Nosso protocolo usa sondas fluoróforas regulares e técnicas simples de preparação de espécimes que mantêm a célula imagem em condições fisiológicas para estudar processos celulares altamente dinâmicos e estruturas subcelulares detalhadas. Essa técnica nos permite investigar processos celulares em uma super resolução e em condições fisiológicas por um período prolongado sem sacrificar a resolução especial ou temporária. Comece cortando uma membrana de diálise de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodalton em pequenos pedaços e absorvendo as peças com 100 microliters de meio de célula viva por cerca de cinco minutos.
Enquanto as membranas estão encharcadas, corte o anel externo de um tubo de 50 mililitros em pequenos pedaços e esterilize as peças em 70% de etanol. Para dissecção e montagem de testes, transfira dez de dois a três dias de idade anesthetizado moscas machos em um prato de dissecção sob um microscópio dissecando e usar fórceps finos para remover os testículos. Quando todos os testículos tiverem sido coletados, lave os testículos duas vezes no meio da célula viva e use uma ponta de pipeta para espalhar de 100 a 150 microliters de meio de célula viva para o prato de fundo de vidro preparado.
Use fórceps finos para transferir os testículos de mosca para o centro do prato e remova todos, exceto cerca de 10 microliters do meio. Rapidamente, coloque a membrana pré-molhada sobre os testículos e coloque de dois a três pequenos pesos plásticos na membrana. Imediatamente, adicione 100 a 150 microliters de meio de célula viva fresca e coloque o anel de volta no lado elevado do prato.
Coloque a tampa deslize de volta para o anel e gire um pedaço de papel de tecido na água antes de colocar o papel no deslizamento da tampa. Em seguida, cubra o prato com uma tampa e fixe o prato no palco de um microscópio de super resolução. Para imagens de células-tronco germinativas, abra o software de imagem e ligue a luz transmitida.
Use o objetivo 63X para focar no tecido de testículos e ligar os lasers. Clique em Live"para localizar células-tronco germinais. Ajuste o foco e clique em Tamanho do Quadro", para definir o tamanho do quadro entre 512 por 512 e 1024 por 1024 pixels, e média"para definir a média do quadro para um ou dois.
Clique em Master Gain"para definir o ganho de multiplicação de elétrons para menos de 800, e lasers"para definir a potência laser para 1%a 2% Zoom na região ou célula de interesse para reduzir o tempo de aquisição da imagem e reduzir o branqueamento de fotos, e confirmar que a imagem foi configurada de forma ideal antes de clicar em Iniciar Experimento"para iniciar a captura de imagem de lapso de tempo. Se a Aquisição airyscan não estiver configurada de forma ideal" será exibida, clique em Optimal"nas seções tamanho do quadro, Z-Stack e Área de varredura, e otimize o intervalo de tempo, o número de fatias Z e a duração da imagem de lapso de tempo, de acordo com o design experimental e o tipo de amostra. Após a imagem, selecione Processamento, Batch"e Processamento Airyscan e selecione as imagens a serem processadas.
Em seguida, clique em Executar processo"para obter as imagens de super resolução. A imagem celular viva de testículos de drosophila expressando gfp de tubulina alfa em células germinativas em estágio inicial usando um microscópio confocal de disco giratório, permite a visualização da intensidade assimétrica dos sinais de GFP em dois centrossomos, como um sinal mais brilhante no centro-mãe e um sinal relativamente mais fraco nos centrossos da filha. A diferença de brilho é provavelmente refletida pela assimetria temporal da nucleação do microtúbulo, mas a morfologia detalhada e a quantidade dos microtúbulos não podem ser resolvidas usando microscopia confocal de disco giratório.
Em contraste, a super resolução de células vivas permite a visualização e quantificação da morfologia e números de microtúbulos. Essa resolução melhorada também revela padrões de nucleação assimétrica de microtúbulos, alongamento e aumento da interação com a membrana nuclear. A imagem celular viva também permite a visualização da invaginação da membrana nuclear assimétrica, mas não de microtúbulos individuais que entram diretamente no núcleo.
Em contraste, esta técnica de super resolução de células vivas permite a observação direta desses eventos por imagens simultâneas de microtúbulos e da lâmina nuclear. Durante a metafase, ambos os centrosmers irmãs podem ser detectados como um sinal usando microscopia de disco giratório, embora o acessório central de microtúbulo não possa ser observado. Em contraste, a imagem viva de super resolução permite a visualização do acessório de centromero microtúbulo em prophase precoce.
Certifique-se de colocar uma membrana sobre os testículos para garantir que eles não se movam ou flutuem durante a imagem e para otimizar as configurações do microscópio para evitar branqueamento de fotos e toxicidade fotográfica. Existem muitas maneiras de aplicar esse método, como investigar a dinâmica das proteínas, o estresse linear ou as defesas e processos celulares.
