Apresentamos um método para análise de imagem ao vivo da absorção de colesterol LDL em vários tipos de células humanas. Isso permite a triagem de compostos, que modificam o transporte do colesterol LDL. A principal vantagem do uso de imagens de células vivas para quantificação do fluxo de LDL, é que permite monitorar a morfologia celular durante toda a duração do ensaio, de modo potencialmente os compostos tóxicos podem ser detectados.
Para começar, aspire a mídia fora das células previamente preparadas, e lave as células com 5 mililitros de salina tamponada de fosfato de Dulbecco. Aspire a DPDS. Junto para desprender as células do prato de 100 milímetros, adicione 1,5 mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA para as células HepG2, e adicione 1,5 mililitros de solução de 0,05% Trypsin-EDTA para as células HK2, ou os HCAECs.
Incubar as placas a 37 graus celsius por quatro minutos. Em seguida, neutralize a Trypsin adicionando 3 mililitros de mídia completa para as células HepG2 e HCAEC. Use 3 mililitros da solução neutralizante Trypsin, comprometa o DPDS com soro bovino fetal de 5%ou FBS para as células HK2.
Transfira as células para tubos cônicos de 15 mililitros e, em seguida, centrífugue os tubos a 250g por cinco minutos. Após o giro, aspire a mídia e resuspense a pelota de célula em mídia completa. Filtre a suspensão das células suavemente através de um coador de malha de 40 mícrons para quebrar aglomerados celulares.
Conte as células e as emplaque em uma densidade otimizada em uma placa de 24 poços. Incubar a placa durante a noite a 37 graus celsius para permitir que as células se conectem. No dia seguinte, mude a mídia celular para a mídia base sem FBS para a linha celular, além de 5% de soro deficiente de lipoproteína, ou mídia 2%FBS.
Use 500 microliters de mídia total por poço em uma placa de 24 poços. Em seguida, continue a incubação por 24 horas para passar fome nas células. Juntamente com o passo de fome ou no dia seguinte, as células podem ser tratadas com compostos desejados e controles apropriados.
24 horas após a fome, adicione 5 microlitros de pHrodo vermelho rotulado LDL a cada poço contendo 500 microliters de mídia para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Remova cuidadosamente todas as bolhas dos poços. Imediatamente após a adição do LDL rotulado, coloque a placa na incubadora do sistema de análise de células vivas e deixe a placa equilibrar por 15 minutos para reduzir a condensação na placa.
Enquanto as células estão incubando, abra o software e agende a varredura adicionando a embarcação segurando a placa. Imagem 16 imagens por poço, adicione intervalos de uma hora a 10x de ampliação por quatro horas usando os canais vermelho e de fase. Em seguida, crie um mapa de placas para usar para processamento de dados, selecione a guia propriedades e escolha o mapa da placa.
Insira o tipo celular na guia de células e tratamentos na torneira composta. Em seguida, clique na guia regiões, selecione cada conjunto de réplicas e atribua regiões. Uma vez que uma execução experimental esteja concluída, crie um conjunto de imagens no software para treinar o computador para quantificar cada parâmetro incluído no conjunto de contagem.
No software, abra a exibição da placa e, em seguida, na caixa de serviços públicos de trabalho de análise, escolha criar ou adicionar à coleção de imagens. Selecione nova coleção de imagens, digite um nome para a coleção de imagens e escolha os canais vermelho e de fase, verificando as caixas ao lado dos canais. Selecione mais cinco imagens de diferentes poços e pontos de tempo e adicione-as à coleção de imagens adicionando à coleção de imagens atual.
Na caixa de utilidades de trabalho de análise, escolha nova definição de processamento, selecione a coleção de imagens no menu suspenso, insira os parâmetros para o tipo de células. Na caixa de visualização, use o menu suspenso para selecionar visualizar tudo. Na caixa da máscara de análise, verifique a máscara de confluência e as caixas de máscara de objeto vermelho para visualizar a área incluída na análise para a definição de processamento.
Role a coleção de imagens para garantir que as células e o LDL estejam incluídos na máscara. Selecione arquivo e salve a definição de processamento. Em seguida, abra a visão da placa de experimentação para analisar o conjunto de imagens da execução experimental.
Na caixa de utilitários de trabalho de análise, escolha lançar novo trabalho de análise e selecione a definição de processamento salvo. Nomeie o trabalho de análise, escolha o intervalo de tempo para análise e destaque os poços experimentais para analisar. Selecione o botão de lançamento.
Uma vez concluída a conclusão do trabalho de análise, exporte os dados, selecione a análise completa e a visualização da imprensa. No menu utilitários, escolha a exportação de gráfico métrico. No menu das regiões, escolha todos os poços e no menu de grupo, para obter o valor médio de cada conjunto de poços como um grupo, escolha réplicas.
E para exportar os valores individuais para cada poço, escolha nenhum. No menu métrico do objeto vermelho, escolha a intensidade total do objeto vermelho integrado. Selecione o botão de exportação de dados.
Verifique a quebra de dados em imagens individuais. Os dados são copiados automaticamente em uma área de transferência e podem ser colados em um novo arquivo de planilha. No menu métrico do objeto de fase, escolha a confluência e clique no botão de exportação de dados.
Na guia prompt, verifique a quebra de dados em imagens individuais. Os dados são copiados automaticamente em uma área de transferência e podem ser colados ao arquivo da planilha contendo dados totais de intensidade integrada do objeto vermelho. Agora, os dados exportados podem ser normalizados, de acordo com as etapas 4.1.7 e 4.1.8 do protocolo, para obter valores finais de captação de LDL.
Após o tratamento com Dynasore ou PCSK9 recombinante, todas as três linhas de células humanas testadas apresentaram reduções significativas no influxo de LDL ao longo de um curso de tempo de quatro horas. Os influxos de LDL reduzidos em carcinoma hepático humano ou células HepG2, com tratamento de Dynasore ao longo do curso, em comparação com as células tratadas com DMSO como controle. A imagem celular viva do influxo de LDL em células HepG2 em diferentes pontos de tempo mostrou um aumento de mercado na captação de LDL após o tratamento com Simvastatina apoiando a sensibilidade deste método para detectar alterações significativas no fluxo LDL.
Imagens em tempo real investigadas no momento inicial e ponto final final, confirmam a morfologia normal das células após o tratamento do Dynasore, indicando a eficácia e a segurança deste composto. Depois de adicionar LDL ainda mais vermelho rotulado às células para preservar sua atividade fluorescente, é importante proteger a placa da luz até que ela seja colocada na incubadora do sistema de imagens de células vivas. Células de diferentes órgãos podem responder de forma diferente aos tratamentos, ou seja, em direções opostas, ou podem responder nas mesmas direções, mas mostram diferentes taxas de mudança na absorção do colesterol.
Somente com a imagem celular viva essas diferenças podem ser detectadas e quantificadas com precisão.
