The authors have no Acknowledgements.

1. Preparação de células <ol><li> células em crescimento <ol><li> Crescer D. discoideum células em meio AX, a 23 ° C sob luz em placas de cultura de tecidos. Evitar a manter as células em densidades elevadas superiores a 75% de confluência. NOTA: Para uma resposta óptima ao estresse por calor, as células precisam estar em fase de crescimento exponencial e não deve ter atingido fase estacionária. </li><li> No dia antes de imagem, as células divididas em média de fluorescência baixa (LFM) para 1 x 10 4 células / ml. NOTA: Este passo é necessário para reduzir a fluorescência de fundo causado pela forma AX. O tempo de incubação pode ser reduzida a um mínimo de 2 horas. No entanto, as vesículas retomadas em meio AX ainda pode gerar algum sinal de fundo após 2 horas. </li></ol></li><li> Preparar células para microscopia <ol><li> Antes de imagem, as células colheita da placa de tecidos em LFM e transferir um número adequado de células em placas com fundo de vidro. NOTA: Normalmente,1 x 10 5 células / ml é suficiente; No entanto, se a configuração experimental requer períodos longos de imagiologia (mais de 8 horas), o número de células precisam ser cuidadosamente ajustado, conforme D. células discoideum fará a transição para o ciclo de desenvolvimento e começar a transmitir e global caso o número de células são elevados enquanto os nutrientes são baixos. </li><li> Permitir que as células se contentar com 20 min. Remover as células não-liquidadas, substituindo cuidadosamente o meio utilizado por meio fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imagiologia NOTA: O protocolo pode ser utilizado em sistemas de campo amplo, bem como em instalações de microscopia confocal. O uso de uma caixa de incubação com temperatura controlada, que inclui os objectivos e platina do microscópio é útil, mas não essencial para o controlo da temperatura. A temperatura da caixa de incubação é definido como a temperatura mais alta utilizada na experiência, por exemplo, a 40 ° C se o stress térmico é realizado. Caso contrário, a temperatura é ajustada a 256; C. As mudanças de temperatura devem ser feitas com antecedência para permitir que o sistema se adapte, como mudanças de temperatura durante a imagem pode afetar o foco. Nota: Durante a gravação, a temperatura é controlada usando uma câmara de arrefecimento. A temperatura padrão para imagens células não-estressado é de 23 ° C. As condições de stress de calor, a temperatura é aumentada de acordo com o nível desejado. O elemento piezoeléctrico na câmara de refrigeração pode responder muito rapidamente à mudança de temperatura. No entanto, o foco das imagens irá alterar ligeiramente (ele pode desviar-se para até 20 uM dependendo da mudança de temperatura). Assim reorientação manual é necessária dentro dos primeiros minutos de aquisição de imagem, a menos que o microscópio utilizado está equipado com um auto-foco de hardware. <ol><li> Aquisição de imagem em condições não-estressados <ol><li> células de imagens em condições não-salientou a 23 ° C, adquirir um mínimo de 6 campos de visão (FOVs). NOTA: condição de não-estresse pode ser visualized quer através da gravação de um curto lapso de tempo (5-30 min) ou aquisição de fotografias representativas. Para cada linha de estado ou de células adquirem um mínimo de 6 campos de visão (FOVs). Nota: Em caso de células individuais são de interesse, a posição das respectivas células no meio do FOV e gravar uma série ladrilho 3 x 3 com o FOV que contém as células de interesse no meio D.. células discoideum são móveis e podem migrar para fora do FOV. No entanto, a série telha 3 x 3 aumenta a área potencialmente explorado pela célula de interesse e continua a ser rastreáveis ​​por períodos de lapso de tempo de ~ 6 horas. </li><li> Adquirir z pilhas de máximo de 7 um em 1-0.25 uM passos para capturar todo o volume da célula. </li><li> Adquirir uma imagem de referência brilhante campo para avaliar o número total de células. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem para o stress de calor <ol><li> Ajustar a temperatura da câmara de arrefecimento para 30 ° C de acordo com as instruções do fabricante. &lt;/ Li&gt; <li> Após a indicação de temperatura atingiu o valor desejado, reorientar manualmente no canal de campo claro e verificar todos os FOVs gravadas antes de iniciar o lapso de tempo. </li><li> Iniciar um lapso de tempo de 4 horas de estresse de calor com um intervalo de tempo de 5-10 min entre momentos de tempo. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição dos dois primeiros pontos de tempo. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem durante a recuperação <ol><li> Depois de estresse por calor, reduzir a temperatura volta a 23 ° C, espere o indicador de temperatura para ajustar e reorientar manualmente. </li><li> Gravar filmes de lapso de tempo na fase de recuperação para 8-10 h em intervalos de tempo mínimo de 10-20. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição do primeiro ponto de tempo. </li></ol></li></ol> Análise 3. Imagem NOTA: Para a quantificação do número de células contendo focos citosólica, avaliar o número total de células e o número de células com focos citosólico em cada momentoquadro. Devido à dificuldade de segmentar células a partir de imagens de campo claro, a quantificação precisa de ser feito manualmente. A seguir, a análise dos dados é descrito para o pacote de processamento de imagem free ((http://fiji.sc/Fiji). Ele requer o plug-in &quot;Cell Contra&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Avaliando número total de células <ol><li> Carregar o brilhante pilha de campo (XYT), clicando em &quot;Arquivo&quot; e &quot;Open&quot;. </li><li> Abra a &quot;célula Contador&quot; plug-in ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Contra&quot;). Carregar a pilha de imagens, clicando em &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Escolha o tipo apropriado de contadores, assinalando a caixa apropriada. NOTA: O uso do tipo 1 como contador para o número total de células e tipo 2 como contador para células com focos citosólica. Contagem de todas as células. </li><li> Salvar os marcadores clicando em &quot;Salvar marcadores&quot;. </li></ol></li><li> A avaliação do número de células com focos citosólica <ol> &lt;li&gt; Coloque o hyperstack imagem de fluorescência (XZYT) ( &quot;File&quot; - &quot;Open&quot;) e fazer uma projeção de intensidade máxima usando o &quot;Z-Projector&quot; (Imagem / Stacks). </li><li> Abra a &quot;célula Contador&quot; plugin. Carregar a pilha imagem resultante (XYT), clicando em &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Coloque os marcadores clicando em &quot;Marcadores de carga&quot;. ATENÇÃO: Os nomes da imagem de referência ea pilha de fluorescência de arquivo deve ser idêntico. Se necessário, mudar o nome de conformidade antes de inicializar a pilha de imagem. </li><li> Escolha o tipo de marcador apropriado (ver 3.1.3) e contagem de células com focos citosólica. Os marcadores existentes podem ser utilizadas como guia para a posição das células individuais. </li><li> Recuperar o número de contagens por fatia, clicando em &quot;Resultados&quot; e salvar as contagens em outra parte para outros cálculos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para estudar o comportamento de uma proteína de interesse particular, em resposta ao stress induzido por calor. O aumento de temperatura para 30 ° C tem sido relatado para desencadear resposta de stress de calor e sob estas condições, a viabilidade de D. discoideum é marcadamente reduzida. modificações O protocolo pode ser modificado para comparar o comportamento de proteínas diferentes sob as mesmas condições de stress. Para isso, as células que expressam diferentes proteínas com a mesma etiqueta fluorescente são transferidos para placas de multi-poços, tal como quatro pratos de câmara (secção 1.3.1). O protocolo também pode ser aplicada em células de proteínas com diferentes marcadores, tais como GFP ou RFP que co-expressam. Isto pode ser por exemplo utilizado para monitorar o comportamento de diferentes componentes do sistema de controlo de qualidade de proteínas (PQC). As células que expressam marcador agregação GFP-marcadas e diferentes componentes PCQ marcado-RFP pode ser observado usando multi-bemcôncavo para a imagem latente. Isso garante as mesmas condições de estresse (velocidade de aumento da temperatura / diminuição, a duração da temperatura aumento / diminuição) e permite a realização de estudos comparativos. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para estudar a influência do sistema de PQC na resposta ao stress de calor. A actividade dos componentes pode ser modulada pela alteração dos níveis de expressão utilizando ferramentas genéticas, tais como knock-out ou a sobre-expressão ou utilizando inibidores específicos disponíveis comercialmente 6. O proteassoma pode ser inibida pela adição de MG132 (100 uM) ou lactacistina (10 uM) ao meio de crescimento. O acompanhante Hsp90 pode ser inibida utilizando geldanamicina (6 uM), ou do radicicol (10 uM). O acompanhante Hsp70 pode ser inibida com VER-155088, embora não pudemos confirmar a eficácia da inibição em nossas configurações experimentais até agora. Inibidores deve ser adicionado um dia antes de imagem e as células são incubadas durante 14 horas. Criti<html> Passos cal no âmbito do Protocolo O passo crítico para a avaliação da perturbação induzida pelo calor é o estado das células antes da experiência de imagem. Estudos em leveduras demonstraram que as células adquirem resistência a uma variedade de stresses ambientais durante a fase estacionária 13. Observou-se também a capacidade de resposta mínima ao estresse térmico aplicado, se D. células discoideum tinha atingido fase estacionária antes da imagem. Por conseguinte, a manutenção de um número constante de célula &lt;5 x 10 5 células / ml é crítica. Além disso, o número de células elevadas pode induzir a transição do ciclo vegetativo de D. discoideum com o ciclo de desenvolvimento, desencadeando assim as vias de fome, o que pode levar a uma resposta diferente ao estresse térmico. Se o número de células altas são alcançadas na fase de recuperação após o estresse de calor, streaming e células agregando pode interferir com a análise de dados como as células se movem fora de foco (veja a Figura 4). content &quot;&gt; limitação da técnica A perda de foco é o gargalo do protocolo. Durante a mudanças de temperatura, o plano focal pode mudar drasticamente, o que requer reorientação manual num período de tempo imediatamente após a alteração da temperatura. O salto do foco pode ser por vezes demasiado extremo a ser superado por focagem automática do software, especialmente se o tempo entre os pontos de tempo é alta. No entanto, se o microscópio utilizado está equipado com um hardware de focagem automática, esse gargalo pode ser contornado. Importância da Técnica em Matéria de métodos existentes Em comparação com configurações existentes, tais como o uso de quartos com ar condicionado, caixas de incubação de temperatura controlada, relativos aos objectivos e as etapas de palco microscópio ou com temperatura controlada e colares objetivos, o uso de uma câmara de resfriamento proporciona um controle mais preciso do ambiente temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode manter uma TEM constante e uniformeratura em toda a configuração experimental. Em configurações clássicas, diferenças de temperatura locais pode levar a resultados diferentes de observação. Além disso, ele pode responder rapidamente e rapidamente a mudanças induzidas na temperatura, enquanto instalações clássicas adaptar-se muito lentamente a mudanças de temperatura induzidas, especialmente a diminuição da temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode também cobrir uma gama mais ampla de temperatura (15-40 ° C) do que instalações clássicas, com as quais as temperaturas que alcançam, tais como 15 ° C ou 40 ° C é muito difícil. Dictyostelium discoideum é particularmente sensível a foto-toxicidade. Estudos anteriores utilizaram ascorbato como limpador para reduzir foto-toxicidade. No entanto, períodos de imagem longos exigem suplementação adicional. Além disso, o uso de ácido ascórbico está limitado a estudos em que o mecanismo de interesse não é afectado por o suplemento de antioxidante. Propomos que a imagem de temperatura controlada pode ser utilizada como uma alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidade e pode ser combinado com a adição de ácido ascórbico para diminuir ainda mais a toxicidade. efeitos fototóxicos pode ser minimizado através de uma temperatura constante e uniforme de 23 ° C utilizando uma câmara de arrefecimento. Células fotografada usando controle de temperatura mostram menos sinais de foto-toxicidade, esse arredondamento celular, por um período de tempo mais longo. Isso também permite imagens com maior intensidade, intervalos de tempo menores ou mais campos de visão (FOVs). Aplicação geral O stress térmico a temperaturas mais elevadas tem sido mostrado para desencadear uma resposta de stress de calor diferente 14. Portanto, aumentando a temperatura para 34 ° C ou 37 ° C podem induzir uma resposta diferente. Em adição ao stress de temperatura é aplicado, a duração de uma situação de stress particular pode ser modificado para estudar a resposta imediata ou adaptação a longo prazo a stress térmico. Em geral, o protocolo pode ser descritoexpandiu-se para um amplo conjunto de aplicações. Uma vez que o controle preciso da temperatura reduz consideravelmente os efeitos foto-tóxicas, o protocolo pode ser utilizado em ambientes que exigem tempos de exposição elevada e / ou intensidades de luz de excitação mais elevadas, por exemplo, para visualizar as proteínas com um nível de expressão baixo, ou em combinação com intervalos de tempo curtos entre imagem, por exemplo, durante a imagem time-lapse. Também pode ser vantajoso para imagiologia de objectos que abrangem toda a célula, por exemplo, os microtúbulos, uma vez que estas configurações necessitam de um elevado número de z-secções ópticas.

Dictyostelium discoideum são solitários amebas de vida do solo que se alimentam de bactérias e outros microorganismos, que são ocupados por fagocitose. Ele tem um ciclo de vida único e notável que tem sido uma importante área de pesquisa desde a sua descoberta 1. O interesse no início do desenvolvimento multicelular 2 e as bases moleculares da quimiotaxia 3 logo foi complementada por estudos sobre motilidade celular, polaridade celular, imunidade inata. Além disso, D. discoideum foi introduzido como um sistema modelo para 4,5 pesquisa biomédica. Recentemente, estabelecemos D. discoideum como um novo sistema para estudar a 6,7 sistema de controle de qualidade da proteína (PQC). Sua proteoma é enriquecida com proteínas prião-como agregação-prone, o que representa um desafio a proteína de controlo de qualidade 8. Para investigar se a D. discoideum desenvolveu mecanismos moleculares especiais para controlar a sua altamente agproteoma congregação propensas, estudamos o comportamento de proteínas marcadoras de agregação propensas tanto em condições normais de crescimento e durante o estresse. Condições de estresse, tais como estresse por calor, pode ser usado para aumentar a taxa de proteína misfolding 9. Portanto, buscamos um sistema em que poderia induzir mudanças de temperatura e ao mesmo tempo seguir o comportamento de proteínas marcadoras. Para este efeito, combinamos de imagem de células vivas com aquecimento controlado por Peltier usando um (câmara de refrigeração) inserção fase térmica. Este método permitiu-nos manter a temperatura constante e uniforme, bem como para induzir uma mudança rápida, ainda preciso da temperatura. Processamento de imagem de células vivas, são utilizados para estudar uma variedade de processos biológicos em D. discoideum. No entanto, esta abordagem enfrenta dois grandes limitações. Em primeiro lugar, as células apresentam uma alta mobilidade e tendem a migrar para fora do campo de visão, rastreando assim de células individuais muitas vezes requer imagiologia de uma grande área. A mobilidade celular podeser reduzida em Agar sobreposição 10, no entanto, estas condições não são adequadas para a imagem latente a longo prazo devido a um declínio na viabilidade. Em segundo lugar, D. células discoideum mostram uma sensibilidade particularmente elevada para foto-toxicidade, o que resulta no arredondamento celular e 11 de paragem da mitose. Protocolos anteriores abordou esta questão através da adição de ácido ascórbico como um limpador radical e redução da exposição vezes 12. Esta última pode ser importante se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos e mostra um sinal de fluorescência fraca. Os autores sugerem também para proporcionar uma temperatura constante de 21 ° C, quer por imagem em um quarto com ar condicionado ou utilizando caixas de incubação com temperatura controlada, que cobrem o objetivo e microscópio estágio 12. Aqui, nós descrevemos um método com um controlo melhorado da temperatura usando uma câmara de arrefecimento ajustado a 23 ° C. Durante a gravação nosso set-up aumenta significativamente a resistência à foto-toxicidade. istopermite a utilização de tempos de exposição mais elevadas e intensidades de luz de excitação mais elevados. Isto é de particular importância durante a imagem de lapso de tempo, como os intervalos de tempo precisa de ser cuidadosamente equilibrado contra o número de posições representada por imagem e o tempo de exposição utilizado. A possibilidade de aumentar o número de posições fotografada também permite que a cobertura de uma área de imagem mais largo e facilita a identificação de células individuais ao longo de um período mais longo de tempo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

O protocolo de imagem descrito pode ser usado para analisar o comportamento de proteínas prião-como agregação propensa na ameba D. discoideum durante o stress de calor. A Figura 1 mostra a distribuição de Q103 proteína poliglutamina GFP em células sob condições de crescimento normais (Figura 1A), após 2 horas de stress de calor a 30 ° C (Figura 1B) e depois de 6 horas de recuperação de stress e crescimento em condições de crescimento normal (Figura 1C). Após o aumento da temperatura de 23 ° C a 30 ° C, o marcador de Q103-GFP funde a partir de uma distribuição difusa para estruturas puntiformes. Após a liberação do stress e crescimento à temperatura normal, estas estruturas se dissolver. A redistribuição de Q103-GFP e formação de calor focos citosólico induzido pelo estresse pode ser quantificada usando análise de imagem. A Figura 2A mostra a análise da FOVs individuais usando Fiji eo plug-in &quot;Cell counter &quot;. A figura 2B mostra a quantificação da resposta ao estresse de calor. Isto mostra que o aumento focos Q103-GFP citosólico em número com a continuação estresse por calor. Durante o estresse de calor, o controle de qualidade da proteína do sistema (PQC) é sobrecarregado, assim aggregation- proteínas propensas tais como a Q103 proteína prião semelhante não pode ser mantido num estado solúvel e cada vez mais agregado em focos citosólica. as células também mostram um aspecto arredondado, como representado na Figura 1B. a redução de focos citosólica após a remoção de stress sugere que o agregado proteínas são dissolvidas. A qualidade de imagem é sensível à densidade celular inicial. A Figura 3 mostra um exemplo de células após a recuperação de stress, comparando a densidade inicial de células apropriado (Figura 3A) e a densidade celular inicial elevada (Figura 3B). Se a densidade celular inicial era demasiado elevado, as células de estrelaTed para formar correntes tal como ilustrado na Figura 3b. Este que impõe dificuldades na quantificação subsequente como as células se mudaram para fora do plano focal. O método descrito pode ser usado para monitorar mudanças induzidas pela temperatura, como descrito acima. Ele também pode ser usado para reduzir o foto-toxicidade quando imagiologia à temperatura de crescimento fisiológico. A Figura 4 mostra uma comparação de células fotografada a 23 ° C numa câmara de arrefecimento (Figura 4A) e células fotografada sem controlo de temperatura num quarto com ar condicionado, definir a 25 ° C (Figura 4B). Após a exposição constante à luz de excitação, as células arredondar para cima quando não estiver fotografada em condições de temperatura controlada. Esta mudança na forma da célula está indicando stress. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; proteínas prião-como Agregação propensas mudar a sua distribuição celular durante o estresse térmico.-GFP marcado rica em polyglutamine huntingtina exão 1 (Q103) é constitutivamente expressa em AX2-214 D. células discoideum (sinal de GFP representado na tabela de pesquisa invertida escala de cinza). (A) Em condições normais de crescimento a 23 ° C, Q103-GFP é difusamente distribuídos no citoplasma. (B) Depois de 2 horas de estresse por calor a 30 ° C, Q103-GFP se aglutina em focos citosólica (setas vermelhas). As células mostram uma mudança de forma característica e arredondar para cima. (C) Após a libertação de stress e crescimento a 23 ° C, os focos são dissolvidos citosólica. Após 6 horas, sem focos citosólica pode ser observada. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2: Quantificação de formação de focos citosólico induzido pelo calor (A) Análise de células usando o pacote de processamento de imagem livre de Fiji eo plug-in &quot;Cell Contador&quot;.. A quantidade total de células (tipo 1, azul marcadores de balcão) é determinado na imagem de campo claro. Os marcadores são carregados no GFP-canal e o número de células com focos citosólica (tipo 2, marcadores vermelhos contador) é determinada. (B) Quantificação de focos após 3 horas de estresse por calor a 30 ° C e 3 horas de recuperação de stress a 23 ° C (n = 4 campos de visão, o erro bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Efeito da densidade celular na imagiologia de lapso de tempo de longa duração (A) células fotografadas a densidades celulares iniciais &lt;10 5 culas / ml.. Depois de 3 horas de stress térmico a 30 ° C e 6 horas de recuperação de stress a 23 ° C, as células ainda permanecem no ciclo vegetativo e se dividem. Apenas poucas células sair do plano focal. (B) As células fotografada em densidades celulares iniciais&gt; 10 6 células / ml. Após 9 horas de imagens (definições como em um), as células entraram no ciclo de desenvolvimento e começou a streaming e agregação. As células nos agregados não podem ser claramente distinguidos. Uma grande parte das células sai do plano focal e não pode ser analisado. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Efeito de controlo de temperatura em efeitos fototóxicos (A) células trabalhada durante 10 min com controlo de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visão, Z-pilha (espaçamento de 0,5 uM, espessura da amostra 8 uM), lapso de tempo (total tempo 10 min, lapso 1 min), o canal de GFP (0,07 tempo de exposição mseg, 10% de intensidade de laser), o canal de RFP (0,1 mseg tempo de exposição, 10% de intensidade de laser). As células não mostram sinais de que as alterações morfológicas características associadas ao estresse fototoxicidade. (B) As células fotografada por 10 minutos, sem controle de temperatura (mesmas condições que no A). As células apresentam sinais de fototoxicidade induzida arredondamento, indicando stress. Barra de escala = 10 mm. As células foram fotografadas num sistema baseado num microscópio com uma objectiva 100x / 1.4 abertura numérica (NA). As imagens foram coletadas com uma câmera CCD de 1.024 x 1.024 pixels arquivos usando 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K visualizações.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Biologia do Desenvolvimento

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Imunologia e Infecção

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Bioquímica

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Neurociência

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Biologia

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de

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