Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa da doença de Alzheimer, especialmente os primeiros eventos envolvidos no colapso do cone de crescimento. A principal vantagem dessa técnica é possibilitar visualizar e analisar cones de crescimento axonal imediatamente após o tratamento beta amiloide. Comece usando micro-tesouras para picar cortices cerebrais recém-isolados de camundongos embrionários no dia 14 em meio de cultura de neurônios sem antibióticos.
Recolher os tecidos e centrifugar os tecidos em 87G por três minutos. Após a centrifugação, remova o supernasce e adicione dois mililitros de 0,05% de trippsina à pelota. Incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius e misturar tocando a cada cinco minutos.
Após 15 minutos, adicione quatro mililitros de médio A para neutralizar o trypsin e misture tocando. Em seguida, centrifugar os tecidos a 178 vezes G por três minutos. Depois de remover o supernante, adicione a solução inibidora de DNAse e de experimentação de soja e incuba por 15 minutos a 37 graus Celsius com a mistura a cada cinco minutos como antes.
Quando o tempo de incubação estiver decorrido, adicione quatro mililitros de A.Mix médio e centrífuga como antes. Depois de remover o supernaspe, adicione quatro mililitros de médio A e tritura os tecidos com uma pipeta Pasteur polida até que nenhum detrito seja observado. Em seguida, filtre os tecidos triturados com malha do tamanho de 70 mícrons.
Após a filtragem, conte as células com um hemótmetro e calcule a densidade celular. Pipeta 0,8 vezes 10 para a quarta célula em média A em cada poço de um slide de cultura de oito poços. Em seguida, incubar em uma atmosfera umidificada de 10% de CO2 a 37 graus Celsius.
Após quatro horas de cultivo, mude a cultura de meio para médio B.A pureza dos neurônios que utilizam este método é de aproximadamente 75% Inicie este ensaio com pelo menos uma semana de antecedência, abrindo um frasco fresco de um beta 42 de comprimento completo obtido comercialmente e dissolvendo o conteúdo em água estéril e destilada para uma concentração de 0,5 mililitro. Incubar a 37 graus Celsius durante sete dias para induzir agregação e toxicidade. Prepare alíquotas de A beta 1-42 agregadas e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso.
No quarto dia da cultura neuronal, trate os poços com 100 microlitres de 0,5 micromolar agregado A beta 1-42 ou solução de veículo em média B por uma hora como demonstrado anteriormente. Após a hora de passar, remova o meio de cultura e fixe imediatamente os neurônios com 4% de paraformaldeído contendo 4% de sacarose em PBS por uma hora a 37 graus Celsius em uma placa quente. A fixação é mais importante, pois manter a forma dos cones de crescimento é fundamental para este protocolo.
Após a fixação, lave os neurônios três vezes com PBS. Em seguida, depois de remover a câmara, monte os neurônios com um meio de montagem aquoso. Seque o meio de montagem a quatro graus Celsius por dois a quatro dias.
Capture toda a área de cada poço com uma lente objetiva seca de 20X em um microscópio invertido. Capturar e analisar toda a área em cada poço é importante para evitar a subjetividade. Classifique os neurites mais longos de cada neurônio no estágio três ou quatro como axônios.
Cones de crescimento axonal que não têm lamellipodia ou possuem menos de três filopodias são considerados cones de crescimento em colapso. Um beta 1-42 oligômeros, mostrado aqui antes da incubação, agregado após sete dias de incubação a 37 graus Celsius. Após o tratamento com um beta 1-42 agregado, imunosmunhagem com um anticorpo para o oligômero tóxico de A beta mostra manchas positivas em vermelho em um beta 1-42 neurônios tratados, mas não neurônios tratados com veículos.
Os primeiros fenômenos induzidos pelo tratamento beta 1-42 foram analisados após quatro dias na cultura. Os axônios identificados foram confirmados como tal por imunostaining positivo para o marcador axonal tau-1 mostrado em imunostaining vermelho e negativo para o marcador dendrático, MAP-2, mostrado em verde. Após uma hora de tratamento veicular, cones de crescimento se espalharam lamellipodia e várias filopodia.
Estes foram identificados como cones de crescimento saudável. Por outro lado, uma hora de tratamento beta 1-42 levou a cones de crescimento encolhidos, que não desenvolveram lamellipodia ou filopodia. Estes foram identificados como cones de crescimento em colapso.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fixar as células com 4%PFA e 4% de sacarose a 37 graus Celsius para o meu-nor-idge este protocolo de fixação na melhor das hipóteses. Seguindo este protocolo, outro método como imagens de células vivas e transfecção genética pode ser realizado para responder a perguntas adicionais como quando e como os cones de crescimento do axônio são colapsados e como os cones de crescimento colapsados são recuperados.
