Este artigo descreveu um método simples para avaliar o ferimento em um sistema de modelo de cultura de órgãos tridimensional e multicelular. Fazemos isso usando olhos de porco, mas mesmo que você não esteja familiarizado com os olhos, você pode fazer este ensaio. Como visão geral, recebemos olhos suínos, cortamos os globos, fazemos uma ferida circular na córnea que passa pelo epitélio e cerca de um terço do estroma.
Cortamos a córnea, montamos em uma base de Ágar, e colocamos essa construção na incubadora. O tecido vai preencher a criação de uma cicatriz na córnea. Você não precisa adicionar nenhum fator de crescimento, ou mesmo soro.
Isso é feito em mídia sem soro. Embora isso seja realizado na córnea, pode ser usado como um sistema modelo de cicatrização fibrosa em geral. Como muitas das vias celulares que são ativadas durante as cicatrizes são semelhantes entre os sistemas.
Em um capô de biossegurança, use uma lâmina cirúrgica de borda reta para remover o globo da tampa em uma tábua de corte limpa por etanol, e remova o excesso de tecido gorduroso de cada olho. Segurando o globo limpo posteriormente com fórceps imediatamente mergulham o olho na PBS seguido de três mergulhos rápidos em iodo de 10%, e dois mergulhos rápidos na PBS. Em seguida, enrole o olho circunferencialmente com um tecido de laboratório limpo para envolver com pressão suficiente para alcançar uma superfície córnea esticada sem entrar em contato com a córnea.
Usando uma trefina de seis milímetros, penetre o epitélio no estroma anterior no centro da córnea sem fazer uma ferida de espessura total através de toda a córnea, e gire a trefina 180 graus no sentido horário e anti-horário cinco vezes, aplicando pressão leve para aprofundar a ferida. Quando a ferida estiver profunda o suficiente para permitir que um retalho de tecido seja levantado com fórceps, use uma lâmina cirúrgica para cortar o retalho paralelo ao globo enquanto continua a levantar a córnea anterior dentro da margem da ferida. Quando toda a aba tiver sido removida, uma ferida circular deve ser localizada no centro da córnea.
Para colher a córnea segure o olho com o tecido de laboratório, e use uma lâmina cirúrgica para fazer uma pequena incisão a um milímetro de distância da borda da córnea para incluir o limbus e a coleta de tecidos. Usando uma tesoura pequena e afiada, continue a incisão ao redor do globo mantendo uma margem milimétrica através da córnea para manter o limbus em tato. Em seguida, coloque a córnea, de lado para baixo, em um prato de 60 milímetros, ou 100 milímetros contendo um mililitro de PBS.
Para montar a córnea, use dois pares de fórceps para segurar o lado epitelial da córnea para criar um copo, e use uma pipeta de transferência estéril para adicionar solução de ágar aquecido na córnea até que o copo esteja cheio. Depois que o ágar endurecer, coloque cuidadosamente a córnea em uma nova placa de 60 milímetros para baixo e cubra a placa com uma tampa. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio sem soro suplementado a cada placa de córneas mantendo as córneas em uma interface ar-líquido na borda limbal em uma incubadora de cultura celular a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono, e molhando as superfícies córneas uma vez por dia com uma gota de meio sem soro suplementado do meio condicionado na placa para manter os tecidos hidratados.
Para knockdown genético, misture cinco microliters de pequena interfering ou siRNa com 50 microliters de meio essencial mínimo de soro reduzido e dois microliters de reagente transfeccionado. Com 50 microliters de meio soro reduzido por córnea. Após cinco minutos, misture as duas misturas e adicione 200 microliters de meio mínimo de soro reduzido a cada mistura de siRNA.
Em seguida, pipeta as soluções siRNA caem sábio em cada ferida. Em seguida, coloque as córneas na incubadora. Após três horas, use o meio em cada prato para lavar o siRNA das superfícies da córnea, e substitua o meio condicionado em cada prato por meio livre de soro fresco mais antibióticos.
Em seguida, devolva as culturas córneas à incubadora de cultura celular, e incubar por duas semanas. Seis horas após o ferimento, o epitélio da córnea está ausente. Seis dias após o ferimento, o epitélio renasce.
Fluorescência amino coloração com actina muscular suave alfa revela um gradiente de miofibroblasts ativos ao longo da margem da ferida do estroma anterior para posterior. A coloração imuno-histoquímica para a actina muscular suave alfa revela um aumento dramático na expressão de proteína de actina muscular suave alfa em lesões, além de controlar córneas siRNA. Comparado com siRNA de proteínas não enroladas e alvo tratadas, córneas feridas.
Da mesma forma, a fibronectina extra domínio A é regulada em córneas tratadas pelo siRNA em comparação com córneas feridas não enroladas e de proteínas alvo tratadas com córneas feridas. Demonstrando um sucesso na proteína alvo. Além disso, o tratamento das córneas feridas com a toxina que não tem como alvo especificamente a proteína alvo previne a re-epitelialização e resulta em morte celular qualitativa, uma matriz desorganizada e vacuoles estrogonais sugerindo que a toxina não promove a cicatrização na concentração avaliada.
Em conclusão, ao tentar este procedimento é importante lembrar de manter a lâmina paralela ao tecido durante o corte, para que não penetre no globo. Diferentes técnicas de wounding podem ser empregadas com este ensaio, incluindo queimadura química ou raspagem epitelial. Também pode ser usado para ensaios de toxicidade de drogas para determinar se o epitélio cura e a que taxa.
Trata-se de um sistema de modelo de cultura de órgãos que pode preceder seus estudos de cura de feridas in vivo.
