The authors have no Acknowledgements.

1. Preparação de células <ol><li> células em crescimento <ol><li> Crescer D. discoideum células em meio AX, a 23 ° C sob luz em placas de cultura de tecidos. Evitar a manter as células em densidades elevadas superiores a 75% de confluência. NOTA: Para uma resposta óptima ao estresse por calor, as células precisam estar em fase de crescimento exponencial e não deve ter atingido fase estacionária. </li><li> No dia antes de imagem, as células divididas em média de fluorescência baixa (LFM) para 1 x 10 4 células / ml. NOTA: Este passo é necessário para reduzir a fluorescência de fundo causado pela forma AX. O tempo de incubação pode ser reduzida a um mínimo de 2 horas. No entanto, as vesículas retomadas em meio AX ainda pode gerar algum sinal de fundo após 2 horas. </li></ol></li><li> Preparar células para microscopia <ol><li> Antes de imagem, as células colheita da placa de tecidos em LFM e transferir um número adequado de células em placas com fundo de vidro. NOTA: Normalmente,1 x 10 5 células / ml é suficiente; No entanto, se a configuração experimental requer períodos longos de imagiologia (mais de 8 horas), o número de células precisam ser cuidadosamente ajustado, conforme D. células discoideum fará a transição para o ciclo de desenvolvimento e começar a transmitir e global caso o número de células são elevados enquanto os nutrientes são baixos. </li><li> Permitir que as células se contentar com 20 min. Remover as células não-liquidadas, substituindo cuidadosamente o meio utilizado por meio fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imagiologia NOTA: O protocolo pode ser utilizado em sistemas de campo amplo, bem como em instalações de microscopia confocal. O uso de uma caixa de incubação com temperatura controlada, que inclui os objectivos e platina do microscópio é útil, mas não essencial para o controlo da temperatura. A temperatura da caixa de incubação é definido como a temperatura mais alta utilizada na experiência, por exemplo, a 40 ° C se o stress térmico é realizado. Caso contrário, a temperatura é ajustada a 256; C. As mudanças de temperatura devem ser feitas com antecedência para permitir que o sistema se adapte, como mudanças de temperatura durante a imagem pode afetar o foco. Nota: Durante a gravação, a temperatura é controlada usando uma câmara de arrefecimento. A temperatura padrão para imagens células não-estressado é de 23 ° C. As condições de stress de calor, a temperatura é aumentada de acordo com o nível desejado. O elemento piezoeléctrico na câmara de refrigeração pode responder muito rapidamente à mudança de temperatura. No entanto, o foco das imagens irá alterar ligeiramente (ele pode desviar-se para até 20 uM dependendo da mudança de temperatura). Assim reorientação manual é necessária dentro dos primeiros minutos de aquisição de imagem, a menos que o microscópio utilizado está equipado com um auto-foco de hardware. <ol><li> Aquisição de imagem em condições não-estressados <ol><li> células de imagens em condições não-salientou a 23 ° C, adquirir um mínimo de 6 campos de visão (FOVs). NOTA: condição de não-estresse pode ser visualized quer através da gravação de um curto lapso de tempo (5-30 min) ou aquisição de fotografias representativas. Para cada linha de estado ou de células adquirem um mínimo de 6 campos de visão (FOVs). Nota: Em caso de células individuais são de interesse, a posição das respectivas células no meio do FOV e gravar uma série ladrilho 3 x 3 com o FOV que contém as células de interesse no meio D.. células discoideum são móveis e podem migrar para fora do FOV. No entanto, a série telha 3 x 3 aumenta a área potencialmente explorado pela célula de interesse e continua a ser rastreáveis ​​por períodos de lapso de tempo de ~ 6 horas. </li><li> Adquirir z pilhas de máximo de 7 um em 1-0.25 uM passos para capturar todo o volume da célula. </li><li> Adquirir uma imagem de referência brilhante campo para avaliar o número total de células. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem para o stress de calor <ol><li> Ajustar a temperatura da câmara de arrefecimento para 30 ° C de acordo com as instruções do fabricante. &lt;/ Li&gt; <li> Após a indicação de temperatura atingiu o valor desejado, reorientar manualmente no canal de campo claro e verificar todos os FOVs gravadas antes de iniciar o lapso de tempo. </li><li> Iniciar um lapso de tempo de 4 horas de estresse de calor com um intervalo de tempo de 5-10 min entre momentos de tempo. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição dos dois primeiros pontos de tempo. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem durante a recuperação <ol><li> Depois de estresse por calor, reduzir a temperatura volta a 23 ° C, espere o indicador de temperatura para ajustar e reorientar manualmente. </li><li> Gravar filmes de lapso de tempo na fase de recuperação para 8-10 h em intervalos de tempo mínimo de 10-20. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição do primeiro ponto de tempo. </li></ol></li></ol> Análise 3. Imagem NOTA: Para a quantificação do número de células contendo focos citosólica, avaliar o número total de células e o número de células com focos citosólico em cada momentoquadro. Devido à dificuldade de segmentar células a partir de imagens de campo claro, a quantificação precisa de ser feito manualmente. A seguir, a análise dos dados é descrito para o pacote de processamento de imagem free ((http://fiji.sc/Fiji). Ele requer o plug-in &quot;Cell Contra&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Avaliando número total de células <ol><li> Carregar o brilhante pilha de campo (XYT), clicando em &quot;Arquivo&quot; e &quot;Open&quot;. </li><li> Abra a &quot;célula Contador&quot; plug-in ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Contra&quot;). Carregar a pilha de imagens, clicando em &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Escolha o tipo apropriado de contadores, assinalando a caixa apropriada. NOTA: O uso do tipo 1 como contador para o número total de células e tipo 2 como contador para células com focos citosólica. Contagem de todas as células. </li><li> Salvar os marcadores clicando em &quot;Salvar marcadores&quot;. </li></ol></li><li> A avaliação do número de células com focos citosólica <ol> &lt;li&gt; Coloque o hyperstack imagem de fluorescência (XZYT) ( &quot;File&quot; - &quot;Open&quot;) e fazer uma projeção de intensidade máxima usando o &quot;Z-Projector&quot; (Imagem / Stacks). </li><li> Abra a &quot;célula Contador&quot; plugin. Carregar a pilha imagem resultante (XYT), clicando em &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Coloque os marcadores clicando em &quot;Marcadores de carga&quot;. ATENÇÃO: Os nomes da imagem de referência ea pilha de fluorescência de arquivo deve ser idêntico. Se necessário, mudar o nome de conformidade antes de inicializar a pilha de imagem. </li><li> Escolha o tipo de marcador apropriado (ver 3.1.3) e contagem de células com focos citosólica. Os marcadores existentes podem ser utilizadas como guia para a posição das células individuais. </li><li> Recuperar o número de contagens por fatia, clicando em &quot;Resultados&quot; e salvar as contagens em outra parte para outros cálculos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para estudar o comportamento de uma proteína de interesse particular, em resposta ao stress induzido por calor. O aumento de temperatura para 30 ° C tem sido relatado para desencadear resposta de stress de calor e sob estas condições, a viabilidade de D. discoideum é marcadamente reduzida. modificações O protocolo pode ser modificado para comparar o comportamento de proteínas diferentes sob as mesmas condições de stress. Para isso, as células que expressam diferentes proteínas com a mesma etiqueta fluorescente são transferidos para placas de multi-poços, tal como quatro pratos de câmara (secção 1.3.1). O protocolo também pode ser aplicada em células de proteínas com diferentes marcadores, tais como GFP ou RFP que co-expressam. Isto pode ser por exemplo utilizado para monitorar o comportamento de diferentes componentes do sistema de controlo de qualidade de proteínas (PQC). As células que expressam marcador agregação GFP-marcadas e diferentes componentes PCQ marcado-RFP pode ser observado usando multi-bemcôncavo para a imagem latente. Isso garante as mesmas condições de estresse (velocidade de aumento da temperatura / diminuição, a duração da temperatura aumento / diminuição) e permite a realização de estudos comparativos. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para estudar a influência do sistema de PQC na resposta ao stress de calor. A actividade dos componentes pode ser modulada pela alteração dos níveis de expressão utilizando ferramentas genéticas, tais como knock-out ou a sobre-expressão ou utilizando inibidores específicos disponíveis comercialmente 6. O proteassoma pode ser inibida pela adição de MG132 (100 uM) ou lactacistina (10 uM) ao meio de crescimento. O acompanhante Hsp90 pode ser inibida utilizando geldanamicina (6 uM), ou do radicicol (10 uM). O acompanhante Hsp70 pode ser inibida com VER-155088, embora não pudemos confirmar a eficácia da inibição em nossas configurações experimentais até agora. Inibidores deve ser adicionado um dia antes de imagem e as células são incubadas durante 14 horas. Criti<html> Passos cal no âmbito do Protocolo O passo crítico para a avaliação da perturbação induzida pelo calor é o estado das células antes da experiência de imagem. Estudos em leveduras demonstraram que as células adquirem resistência a uma variedade de stresses ambientais durante a fase estacionária 13. Observou-se também a capacidade de resposta mínima ao estresse térmico aplicado, se D. células discoideum tinha atingido fase estacionária antes da imagem. Por conseguinte, a manutenção de um número constante de célula &lt;5 x 10 5 células / ml é crítica. Além disso, o número de células elevadas pode induzir a transição do ciclo vegetativo de D. discoideum com o ciclo de desenvolvimento, desencadeando assim as vias de fome, o que pode levar a uma resposta diferente ao estresse térmico. Se o número de células altas são alcançadas na fase de recuperação após o estresse de calor, streaming e células agregando pode interferir com a análise de dados como as células se movem fora de foco (veja a Figura 4). content &quot;&gt; limitação da técnica A perda de foco é o gargalo do protocolo. Durante a mudanças de temperatura, o plano focal pode mudar drasticamente, o que requer reorientação manual num período de tempo imediatamente após a alteração da temperatura. O salto do foco pode ser por vezes demasiado extremo a ser superado por focagem automática do software, especialmente se o tempo entre os pontos de tempo é alta. No entanto, se o microscópio utilizado está equipado com um hardware de focagem automática, esse gargalo pode ser contornado. Importância da Técnica em Matéria de métodos existentes Em comparação com configurações existentes, tais como o uso de quartos com ar condicionado, caixas de incubação de temperatura controlada, relativos aos objectivos e as etapas de palco microscópio ou com temperatura controlada e colares objetivos, o uso de uma câmara de resfriamento proporciona um controle mais preciso do ambiente temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode manter uma TEM constante e uniformeratura em toda a configuração experimental. Em configurações clássicas, diferenças de temperatura locais pode levar a resultados diferentes de observação. Além disso, ele pode responder rapidamente e rapidamente a mudanças induzidas na temperatura, enquanto instalações clássicas adaptar-se muito lentamente a mudanças de temperatura induzidas, especialmente a diminuição da temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode também cobrir uma gama mais ampla de temperatura (15-40 ° C) do que instalações clássicas, com as quais as temperaturas que alcançam, tais como 15 ° C ou 40 ° C é muito difícil. Dictyostelium discoideum é particularmente sensível a foto-toxicidade. Estudos anteriores utilizaram ascorbato como limpador para reduzir foto-toxicidade. No entanto, períodos de imagem longos exigem suplementação adicional. Além disso, o uso de ácido ascórbico está limitado a estudos em que o mecanismo de interesse não é afectado por o suplemento de antioxidante. Propomos que a imagem de temperatura controlada pode ser utilizada como uma alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidade e pode ser combinado com a adição de ácido ascórbico para diminuir ainda mais a toxicidade. efeitos fototóxicos pode ser minimizado através de uma temperatura constante e uniforme de 23 ° C utilizando uma câmara de arrefecimento. Células fotografada usando controle de temperatura mostram menos sinais de foto-toxicidade, esse arredondamento celular, por um período de tempo mais longo. Isso também permite imagens com maior intensidade, intervalos de tempo menores ou mais campos de visão (FOVs). Aplicação geral O stress térmico a temperaturas mais elevadas tem sido mostrado para desencadear uma resposta de stress de calor diferente 14. Portanto, aumentando a temperatura para 34 ° C ou 37 ° C podem induzir uma resposta diferente. Em adição ao stress de temperatura é aplicado, a duração de uma situação de stress particular pode ser modificado para estudar a resposta imediata ou adaptação a longo prazo a stress térmico. Em geral, o protocolo pode ser descritoexpandiu-se para um amplo conjunto de aplicações. Uma vez que o controle preciso da temperatura reduz consideravelmente os efeitos foto-tóxicas, o protocolo pode ser utilizado em ambientes que exigem tempos de exposição elevada e / ou intensidades de luz de excitação mais elevadas, por exemplo, para visualizar as proteínas com um nível de expressão baixo, ou em combinação com intervalos de tempo curtos entre imagem, por exemplo, durante a imagem time-lapse. Também pode ser vantajoso para imagiologia de objectos que abrangem toda a célula, por exemplo, os microtúbulos, uma vez que estas configurações necessitam de um elevado número de z-secções ópticas.

Dictyostelium discoideum são solitários amebas de vida do solo que se alimentam de bactérias e outros microorganismos, que são ocupados por fagocitose. Ele tem um ciclo de vida único e notável que tem sido uma importante área de pesquisa desde a sua descoberta 1. O interesse no início do desenvolvimento multicelular 2 e as bases moleculares da quimiotaxia 3 logo foi complementada por estudos sobre motilidade celular, polaridade celular, imunidade inata. Além disso, D. discoideum foi introduzido como um sistema modelo para 4,5 pesquisa biomédica. Recentemente, estabelecemos D. discoideum como um novo sistema para estudar a 6,7 sistema de controle de qualidade da proteína (PQC). Sua proteoma é enriquecida com proteínas prião-como agregação-prone, o que representa um desafio a proteína de controlo de qualidade 8. Para investigar se a D. discoideum desenvolveu mecanismos moleculares especiais para controlar a sua altamente agproteoma congregação propensas, estudamos o comportamento de proteínas marcadoras de agregação propensas tanto em condições normais de crescimento e durante o estresse. Condições de estresse, tais como estresse por calor, pode ser usado para aumentar a taxa de proteína misfolding 9. Portanto, buscamos um sistema em que poderia induzir mudanças de temperatura e ao mesmo tempo seguir o comportamento de proteínas marcadoras. Para este efeito, combinamos de imagem de células vivas com aquecimento controlado por Peltier usando um (câmara de refrigeração) inserção fase térmica. Este método permitiu-nos manter a temperatura constante e uniforme, bem como para induzir uma mudança rápida, ainda preciso da temperatura. Processamento de imagem de células vivas, são utilizados para estudar uma variedade de processos biológicos em D. discoideum. No entanto, esta abordagem enfrenta dois grandes limitações. Em primeiro lugar, as células apresentam uma alta mobilidade e tendem a migrar para fora do campo de visão, rastreando assim de células individuais muitas vezes requer imagiologia de uma grande área. A mobilidade celular podeser reduzida em Agar sobreposição 10, no entanto, estas condições não são adequadas para a imagem latente a longo prazo devido a um declínio na viabilidade. Em segundo lugar, D. células discoideum mostram uma sensibilidade particularmente elevada para foto-toxicidade, o que resulta no arredondamento celular e 11 de paragem da mitose. Protocolos anteriores abordou esta questão através da adição de ácido ascórbico como um limpador radical e redução da exposição vezes 12. Esta última pode ser importante se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos e mostra um sinal de fluorescência fraca. Os autores sugerem também para proporcionar uma temperatura constante de 21 ° C, quer por imagem em um quarto com ar condicionado ou utilizando caixas de incubação com temperatura controlada, que cobrem o objetivo e microscópio estágio 12. Aqui, nós descrevemos um método com um controlo melhorado da temperatura usando uma câmara de arrefecimento ajustado a 23 ° C. Durante a gravação nosso set-up aumenta significativamente a resistência à foto-toxicidade. istopermite a utilização de tempos de exposição mais elevadas e intensidades de luz de excitação mais elevados. Isto é de particular importância durante a imagem de lapso de tempo, como os intervalos de tempo precisa de ser cuidadosamente equilibrado contra o número de posições representada por imagem e o tempo de exposição utilizado. A possibilidade de aumentar o número de posições fotografada também permite que a cobertura de uma área de imagem mais largo e facilita a identificação de células individuais ao longo de um período mais longo de tempo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

O protocolo de imagem descrito pode ser usado para analisar o comportamento de proteínas prião-como agregação propensa na ameba D. discoideum durante o stress de calor. A Figura 1 mostra a distribuição de Q103 proteína poliglutamina GFP em células sob condições de crescimento normais (Figura 1A), após 2 horas de stress de calor a 30 ° C (Figura 1B) e depois de 6 horas de recuperação de stress e crescimento em condições de crescimento normal (Figura 1C). Após o aumento da temperatura de 23 ° C a 30 ° C, o marcador de Q103-GFP funde a partir de uma distribuição difusa para estruturas puntiformes. Após a liberação do stress e crescimento à temperatura normal, estas estruturas se dissolver. A redistribuição de Q103-GFP e formação de calor focos citosólico induzido pelo estresse pode ser quantificada usando análise de imagem. A Figura 2A mostra a análise da FOVs individuais usando Fiji eo plug-in &quot;Cell counter &quot;. A figura 2B mostra a quantificação da resposta ao estresse de calor. Isto mostra que o aumento focos Q103-GFP citosólico em número com a continuação estresse por calor. Durante o estresse de calor, o controle de qualidade da proteína do sistema (PQC) é sobrecarregado, assim aggregation- proteínas propensas tais como a Q103 proteína prião semelhante não pode ser mantido num estado solúvel e cada vez mais agregado em focos citosólica. as células também mostram um aspecto arredondado, como representado na Figura 1B. a redução de focos citosólica após a remoção de stress sugere que o agregado proteínas são dissolvidas. A qualidade de imagem é sensível à densidade celular inicial. A Figura 3 mostra um exemplo de células após a recuperação de stress, comparando a densidade inicial de células apropriado (Figura 3A) e a densidade celular inicial elevada (Figura 3B). Se a densidade celular inicial era demasiado elevado, as células de estrelaTed para formar correntes tal como ilustrado na Figura 3b. Este que impõe dificuldades na quantificação subsequente como as células se mudaram para fora do plano focal. O método descrito pode ser usado para monitorar mudanças induzidas pela temperatura, como descrito acima. Ele também pode ser usado para reduzir o foto-toxicidade quando imagiologia à temperatura de crescimento fisiológico. A Figura 4 mostra uma comparação de células fotografada a 23 ° C numa câmara de arrefecimento (Figura 4A) e células fotografada sem controlo de temperatura num quarto com ar condicionado, definir a 25 ° C (Figura 4B). Após a exposição constante à luz de excitação, as células arredondar para cima quando não estiver fotografada em condições de temperatura controlada. Esta mudança na forma da célula está indicando stress. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; proteínas prião-como Agregação propensas mudar a sua distribuição celular durante o estresse térmico.-GFP marcado rica em polyglutamine huntingtina exão 1 (Q103) é constitutivamente expressa em AX2-214 D. células discoideum (sinal de GFP representado na tabela de pesquisa invertida escala de cinza). (A) Em condições normais de crescimento a 23 ° C, Q103-GFP é difusamente distribuídos no citoplasma. (B) Depois de 2 horas de estresse por calor a 30 ° C, Q103-GFP se aglutina em focos citosólica (setas vermelhas). As células mostram uma mudança de forma característica e arredondar para cima. (C) Após a libertação de stress e crescimento a 23 ° C, os focos são dissolvidos citosólica. Após 6 horas, sem focos citosólica pode ser observada. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2: Quantificação de formação de focos citosólico induzido pelo calor (A) Análise de células usando o pacote de processamento de imagem livre de Fiji eo plug-in &quot;Cell Contador&quot;.. A quantidade total de células (tipo 1, azul marcadores de balcão) é determinado na imagem de campo claro. Os marcadores são carregados no GFP-canal e o número de células com focos citosólica (tipo 2, marcadores vermelhos contador) é determinada. (B) Quantificação de focos após 3 horas de estresse por calor a 30 ° C e 3 horas de recuperação de stress a 23 ° C (n = 4 campos de visão, o erro bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Efeito da densidade celular na imagiologia de lapso de tempo de longa duração (A) células fotografadas a densidades celulares iniciais &lt;10 5 culas / ml.. Depois de 3 horas de stress térmico a 30 ° C e 6 horas de recuperação de stress a 23 ° C, as células ainda permanecem no ciclo vegetativo e se dividem. Apenas poucas células sair do plano focal. (B) As células fotografada em densidades celulares iniciais&gt; 10 6 células / ml. Após 9 horas de imagens (definições como em um), as células entraram no ciclo de desenvolvimento e começou a streaming e agregação. As células nos agregados não podem ser claramente distinguidos. Uma grande parte das células sai do plano focal e não pode ser analisado. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Efeito de controlo de temperatura em efeitos fototóxicos (A) células trabalhada durante 10 min com controlo de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visão, Z-pilha (espaçamento de 0,5 uM, espessura da amostra 8 uM), lapso de tempo (total tempo 10 min, lapso 1 min), o canal de GFP (0,07 tempo de exposição mseg, 10% de intensidade de laser), o canal de RFP (0,1 mseg tempo de exposição, 10% de intensidade de laser). As células não mostram sinais de que as alterações morfológicas características associadas ao estresse fototoxicidade. (B) As células fotografada por 10 minutos, sem controle de temperatura (mesmas condições que no A). As células apresentam sinais de fototoxicidade induzida arredondamento, indicando stress. Barra de escala = 10 mm. As células foram fotografadas num sistema baseado num microscópio com uma objectiva 100x / 1.4 abertura numérica (NA). As imagens foram coletadas com uma câmera CCD de 1.024 x 1.024 pixels arquivos usando 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.9K visualizações.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genética

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Imunologia e Infecção

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologia

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D microscopia de levedura

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de

Resumo

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Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em

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Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

4D microscopia de levedura

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP