer </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecione tubos apropriados para o seu próprio ultracentrífuga, que são incluídas apenas como exemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 células </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. 1,2, 3 Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. 4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de 260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections. Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 6 células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. 6 Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm). Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K visualizações.  Princeton University. Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.