We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

Declaração de Ética: Os olhos utilizados neste estudo foram utilizados de acordo com a Declaração sobre a abertura em Pesquisa Animal: 1 Fabricação de PLGA biodegradáveis ​​Membranas Equipado com microbolsas <ol><li> As estruturas de anel foram criadas por uma combinação de técnicas de electrospinning microstereolithography e 31. Em essência, o processo pode ser resumido em duas partes (i) a criação de modelos PEGDA por microstereolithography e (ii) para os modelos de electrospinning para a reprodução da estrutura subjacente PEGDA (neste caso um anel microfabricado). Estes dois passos são descritos em detalhe abaixo (Figuras 1 e 2). <ol><li> A fabricação de moldes PEGDA por microstereolithography (microSL) <ol><li> Fabricar os anéis utilizando um modelo de duas camadas, com a primeira camada (L1), sendo a base da estrutura e a segunda camada (L2) apresentando 6 microbolsas com Morphologi ferraduraes em uma gama de tamanhos de 300-500 uM. O fabrico dos anéis PEGDA foi recentemente descrito por este grupo de 22. <ol><li> Criar L1, desenhando um círculo de 1,2 centímetros preto usando um programa de desenho adequado. </li><li> Criar L2, da mesma forma, mas incluem 8 estruturas em forma de ferradura branco 0,5 x 0,35 milímetros. Distribua as pequenas formas de ferradura brancos dentro da estrutura de círculo. </li><li> Salvar L1 e L2 em formato JPEG. </li></ol></li><li> Em um frasco de vidro escuro, mistura de polietileno glicol diacrilato (PEGDA, Mn = 250 g / mol), com 1% w / w canforquinona, um fotoiniciador, em um agitador magnético durante 20 min. </li><li> Expandir o feixe de laser do microstereolithography set-up usando um arranjo de lentes telescópicas e depois projetá-la em um computador programável dispositivo multimirror digitais (starter kit DMD permitiu-UV). NOTA: A DMD reflecte a imagem (neste caso, um anel) para um espelho através de um tubo de lente de comprimento focal 10 cm. A imagem é, então, dirigido pela prata-coated espelho para um frasco contendo o polímero fotoendurecível (PEGDA). </li><li> Ajuste e limpe cuidadosamente a ótica da microstereolithography configurar. </li><li> Colocar 300 mL da mistura PEGDA em um poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos. Certifique-se os poços são pré-revestidos com Teflon ou outro material anti-aderente para facilitar a remoção da estrutura depois do endurecimento. </li><li> Ligue o laser azul (MBL-III 473 nm e 150 mW) e fazer o upload L1 no software ALP3-base anteriormente instalado no PC. Irradiar a primeira camada de 60 seg. NOTA: ALP3-básico é uma interface USB que permite a ligação entre o PC eo dispositivo micromirror Digital. </li><li> Adicionar ao poço 250 ul mais do PEGDA, carregar L2, tal como descrito acima e irradiar L2 durante 60 seg. </li><li> Remover o polímero não curado e lava-se com isopropanol o anel de O / N. </li></ol></li><li> Fabricação de membranas biodegradáveis ​​PLGA usando electrospinning NOTA: Os anéis PEGDA foram utilizados como moldes sobre o qual PLGA foi electrospun com o PLGA reproduzir a topografia subjacente, uma vez que é girada sobre estes modelos. Depois de girar, a folha de polímero PLGA foi descascada do coletor. A membrana última PLGA não continha os anéis PEGDA que ficaram ligados ao coletor metálico. <ol><li> Distribua os anéis PEGDA sobre uma folha de alumínio galvanizado (12 cm x 20 cm) para a criação de um colecionador electrospinning estática. </li><li> Conecte os anéis com fita condutora de carbono. NOTA: Estes anéis, uma vez formados podem ser re-utilizados como modelos para electrospinning. </li><li> Preparar a solução de polímero para a fiação. Dissolve-se o PLGA (50/50 DL-lactido (52 mol%): glicolido (48 mol%), 44 kg / mol) em diclorometano (DCM), a 20% w / w de concentração. </li><li> Mexa O / N antes do uso. </li><li> Seringas Place 4 de insulina (sem corte, agulhas 0,8 centímetros de diâmetro interno ended) em uma bomba de seringa. NOTA: Quatro seringas assegurada electrospinning mais rápido do que trabalhar com uma seringa. </li><li> Carregar 2,5 ml de uma solução de PLGA em cada seringa. </li><li> Electrospin usando uma taxa de fluxo de 30 mL / min e tensões que variam de 12 a 15 kV. Deixe uma distância entre as agulhas e o coletor de 15 cm. </li><li> Electrospin por 1 hora e 30 minutos e, finalmente, retire com cuidado a folha electrospun PLGA do coletor apoiar os anéis PEGDA. </li><li> Corte os andaimes electrospun em 22 círculos mm de diâmetro usando um furador circular e deixando a estrutura do anel posicionado no centro. </li></ol></li></ol></li></ol> Armazenamento 2. longo prazo de PLGA microfabricados Membranas Nota: Os anéis de PLGA foram fabricados e esterilizados por empresas externas credenciadas; As amostras foram irradiadas a uma gama de dose de 25-40 kGy externo. <ol><li> Monte a membrana em um pequeno recipiente (de plástico placa de Petri) e coloque-o dentro de um saco de grau médico. </li><li> Use papel de filtro para criar pequenos sacos de filtro para os dessecantes. To criar as malas, dobre o papel de filtro (125 mm de diâmetro) e cortar o semicírculo resultando em metade; em seguida, selar as pontas com fita adesiva. <ol><li> Encha três sacos de papel de filtro com 1 g de sílica de laranja, de cobalto (II), cloreto de cobre e (II), sulfato, respectivamente. </li><li> Coloque as três bolsas do dessecante no interior do saco de grau médico, juntamente com a membrana electrospun. </li></ol></li><li> Adicionar ao saco de seis ponto cartão indicador de umidade disponível no mercado para detectar qualquer acúmulo de umidade durante o período de armazenamento. </li><li> Use uma máquina de vedação de calor de vácuo para aspirar e feche o saco. </li><li> Envie as membranas anel para uma empresa externa para γ-irradiação. </li><li> Armazenar γ irradiados membranas de PLGA em uma ampla gama de temperaturas de -20 ° C a 37 ° C num ambiente húmido dentro de uma incubadora com 5% de CO 2. </li><li> Armazenamento Post, examinar o indicador de umidade para confirmar que o nível de umidade está abaixo de 30%. </li><li> Use Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para avaliar a integridade da fibra. </li></ol> 3 Isolamento de explantes de limbo Coelho explantes limbo foram isoladas de olhos de coelhos (obtidos a partir de uma fazenda onde os coelhos são criados para o consumo). <ol><li> Desinfetar os olhos de coelhos utilizando solução anti-séptica (3%). </li><li> Limpe os olhos, removendo qualquer excesso de tecido ao redor da córnea. </li><li> Separa-se a região do limbo (identificado como uma fina área circular entre a córnea (transparente) e a esclerótica (o branco)) a partir do restante da córnea utilizando um microscópio de dissecção. </li><li> Corte em segmentos (cerca de 1,5 cm de comprimento) sob o microscópio de dissecação. </li><li> Desinfectar os segmentos do limbo em solução de anti-séptico 1,5% durante 1 min. </li><li> Corte os segmentos do limbo em pedaços pequenos (100-500 um) com uma lâmina de bisturi. </li><li> Armazenar os pequenos pedaços de tecido em meio de cultura (DMEM + Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1), 10% de soro fetal bovino, 1 U / ml de penicillin, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina, 10 ng / ml de EGF, e 5 ug / ml de insulina), a 37 ° C e 5% de CO 2 até à sua utilização (não mais do que 60 min). </li></ol> 4. crescimento de células do limbo explantes Coelho explantes límbicas foram colocadas em ambas as membranas e membranas microfabricados recentemente fiadas e que foram armazenados durante 6 meses a -20 ° C e embalada no vácuo. <ol><li> Revestir as estruturas de anel com 15 ul de cola de fibrina (1: 1 mistura de fibrinogénio a partir de plasma humano a uma concentração de 18,75 mg / ml e trombina a partir de plasma humano a uma concentração de 2,5 U / ml) usando um raspador de células para a distribuição de fibrina uniformemente. </li><li> Colocar os explantes de tecido directamente nas microbolsas PLGA utilizando uma agulha 25 G e um microscópio de dissecação. </li><li> Adicionar meios de cultura de células muito cuidado para não separar os explantes. <ol><li> Mudança de mídia a cada 3 dias (receita media descrito na seção 3.7) e keep em cultura durante 2 semanas a numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Corrigir as amostras com 3,7% de formol tamponado por 10 min, seguido por 3 lavagens com PBS. </li><li> Contracoloração por incubação em 1 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou iodeto de propídio (PI), durante 10 min à TA. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS e armazenar as amostras cobertas com folha de alumínio. </li><li> Imagem das amostras utilizando um microscópio de fluorescência em comprimentos de onda de 543 nm e 800 nm (dois fótons). </li></ol> 5.-setting up Coelho Ferido Models Córnea 3D <ol><li> Limpar e desinfectar os olhos de coelhos, como descrito acima. </li><li> Wound os olhos do coelho por imersão em hidróxido de amónio a 0,14% durante 5 min. </li><li> Lave os olhos em PBS e raspar o epitélio com uma faca sclerotome. </li><li> Cortar e isolar o botão córnea-escleral remover qualquer tecido remanescente. </li><li> Coloque as córneas lado epitelial para baixo emum copo estéril e enchem com 0,5% de agar em meio DMEM. </li><li> Uma vez definido, colocar as córneas lado epitelial para cima, em pequenas placas de Petri e adicionar meios de cultura (receita descrita acima) até a área do limbo. NOTA: Não cubra toda a córnea; manter a cultura de órgãos na interface ar-líquido. </li></ol> 6 Isolamento de limbo explantes e Inclusão de Anel Andaimes em Coelho Modelos Córnea 3D <ol><li> Revestir as membranas de anel com 15 ul de cola de fibrina (1: 1 mistura de fibrinogénio a uma concentração de 18,75 mg / ml e a trombina a uma concentração de 2,5 U / ml) .use um raspador de células, tal como descrito acima. </li><li> Colocar os explantes de tecido directamente nas microbolsas PLGA utilizando uma agulha 25 G e um microscópio de dissecação. </li><li> Colocar os anéis com os explantes de tecido sobre as córneas desnudadas com os explantes virados para cima e em condições de interface ar-líquido. (Estas condições foram anteriormente descritos 22). </li><li> Manter os modelos de cultura de órgão para4 semanas em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias. </li></ol> 7 Avaliação da córnea Regeneration and Stem Manutenção celular <ol><li> Após 4 semanas, corrigir as córneas usando 3,7% de formaldeído. </li><li> Processar as córneas para histologia convencional para produzir 6 um parafina. </li><li> Mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E). </li><li> Para imunocitoquímica, dewax as secções em xileno (3min) e re-hidratados em etanol a 100% (1 min), etanol a 70% (1 min), e água destilada (2 min). </li><li> Delinear as seções usando uma caneta Dako para delimitar áreas pequenas e evitar o uso excessivo de anticorpos. <ol><li> Tratar as áreas delimitadas com tripsina a 0,05% (100 mL) durante 20 min (37 ° C). </li></ol></li><li> Lavar cuidadosamente com PBS e adicionar 100 ul de soro de cabra a 10% (de bloqueio) durante 1 hora. </li><li> Incubar as amostras com 100 uL de anticorpo monoclonal de rato cytokera3 estanho (CK3) e 100 ul de p63 no soro O 1% de cabra / N, a 4 ° C. </li><li> Lavar com PBS e trata-se com 100 ul de anticorpo anti-ratinho secundário biotinilado (1: 1000 em 1% de soro de cabra) durante 1 h à TA. </li><li> Adicionam-se 100 ul de estreptavidina-FITC (1: 100 em 1% de soro de cabra), durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Tratar as amostras com DAPI como descrito acima. </li><li> Imagem das amostras utilizando um microscópio de fluorescência em comprimentos de onda de 800 nm (dois fótons) e 488 nm. </li></ol>

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J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este estudo descreve (a) uma técnica para a fabricação de membranas electrospun contendo microestruturas dentro deles e (b) a preparação de tais membranas para utilização clínica de embalagem por vácuo, e, em seguida, a irradiação gama de armazenamento antes da sua utilização. Nesta aplicação particular temos desenvolvido membranas de PLGA contendo microbolsas que imitam as características físicas dos nichos de células-tronco do limbo. Os objetivos deste estudo são: (i) para descrever métodos para fornecer leitores com o conhecimento necessário para projetar e fabricar andaimes contendo microfeições para a investigação sobre a contribuição de nichos de células-tronco para regeneração de tecidos e (ii) para fornecer ao leitor uma melhor compreensão de forma a armazenar andaimes electrospun por longos períodos de tempo. Em termos de aplicação clínica, o armazenamento das membranas anel é de suma importância. Neste trabalho, a degradação do anel foi estudada ao longo de um período de 6 meses. Degradação domembranas é impulsionado por hidrólise tão simplesmente mantendo as membranas umidade sem o processo é interrompido. Blackwood et al. Relataram que através da variação da proporção de PLA em PGA, a degradação da membrana muda 32. Este estudo também demonstrou que, ao aumentar a quantidade de AGP, a taxa de degradação das membranas electrospun in vivo aumentada 22. Aqui demonstrou-se que, com a embalagem a vácuo das membranas, juntamente com alguns dessecante e irradiando-os e armazenando-os a temperaturas baixas durante 6 meses, não há nenhuma mudança na integridade das fibras e degradação. No momento, seis meses é o máximo que temos estudado com estas membranas contendo microbolsas mas os dados de armazenamento de um ano tem sido relatada em membranas electrospun simples a -20 ° C 22 e agora temos dados inéditos para o seu armazenamento a -20 ° C para 2 anos sem quaisquer sinais de degradação. Assim, para o armazenamento de longo prazo seria recomendável para armazená-los seco a -206; C, mas é possível armazená-las à temperatura ambiente, mesmo na Índia há pelo menos 6 meses (possivelmente muito mais tempo). A inclusão de um indicador de umidade dá uma forma fácil de verificar que a embalagem tem mantido membranas secas, caso em que será adequado para o efeito. Transferência de células desses anéis para modelos 3D de córnea foi mostrado ao colocar explantes limbo dentro dos microbolsas. Este grupo informou recentemente a transferência de células em um modelo de córnea de coelho in vitro, colocando explantes em membranas de PLGA simples (membranas sem estruturas de anéis) 24. Utilizando a presente andaimes microfabricados transferência de células foi dado mais um passo que podemos agora localizar especificamente explantes de tecido dentro das microestruturas. A capacidade de colocar os explantes directamente dentro dos nichos também permite que o cirurgião utilize as membranas directamente no teatro cirúrgico evitando a necessidade de uma sala de limpeza para a primeira expandir as células estaminais do limbo. Embora este pedaço de work tem sido focada no desenvolvimento de dispositivos para a doença da córnea, esta tecnologia microfabricação também pode ser aplicada para desenvolver dispositivos para diversas outras aplicações. Trabalho futuro explorar a fabricação de construções para a regeneração de outros tecidos, tais como pele e osso. Enquanto a concepção e fabrico inicial das microestruturas PEGDA pode ser demorado, uma vez fabricadas as estruturas pode ser reutilizado muitas vezes sem degradação. Portanto, a fabricação posterior de membranas biodegradáveis ​​PLGA microestruturada por eletrofiação pode ser realizada a uma taxa comparável à produção de (&#39;não estruturados&#39;) membranas planas após a montagem do coletor. Embora neste trabalho que temos utilizado microstereolithography para a fabricação dos moldes, outros métodos de fabricação, tais como 3D-impressão ou de moldagem por injeção pode ser usado também. Por conseguinte, o molde subjacente poderia ser feito de outros polímeros ou de metais em vez de PEGDA. Como tal, esta técnica é muito versátil e pesquisadores podem facilmente adaptar o método para combinar as suas próprias necessidades e instalações. A casa em microstereolithography-set-up utilizado neste estudo não irá permitir a preparação de construções com características menores de 30 um; isto não é uma limitação para a aplicação da córnea descrito aqui, mas pode ser crucial para a concepção de outros modelos. Nesse caso, os de outras técnicas, tais como 2 polimerização fóton (2PP) poderiam ser de interesse no entanto, a técnica de electrospinning poderão não permitir a reprodução das estruturas na escala sub-micron (este está a ser estudada pelo nosso grupo). As etapas críticas no processo de fabricação são: (i) Evitar o overcuring dos modelos PEGDA que podem ser controlados por tempo e quantidade de fotoiniciador de ajuste. (Ii) Controlar as condições de electrospinning, tais como temperatura e umidade. (Iii) Armazenar adequadamente o electrospumembranas n anel utilizando vácuo-embalagem e dessecantes. Em resumo, por colocação dentro de explantes de tecido do limbo das microestruturas da membrana mostrámos excrescência de células a partir dos explantes no nichos, a transferência de células para uma ferida da córnea de coelho e subsequente re-epitelização da córnea. A degradação das membranas armazenadas a diferentes temperaturas, também tem sido estudado e um protocolo de embalagem que permite o armazenamento a longo prazo das membranas tem sido desenvolvido, o último sendo essencial no desenvolvimento de membranas para utilização clínica.

A córnea, o tecido avascular mais exterior central do olho, é um dos tecidos mais importantes envolvidas na visão 1. Existem vários tipos de células que mantêm a função da córnea. A camada mais externa superior da córnea composta por células epiteliais que podem ser de cerca de 5-7 camadas de espessura 2. Essa camada impede a invasão bacteriana na córnea 3 e permite a entrada de oxigênio 4. Tem sido relatado que as células estaminais do epitélio da córnea em mentira nichos ou criptas (com tamanhos de 120-150 um) na região periférica da córnea conhecido como o limbo 5,6. Como as células estaminais se dividem, as células filhas também conhecidas como células amplificadoras transitórias viajar para fora dos nichos e divisão continua como as células se movem para dentro e para cima centripetamente resultando em células terminalmente diferenciadas na região central da córnea 7,8. Estas células são rotineiramente removido com o piscar de olhos exposing novas células por baixo 9. Além de ser o local das células estaminais epiteliais, o limbo também desempenha um papel em manter a conjuntiva vascularizado longe da região da córnea 10. Danos ao limbo pode ser causada por queimaduras térmicas / produtos químicos, radiação e também doenças genéticas 10. Quando isto acontece, a barreira de limbo é dividido permitindo que as células da conjuntiva para passar para a córnea, vascularização da região, causando dor e em alguns casos, a cegueira. A condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) 10. Diferentes substratos naturais têm sido descritos como transportadores de células-tronco possíveis para auxiliar na regeneração da córnea. Por exemplo, as membranas à base de colágeno foram usados ​​por Dravida et al. 11 e Rama e colaboradores 12 relataram o uso de fibrina em um estudo com 112 pacientes. No presente, porém o método mais comumente usado de tratamentoé a utilização de membrana amniótica humana a partir de um banco de tecidos e de cultura de células epiteliais do limbo na sua superfície 13,14. Uma vez que uma monocamada formou, a membrana amniótica é colado do lado de células para cima sobre a córnea danificada, que tem todas as células da conjuntiva e do tecido cicatricial cirurgicamente removido a partir dele, antes do transplante de células 14. A membrana amniótica degrada dentro de semanas a meses, deixando as células epiteliais associadas à área desnudada para regenerar o epitélio 15,16. Esta técnica tem sido bem sucedido em restaurar a visão no entanto ainda existem algumas questões práticas que restringem a sua aceitação generalizada clinicamente. À medida que a membrana amniótica é o tecido humano que precisa passar por uma triagem utilizando procedimentos bancários tecido bons antes de serem utilizados para o transplante de células em pacientes. Este rastreio só reduz o risco de transmissão de doenças, mas não pode eliminá-lo completamente 17. Além disso, há relatos de variabilidade no pESEMPENHO da membrana amniótica, devido à variação entre doador 18,19 e diferentes métodos de processamento 19,20. Juntamente com o pequeno risco de transmissão da doença, há a necessidade de centros cirúrgicos para ter acesso a bancos de tecidos bem administradas, que não estão disponíveis a todos. Embora a membrana amniótica é relativamente bem sucedida, existe uma necessidade para o desenvolvimento de novas alternativas de células portadoras biodegradáveis ​​sintéticos, para o tratamento de doenças da córnea. Transportadores sintéticos superaria a necessidade de bancário procedimentos, bem como eliminar o pequeno risco de transmissão da doença e variabilidade inter-doador. Neste sentido, os materiais tais como o polietileno-glicol e 21,22 23,24 PLGA têm sido estudados. No desenvolvimento de uma alternativa sintética para a membrana amniótica humana, há também a possibilidade de conceber nele características desejáveis ​​para ajudar a esperança de sobrevivência das células em cultura. O inclusion de microestruturas dentro de dispositivos de biomateriais para controle específico de comportamento das células é uma área emergente de interesse. Muitos autores relatam trabalho para o desenvolvimento de células-tronco artificiais nichos 25-30. Este grupo relatou recentemente a criação de um limbo PEGDA artificial microfabricado biofunctionalized-fibronectina para a entrega de células epiteliais do limbo 22 e um método para a fabricação de membranas biodegradáveis ​​contendo electrospun bolsos microfabricados para o suporte das células epiteliais do limbo 31. O objetivo deste trabalho é desenvolver uma nova tecnologia de fabricação para o desenvolvimento de dispositivos de biomateriais contendo microestruturas que imitam a uma extensão dos microambientes em que as células-tronco residir no corpo. Desenvolvemos uma técnica que combina microstereolithography electrospinning e que permite a fabricação de membranas microestruturadas biodegradáveis ​​que mostram greapotencial t para aplicações de regeneração de tecidos. É importante notar que, embora neste trabalho esta técnica foi aplicada para a fabricação de anéis para a regeneração da córnea, a tecnologia pode ser aplicada para a fabricação de dispositivos para a regeneração de uma ampla gama de tecidos epiteliais, por exemplo, da pele, oral epitélio mucosa, intestino, respiratórias e urinárias. Especificamente, no presente estudo, nós desenvolvemos uma membrana sintética biodegradável, que funciona de uma maneira semelhante à membrana amniótica para entregar células para a córnea. Esta membrana contém microbolsas de cerca de 300 um (maiores do que as criptas do limbo das Pallisades de Vogt (cerca de 150 um)). Por fim, temos estabelecido um protocolo de embalagem que permite que estas membranas a serem armazenados a -20 ° C durante mais de 6 meses sem mostrar quaisquer sinais de degradação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

Problemas da córnea afetam milhões de pessoas em todo o mundo, reduzindo a qualidade de vida de forma significativa. Doença da córnea pode ser causada por doenças como a aniridia ou Síndrome de Steven Johnson, bem como por fatores externos, como queimaduras químicas ou radiações. Os tratamentos atuais são (i) o uso de córneas e (ii) o uso de células-tronco expandidas em laboratório e entregue em suportes (por exemplo, membrana amniótica); estes tratamentos são relativamente bem sucedida, mas, infelizmente, eles podem falhar após 3-5 anos. Existe uma necessidade de conceber e fabricar novos dispositivos de biomateriais capazes de imitar a córnea em pormenor o meio fisiológico em que as células estaminais reside na córnea. As células estaminais do limbo estão localizados no limbo (área circular entre a córnea e esclera) em nichos específicos conhecidos como os Palisades de Vogt. Neste trabalho, desenvolvemos uma nova tecnologia de plataforma que combina duas técnicas de fabricação de ponta (microstereolithography e electrospinning) para a fabricação de membranas de córnea que imitam a um certo ponto do limbo. Nosso membranas contêm microbolsas artificiais que visam fornecer células com proteção como o Palisades de Vogt fazer no olho.

Electrospun microfabricados anéis foram fabricados com uma combinação de microstereolithography e electrospinning (Figuras 1 e 2). PEGDA anéis de tamanhos diferentes foram fabricadas usando microstereolithography (Figura 3); Esta técnica permite que as estruturas de fabricação na ordem dos centímetros e a incorporação simultânea de microestruturas. Neste caso, os anéis diâmetros variando de 1,2-1,6 cm contendo microbolsas de 350-500 um foram fabricados (Figura 4). Em termos de produção, embalagem e de esterilização de materiais para futura utilização clínica verificou-se que a embalagem em vácuo em sacos de grau médico melhorou significativamente a capacidade de atingir o armazenamento a longo prazo das membranas de PLGA (Figura 5); a utilização de um saco de grau médico (PET / folha / LDPE), com espessura de 0,12 milímetros permitiu alcançar uma vida útil mais longa. Isto foi investigado através do envio Membranes aos nossos colaboradores na Índia e as membranas foram armazenadas por um período de meses a -20 ° C, à temperatura ambiente e a 37 ° C em condições úmidas (deliberadamente uma incubadora úmida). Figura 5 mostra que, utilizando as condições deliberadamente provocativas de armazenamento a 37 ° C sob condições de humidade, as membranas eram estáveis ​​apenas durante cerca de 1 mês em condições de vácuo, não embalados, mas obteve 3 meses de armazenagem sob condições de vácuo embalado (Figura 5 e Tabela 1). A tabela 1 demonstra a melhoria das condições de armazenamento que podem ser alcançados, mesmo sob as condições selecionadas para ser propício para a absorção de água e fibra inchaço se presta atenção à escolha de saco utilizado. Os anéis apoiado conseqüência de células a partir de explantes limbo em diferentes condições (i) anéis feitos na hora e (ii) Anéis armazenadas por 6 meses (Figura 6). Transferência das células foi conseguida ao fim de 4 semanas, quando plrastreio das membranas de PLGA em modelos 3D feridos. As células cresceram para fora a partir de explantes de tecido colocadas sobre as membranas, criando um novo epitélio sobre as córneas previamente desnudadas (Figura 7). Positivos (córneas sem qualquer tratamento) e os controles negativos (córneas feridos) também foram mantidas em cultura durante os mesmos períodos de tempo. Os controlos negativos confirmou a falta de formação de um novo epitélio, na ausência de quaisquer células adicionadas. A imunocitoquímica demonstrou que as células que crescem para fora dos explantes foram as células epiteliais da córnea, uma vez que foram positivas para o marcador de diferenciação da córnea CK3 (Figura 7E). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Esquema de microstereolithography criado para a criação de anéis PEGDA. her.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Esquema do processo de eletrofiação utilizando anéis PEGDA microfabricados como um templates. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 (A) mostra um exemplo de um (folha de alumínio galvanizado com anéis PEGDA) coletor de estática para a fiação de membranas de PLGA microfabricados. (B) e (E) mostram diferentes esteiras electrospun sendo desenrolada a partir de coletores estáticos. (C) mostra PEGDA modelos de diferentes tamanhos destacando a versatilidade de utilização microstereolithography para a fabricação da superfície de base (D). mostra um PLGA microfabricados réplica.&quot;target =&quot; /files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. imagem SEM de um anel com um PEGDA microfeature ferradura (A); alta ampliação da imagem SEM de um bolso microfabricado (B). Imagem de contraste de fase de um anel com um PLGA microfeature ferradura (C); imagem de alta ampliação de contraste de fase de um pocket microfabricated (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento de vácuo e não vácuo embalado PLGA (50/50) as membranas (44 kg / mol) com micro-fabricado anéis com mais de 6 meses. integridade da membrana foi pontuada como fibras completamente intactas (+++), algumas fibras inchaço (++), fibra de fusão (+) ou sem fibras intactas (-). MEV e três dessecantes (laranja sílica, cobalto (II) e de cobre (II) sulfato) não mostram alterações na integridade da fibra ou umidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 imagens de fluorescência mostrando conseqüência do LEC a partir de explantes limbo em anéis biodegradáveis ​​feitos na hora de PLGA (A, B) e em anéis após 6 meses de armazenamento a -20° C (C, D). Imagens (A) e (B) corresponde a células coradas com DAPI (azul) e iodeto de propídio (vermelho), respectivamente. Imagem b é uma vista ortogonal de um z-stack confocal de um explante colocado em um bolso microfabricated. Imagens (C) e (D) mostram coloração positiva para p63 (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 (A) mostra um modelo de córnea de coelho ferido com um anel de andaime e explantes de tecidos localizados no andaime, que foi previamente revestida com cola de fibrina (B) e (C) são os controlos positivos e negativos.; o controle positivo é um novo rabino<html> . t córnea e o controlo negativo de uma córnea em que o epitélio foi deliberadamente removidos (o controlo negativo também foram cultivadas durante 4 semanas) (D) é uma imagem de uma córnea de engenharia de tecidos, após 4 semanas de cultivo em H &amp; E; a figura mostra o novo epitélio de múltiplas camadas constituído pelas células que saem a partir dos explantes colocados em nichos (E) é uma imagem que mostra a imunocitoquímica excrescência de células a partir de um explante de limbo.; núcleos são corados com DAPI (azul) e as células mostra coloração positiva para citoqueratina 3, um marcador de diferenciação da córnea (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td><html> x; &quot;&gt; integridade da fibra por membranas armazenadas a 37 ° C húmido </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Dia 0 </td><td style="width:64px;"> Mês 1 </td><td style="width:64px;"> Mês 2 </td><td style="width:64px;"> Mês 3 </td><td style="width:64px;"> Mês 4 </td><td style="width:64px;"> Mês 5 </td><td style="width:64px;"> Mês 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> Não Embalado a Vácuo </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> Aspirado (Bag A) (PE, PA Composite) Espessura: 0,14 milímetros </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> Aspirado (Bag B) (PET / Folha / LDPE) Espessura: 0,75 milímetros </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Efeito de vácuo e de armazenamento diferente sacos na integridade de PLGA (50/50) as membranas (44 kg / mol) examinada mais de 6 meses de armazenamento. Integridade da membrana foi pontuada como fibras completamente intactas (+++), um inchaço da fibra (++), fusão de fibras (+) ou sem fibras intactas (-).

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Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K visualizações.  University of Sheffield.  Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas. 

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fundamentos eletrofiação: Solução de Otimização e Parâmetros Aparelho

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Bioengenharia

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparação de Membranas de Luz respondem por um enxerto de superfície combinada e Processo Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Síntese de hidrogeles com propriedades anti-deposição como membranas de purificação de água

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...