Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Este protocolo é significativo porque é um excelente modelo para estudar a inflamação da córnea e sua contribuição para a cicatrização de feridas em condições normais e patológicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria uma ferida epitelial precisa e reprodutível sem romper a membrana do porão. Este modelo de woundamento córnea é simples e rápido de executar.

Demonstrando o procedimento estará o Príncipe Akowuah, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, prepare uma solução de 1%fluoresceína dissolvendo 10 miligramas de sal de fluoresceína de sódio em um mililitro de soro fisiológico estéril ou PBS. Em seguida, para anestesia, prepare 10 mililitros de um coquetel de cetamina-xilazina misturando dois mililitros de cetamina, um mililitro de xilazina, e sete mililitros de PBS estéril.

Depois de anestesiar um rato C57 preto 6 preto de 8 a 12 semanas, avalie a profundidade da anestesia avaliando o reflexo do pedal após o aperto do dedo do pé. Para criar a ferida córnea epitelial, coloque o rato anestesiado sob um microscópio de dissecção. Fera apenas o olho direito ou esquerdo e mantenha a consistência com o olho sendo ferido ao mover-se de rato para rato.

Mantenha os olhos abertos segurando as pálpebras com o polegar e o dedo indicador. Em seguida, usando uma trefina estéril de dois milímetros de diâmetro, demarca o centro da córnea e gire suavemente a trefina para causar uma impressão no epitélio córnea. Não aplique pressão excessiva, pois isso pode resultar em perfuração corneal.

Em seguida, segurando o estéril taco de golfe contundente spud em um ângulo de aproximadamente 45 graus da superfície da córnea, debrida o epitélio por raspagem cuidadosa e contínua dentro da área demarcada usando o spud. Não aplique força excessiva e mantenha a hidratação usando PBS estéril, se necessário. Para monitorar o fechamento da ferida e a re-epitelização, pipeta de 1 a 1,5 microlitros de solução de 1%fluoresceína na superfície ferida e imagem da córnea usando um microscópio digital com uma fonte de luz azul.

Imagem da córnea ferida em momentos específicos após o ferimento. Tire imagens no primeiro minuto da solução de fluoresceína para evitar a disseminação da solução para o epitélio circundante, o que pode levar a uma superestimação do tamanho da ferida. Em seguida, usando um software de análise de imagem, rastreie a área da ferida e expresse a área da ferida em cada ponto de tempo como uma porcentagem da área original da ferida a zero hora.

Um micrografo eletrônico de transmissão da ferida córnea demonstra que a membrana do porão do epitélio permanece intacta mesmo após a lesão. Em camundongos de 8 a 12 semanas de idade, o fechamento da ferida é completo 24 horas após o ferimento. A resposta inflamatória ao ferimento é caracterizada por imagens celulares no limbus.

Mostrada aqui é a vasculatura limbal de uma córnea desenrolada com neutrófilos extra-vasculares, e a de uma córnea ferida com plaquetas extravasculares e neutrófilos 30 horas após a abrasão. Para reproduzir com sucesso este protocolo, a mesma cepa em cada gama de mouse deve ser usada, e o tamanho e profundidade da ferida devem ser criados conforme descrito.